Abstract
Le calcium est un régulateur important de nombreux processus physiologiques dans les tissus vasculaires. La plupart des fonctions endothéliales et musculaires lisses dépendent fortement des changements de calcium intracellulaire ([Ca 2+] i) et de l'oxyde nitrique (NO). Afin de comprendre comment [Ca 2+] i, NO et des molécules en aval sont traitées par un vaisseau sanguin en réponse à des vasoconstricteurs et vasodilatateurs, nous avons développé une nouvelle technique qui applique calcium-étiquetage (ou NO-étiquetage) colorants comportant deux microscopie photonique à mesurer la manipulation de calcium (ou de la production de NO) dans les vaisseaux sanguins isolés. Décrit ici est une procédure détaillée étape par étape qui montre comment isoler une aorte d'un rat, l'étiquette de calcium ou de NO dans les cellules endothéliales ou musculaires lisses, et l'image transitoires de calcium (ou la production de NO) à l'aide d'un microscope à deux photons suivante physiologique ou des stimuli pharmacologiques. Les avantages de l'utilisation de la méthode sont multiples: 1) il est possible d'simultanély mesurer les transitoires de calcium dans les cellules endothéliales et les cellules des muscles lisses en réponse à différents stimuli; 2) elle permet de cellules endotheliales de l'image et des cellules musculaires lisses dans leur milieu d'origine; 3) cette méthode est très sensible au calcium intracellulaire ou pas de changements et génère des images à haute résolution pour des mesures précises; et 4) approche décrite peut être appliquée à la mesure d'autres molécules, telles que les espèces réactives de l'oxygène. En résumé, l'application de deux microscopie biphotonique d'émission laser pour contrôler les transitoires de calcium et la production de NO dans les endothéliales et musculaires lisses des cellules d'un vaisseau sanguin isolé a fourni des données quantitatives de haute qualité et de la promotion de notre compréhension des mécanismes de régulation de la fonction vasculaire.
Introduction
Le calcium est un second messager fondamental à l'intérieur de cellules vasculaires tels que des cellules endotheliales et des muscles lisses. Il est le stimulus primaire pour la contraction vasculaire et joue un rôle majeur dans la dilatation vasculaire, y compris ses effets par le biais de la production de NO dans le endothélium. En raison des limites des technologies d'imagerie, il a été pratiquement impossible d'observer la manipulation de calcium dans le récipient intact. Le développement de deux systèmes d'imagerie photonique et la création de nouvelles calcium ou pas de colorants d'étiquetage, il est possible de l'image à une profondeur et une résolution suffisantes pour commencer à comprendre la dynamique de calcium et la production de NO dans le système vasculaire.
La microscopie à deux photons a récemment été appliquée dans les tissus, les organes et les études sur les animaux entiers, même en raison de sa capacité supérieure pour pénétrer profondément les tissus à faible fluorescence de fond et de la sensibilité du signal haute. 1,2 Le spectre étroit de deux excitation photonique au illumination point focal et l'utilisation de détecteurs non-descanned sont les raisons pour lesquelles les deux microscopie photon est supérieure à la microscopie confocale traditionnelle. La microscopie confocale ne peut pas produire des images de haute qualité à la profondeur de tissu nécessaire en raison de l'auto-fluorescence et la diffusion de la lumière hors-focus dans le sténopé confocal. Par conséquent, nous avons développé une méthode utilisant un microscope à deux photons pour mesurer [Ca 2+] i la signalisation et la production de NO dans les cellules intactes, individuels des vaisseaux sanguins avec une résolution élevée et un faible rapport signal sur bruit.
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Protocol
Les procédures expérimentales décrites ci-dessous ont été approuvés par le Comité institutionnel de protection des animaux et l'utilisation (IACUC) au Collège médical du Wisconsin et étaient en conformité avec les National Institutes of Health Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire.
1. Isolement de l'aorte Rat
- Anesthésier rats avec de l'isoflurane (5% induction, 1,5 à 2,5% maintenance) ou d'une autre méthode IACUC approuvé.
- Placez le rat dans une position couchée. Afin d'exposer les organes abdominaux, faire une petite incision médiane ventrale à travers la peau et du tissu sous-cutanée abdominale. Utilisation des tampons de gaze dévier doucement les intestins pour exposer l'aorte et la veine cave comme représenté sur la figure 1.
- En bref, l'aorte Blunt disséquer du tissu conjonctif et de la veine cave. Utilisation de suture, attacher l'aorte aussi proche que possible du rein. Disséquer environ 1 - 2 cm de l'aorte et le placer dans un 15 ml conique tuêtre contenant physiologique normale de Salt Solution (PSS; en mm: 140 NaCl, 1,2 MgCl2, 2 CaCl2, KCl 4,5, 6 glucose, 10 HEPES) sur de la glace.
- Une fois que l'aorte est isolé, l'euthanasie de l'animal selon des protocoles approuvés IACUC. À la fin de non-survie procédures euthanasier les animaux profondément anesthésiés par thoracotomie induire pneumothorax pour assurer la disparition de l'animal humain. 3
- En utilisant un microscope de dissection, pinces à pointe fine, et microciseaux dissèquent la graisse et du tissu conjonctif hors de l'aorte. Une fois l'aorte est propre, couper l'aorte longitudinalement et le placer dans PSS sur la glace pour plus tard.
2. Chargement Dye et incubation
- Pipet 7 pi de 1 mM Fluo-quatre heures colorant, qui est fourni en solution à base de DMSO, en particuliers des tubes de 500 pi qui ont été couverts d'une feuille d'aluminium. Conserver au congélateur à -20 ° C pour préserver les propriétés de colorant au fil du temps. Remarque: si ces aliquoteslutions doivent être stables pendant au moins six mois.
- Avant utilisation, permettent les solutions de colorant se réchauffer à la température ambiante avant ouverture. Préparer des solutions de travail immédiatement avant utilisation. Ne pas stocker réactif dilué pour une utilisation ultérieure.
- Ajouter 7 pi de ready-made 1 mM Fluo-quatre heures colorant dissous dans une solution de DMSO à 450 ul du PSS ne contenant pas de calcium. Ajouter 40 pi de solution non de DMSO base de 10% d'acide Pluronic au cocktail de chargement pour aider à disperser les acétoxyméthyliques (AM) esters et améliorer le chargement du colorant de calcium.
- Placez les aortes disséqués dans les tubes 500 pi contenant le cocktail de chargement (comme décrit dans le paragraphe 2.3) pendant 1 h. Couvrir tous les tubes avec du papier et le placer sur un agitateur rotatif à la température ambiante.
- Pour surveiller la production de NO dans le système vasculaire, utilisez DAF-FM diacétate colorant. Incuber l'aorte dans une solution contenant 450 ul de PSS, 40 ul d'acide Pluronic et 5 ul de 10 mM de diacétate de DAF-FM. Comme pour le protocole d'incubation de calcium (décrite au point 2.3), placer l'aortedans un tube de 500 ul contenant la solution NO-teinture couvert de feuille et le placer sur un agitateur rotatif pendant 30 min à 4 ° C puis 30 min à température ambiante prochaine.
- Lorsque la production de NO est mesurée, utilisez la NO synthase endothéliale bloqueur, L-NAME, de bloquer la production de NO comme un contrôle comme montré dans la figure 4B. Pour cette procédure, ajouter à cocktail (tel que décrit à 2,5) 100 nM L-NAME pour les 30 dernières minutes d'incubation (à température ambiante).
3. balayage laser Deux Protocole photon Microscopie
- Après l'incubation de 1 h, laver l'aorte 2 - 3 fois en propre PSS à éliminer le colorant extracellulaire.
- Transférer l'aorte dans un plat recouvert de silicone contenant soit PSS normale ou Ca 2+ tampon exempt (dépend du protocole expérimental). Pin de l'aorte vers le bas sur le revêtement de silicone avec l'adventice en contact avec la silicone (par exemple, lumière endotheliales exposées à l'ouverture de plat) à l'aide des broches en forme de μ. Sinon, utilisez un ancrage Slicegrille ou d'une colle pour fixer le tissu.
Remarque: Pour réduire le stress et artefacts mécaniques possibles, le transfert et fixer aorte Ca 2+ exempt de solution et d'attendre 5 à 10 minutes avant de commencer l'expérience. - Raccorder une pompe péristaltique ou une seringue à la plaque revêtue de silicone pour une application manuelle ou automatique de la drogue ou pour modifier la solution extracellulaire.
- Placer le plat sous le morceau de la verticale à deux photons microscope nez, et à installer et positionner un 25 × (NA 1,05 et distance de travail 2 mm) immersion dans l'eau objectif au-dessus du spécimen. Remarque: Si cet objectif spécifique ne sont pas disponibles, utilisez un objectif spécifiquement fabriqués pour deux imagerie photonique, car il peut augmenter de façon spectaculaire la résolution par rapport à un objectif régulier de signal.
- Activez le laser à deux photons en utilisant le logiciel (le laser commence à pomper et allumez). Tune l'excitation laser à 820 nm.
- Utilisation épifluorescence, localiser l'aorte et de se concentrer sur l'objectifla surface endothéliale en utilisant ajustement grossier.
- Mettez le microscope en mode de balayage laser à deux photons, veiller à ce que le laser d'excitation est mode verrouillé, les détecteurs non-descanned sont engagés et les filtres d'émission appropriées pour les spectres d'émission attendue sont installés. Remarque: Ici, l'FV10-MRL / R (495 à 540 nM) ont été utilisés.
- Lancer la numérisation en direct en utilisant environ 5% de la puissance laser et ajuster finement l'objectif afin de visualiser les cellules endothéliales.
Remarque: Les cellules endothéliales présenteront un signal fluorescent forte lorsqu'elle est incubée dans PSS normale. Ce sera nettement plus faible lorsque les vaisseaux sont incubés dans un tampon sans calcium. Les cellules endothéliales sont présents sur la partie supérieure de l'aorte ouvert et les cellules du muscle lisse peut être vu juste en dessous des cellules endotheliales (voir figure 2). Parce que les vaisseaux sanguins ne sont ni lisse ni même, il y aura des endroits où les deux cellules musculaires lisses et des cellules endothéliales sont présents. </ Li> - Une fois que les cellules sont en discussion, le programme de logiciel de microscope pour recueillir des images séquentielles en mode de balayage rapide (balayage de trame, 512 x 512 pixels de fenêtre avec une fréquence de collecte de trame de 1,1 s). En parallèle avec Fluo-quatre heures fluorescence, collecter transmis des images en lumière afin de détecter des changements dans contraction des vaisseaux et de mieux visualiser les conditions expérimentales.
- Après la collecte d'images de signaux de référence, modifier la concentration en ions Ca 2+ dans la solution externe ou lentement appliquer des agents de relance pharmacologiques utilisant la pompe péristaltique en imagerie. Observez l'augmentation de signal fluorescent dans les cellules chargées.
Remarque: Les cellules endothéliales de répondre aux changements dans la circulation, il est donc recommandé d'utiliser des applications de laminaires bas et essais de véhicules avant l'application d'activateurs pharmacologiques de Ca 2+ ou NO signalisation. Pour recalculer calcium intracellulaire à des valeurs de concentration en nM navires chargés avec du Fluo-4 (constante de dissociation de Fluo-4 is 345 nM), l'intensité de la fluorescence peut être enregistrée au début et après plus d'ionomycine et MnCl 2. 4
4. Traitement et calculs image
- Téléchargez et installez Fidji logiciel de traitement d'image.
- Ouvrez le fichier d'image dans les îles Fidji. Après l'importation du fichier, diviser les canaux (de lumière transmise et de signal fluorescent) lorsque vous êtes invité. Utilisez uniquement le signal fluorescent pour l'analyse des données.
- Dans le programme Fidji, cliquez sur l'onglet d'analyser et de faire défiler à l'option d'outils. Sous l'option d'outils, trouver l'onglet qui dit gestionnaire de ROI et cliquez dessus; une nouvelle fenêtre apparaît.
- Après cela, cliquez sur ensemble des mesures sous l'onglet analyser. Sélectionnez les mesures spécifiques d'intérêt. Pour les mesures transitoires de calcium, utilisez l'option de la valeur moyenne de gris.
- Avec l'outil de trace circulaire, commencer à tracer les régions d'intérêt (ROI) et cliquez sur "ajouter" sur l'écran du gestionnaire de ROI pour chaque ROI. Une fois que toutes les cellules d'intérêt ont été tracées, dans la fenêtre du gestionnaire de ROI, sélectionnez multi Mesure sous l'onglet «plus». Pensez à sauvegarder soit les mesures directement ou copier et coller toutes ces mesures dans un tableur.
- Ouvrir fichier * .txt ou un tableur Excel de Fidji et de transférer les numéros d'une nouvelle feuille de calcul d'origine. Remarque: Vous pouvez également utiliser un programme comme Sigma Plot ou Prism pour une analyse ultérieure.
- Dans le programme d'origine, utilisez le menu Plot → Ligne + Symbole d'observer un aperçu de toutes les réponses transitoires. Décochez les cellules ne répondent pas.
- Recalculer numéro de trace à l'échelle de temps (axe X), utiliser la colonne → Définir valeurs de colonnes et de multiplier la colonne de numéro de trace à la fréquence de collecte d'images (dans notre cas, 1,1 s).
- Utilisez Analysis → Statistiques sur les lignes pour tous les enregistrements sélectionnés pour calculer moyenne (axe Y) et trace d'erreur standard. Tracer Graphique finale pour le groupe actuel de cellules Plot → Ligne + Symbole.
- Le mean calcium calcul transitoire est décrit comme suit.
- Pour diffusion totale de calcium dans le programme d'origine, cliquez sur Graphique, puis utilisez le menu Analyse → → Intégrer Calcul. Intégrante totale de la zone sous la courbe apparaît dans Résultat Connexion.
- Pour cinétiques transitoires, cliquez sur Graphique, puis utilisez le menu: Analyse → Curve non-linéaire Fit → Choisir Data Set (choisissent axe X vont de maximale à la fin de la réponse transitoire). Lancer Fitting → Sélectionnez → Fonction exponentielle Decay 1 → Terminé.
Remarque: raccord exponentielle apparaît dans la fenêtre graphique et le résultat Connexion. Obtenu données (valeurs) représentent quantité totale de calcium libéré, et la cinétique des canaux médiés la réponse transitoire.
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Representative Results
Afin d'évaluer avec précision la contribution de calcium à la physiologie vasculaire (vasodilatation et la vasoconstriction), un protocole a été conçu pour charger colorants de calcium dans les cellules endothéliales et les cellules musculaires lisses dans isolé aorte intacte. Le dispositif expérimental général mis en place le montre la figure 1, montre la stratégie de base pour l'isolement et la préparation du navire avant l'imagerie. Brièvement, après isolement de l'aorte de rat, il doit être nettoyé de la graisse et du tissu conjonctif et fendu longitudinalement. L'aorte ouvert devrait ensuite être placé dans un tube de 500 pi de papier d'aluminium contenant le chargement cocktail préparé antérieur tel que décrit dans le protocole et incubés à température ambiante pendant 1 h avec balancement lumière. Après l'incubation, l'aorte doit être lavé, coincé sur une plaque de silicone recouvert d'adventice la plus proche de la silicone et de la lumière vers le haut, et transféré à un montant microscope à deux photons pour l'imagerie.
Once l'aorte a été placé sur le microscope et le navire est au point, les cellules endothéliales devraient être faciles à repérer par leur forte émission de fluorescence (figure 2A). Les cellules endothéliales sera également le premier objet à venir dans le foyer parce que la lumière du vaisseau, qui se compose principalement de cellules endothéliales, doit être orientée vers le haut lorsque le bateau est coincé. En plus de l'imagerie des cellules endotheliales, il y aura des endroits où les cellules musculaires lisses à l'affiche (figure 2B). Ainsi, les deux endotheliales et les cellules musculaires lisses peuvent être identifiées dans le même champ de formation d'image (figure 2C). Avoir la capacité à la fois l'image des types de cellules vasculaires dans le même champ d'imagerie peut conduire à une meilleure compréhension de la façon dont ces cellules conjointement, mais indépendamment, répondent à différents agonistes et les stimuli.
Pour démontrer l'utilité de ce procédé, les mesures de la réactivité des cellules de l'aorte à l'addition d'uncetylcholine (ACH), un vasodilatateur puissant qui provoque spécifiquement changements au sein de l'endothélium, a été déterminée. Comme le montre la figure 3A, les cellules endotheliales peuvent être facilement vus dans incubées pendant PSS normal. Après l'addition de l'ACh (figure 3B), la fluorescence des cellules endotheliales augmente ce qui indique que la teneur en calcium intracellulaire augmente également. La quantification de la fluorescence émise par les régions d'intérêt, ou des cellules endotheliales, est représenté sur la figure 3C. Après l'addition de l'acétylcholine, la teneur en calcium intracellulaires augmente rapidement puis revient lentement à la ligne de base. L'augmentation du calcium dans les cellules endothéliales en réponse à l'ACh est compatible avec les rapports précédents. 5,6
Comme pour les études de calcium, ce protocole est adapté pour la détection de la production de NO endothelial. Pour ces expériences, les cellules endotheliales aortiques ont été chargées avec DAF-FM diacétate de colorant comme représenté surLa figure 4A. Cette approche a été récemment utilisée pour démontrer qu'aucune augmentation de production d'une manière dépendante de Ca2 + en réponse à la stimulation. ACh 6 important, après le traitement avec L-NAME, un endothélial inhibiteur de NO synthase, cette réponse a été bloqué (figure 4B).
Un autre exemple représentatif de la façon dont cette technique peut être appliquée pour mesurer le calcium intracellulaire est représenté sur la vidéo 1, où on ajoute une solution contenant du calcium dans un récipient qui a été incubée dans un tampon sans calcium. Lorsque aorte sont d'abord incubées dans le tampon exempt de calcium (au début de la vidéo), les cellules endothéliales sont faiblement fluorescent indiquant de faibles niveaux de calcium dans les cellules. Cependant, après l'addition de PSS normale, les cellules répondent immédiatement en augmentant le [Ca2 +] i et de concentration d'émission de fluorescence de haute intensité. Cette expérience montre que les cellules sont vivantes etsensible aux stimuli externes. Cette expérience valide également la viabilité de cette méthode avec son rendement de données de haute qualité.
Figure 1. Aorte Isolement et expérimentale Set Up. 1) Après anesthésier les rats, faire une incision dans l'abdomen et d'isoler l'aorte du tissu conjonctif et la veine cave. 2) Après l'extraction de l'aorte, nettoyer le récipient de tissu conjonctif et la graisse et ouvrir le récipient en coupant longitudinalement. 3) Incuber le navire dans le AM colorant Fluo-4 pendant 1 heure à température ambiante avec un léger balancement. 4) Après incubation, laver l'aorte, l'épingler sur une plaque recouverte de silicone, la lumière vers le haut, et le transférer à la scène d'un montant à deux photons microscope. cliquez ici pour S'il vous plaît voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Imaging muscle lisse et les cellules endotheliales. Après le chargement du calcium suffisante de colorant, il est possible de l'image les cellules du muscle lisse et les cellules endotheliales. (A) En haut, est un exemple de Fluo 4 fluorescence des cellules endothéliales dans une aorte de rat isolée. Bottom, est une image fluorescente fusionnée avec vue lumière transmise (de même pour B et C). (B), est un exemple de Fluo 4 fluorescence de cellules musculaires lisses dans une aorte de rat isolée. (C) en raison de l'épaisseur non uniforme de l'aorte, il est aussi possible d'avoir des zones d'image où les deux muscles lisses et les cellules endothéliales sont présentes. Échelle barres sont affichées. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande dece chiffre.
Figure 3. Mesurer transitoires de calcium dans les cellules endothéliales en réponse à l'acétylcholine. (A) L'aorte a été initialement préparé et incubé dans un tampon PSS normale pour les enregistrements de référence. (B) Après l'addition d'acetylcholine (ACh), le signal fluorescent émis par les cellules endothéliales (ROI) qui indique l'amélioration des niveaux croissants de calcium dans les cellules. La barre d'échelle est affichée. (C) Les transitoires de calcium des cellules endothéliales en réponse à Ach été calculées en utilisant le logiciel d'origine. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Imaging oxyde nitrique dans les cellules endothéliales. (A) Après le chargement de l'aorte avec le diacétate colorant DAF-FM et de le placer sur la scène d'un microscope à deux photons, il est possible de l'image niveaux de NO dans les cellules endothéliales en utilisant la fluorescence émise. (B) Suite à l'incubation avec l'inhibiteur de NO endothelial synthase, la L-NAME, une diminution globale de la fluorescence à l'intérieur des régions d'intérêt, ce qui indique des niveaux réduits de NO dans les cellules. Barre d'échelle est affichée. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Vidéo 1. Exemple de cellules endothéliales réactivité aux changements de calcium Concentration. Après la préparation et incubation en Fluo-4 heures colorant, l'aorte a été lavée avec un tampon sans calcium et placé sur la platine d'un microscope à deux photons. Lorsque le récipient est placé dans le tampon sans calcium, la plupart des cellules endotheliales sont faiblement fluorescent. Après l'addition de PSS normal, les cellules endothéliales de répondre par augmentation de la concentration de calcium intracellulaire et l'émission d'un signal fluorescent solide.
Vidéo 2. Exemple de la production de NO dans les cellules endothéliales de l'aorte de rat isoltated. Après la préparation et l'incubation dans DAF-FM diacétate colorant, l'aorte a été placée sur la scène d'un microscope à deux photons. Après l'addition de Ach dans de la solution de bain, les cellules endotheliales réagissent en augmentant intracellulaire Nla production de O et émettant un signal fluorescent forte. S'il vous plaît cliquer ici pour voir cette vidéo.
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Discussion
Présentation expérimentale. Pour mieux comprendre la contribution de calcium et NON à la physiologie vasculaire, une nouvelle méthode a été développée pour mesurer [Ca 2+] i et de NO dans les cellules musculaires lisses et endothéliales des aortes intactes isolées. Ensemble, ce protocole se compose de ces étapes critiques: 1) l'isolement et la préparation mécanique (digestion enzymatique pas) du navire. Il est important de garder le tissu sain et intact autant que possible pour obtenir des enregistrements physiologiques optimales. 2) l'incubation, dans le colorant calcium étiquetage ou marquage NO-colorant avec de l'acide Pluronic est essentiel, cependant, pour d'autres types de récipients, un temps d'incubation et d'acide Pluronic différent peut être nécessaire de tester. 3) la fixation correcte de l'aorte au plat revêtu de silicone avec la grille et les repères fournira une vue stable pendant l'imagerie au microscope à deux photons. Parce que le navire se contracter et se dilater, il est important de veiller à ce que le navire est properly fixe à l'antenne pour éviter des artefacts de mouvement qui peuvent survenir. 4) Quantification des résultats. S'il vous plaît noter que l'amplitude transitoire peut pas toujours être le meilleur paramètre pour comparer les caractéristiques physiologiques des cellules. L'intégrale de l'transitoire peut montrer une meilleure différence due à totale [Ca 2+] i ou la libération de NO.
Lorsque les expériences sont réalisées correctement, il est possible de surveiller la [Ca2 +] i (ou taux de NO) change en réponse à des stimuli comme représentés sur les figures 3 et 4 et de la vidéo 1 et 2. La combinaison d'une préparation ex vivo et l'utilisation de deux imagerie photonique peut fournir une meilleure résolution du signal et des mesures précises des processus intracellulaires dans les tissus vasculaires. Ici, ces technologies ont été appliquées en combinaison avec le classique non-ratiométrique Ca 2+ et aucun indicateur (Fluo-4 AM et FM DAF-diacétate, respectivement), àmesurer les transitoires de calcium et la production de NO dans les cellules individuelles d'un ensemble aorte isolée. Nous croyons que cette technique permettra de transmettre nos connaissances sur les mécanismes de régulation [Ca 2+] i et les niveaux de NO dans les différents types de cellules vasculaires.
Modifications et dépannage. Les principes de base de la mesure de Ca 2+ signalisation simples cellules musculaires lisses avec ionophores sensibles a été initialement publiée en 1985. 7 La plupart des méthodes récentes d'imagerie Ca 2+ dans les cellules vasculaires niveaux individuels ont utilisé un microscope confocal à balayage laser et isolé ou préparations de culture. Pour les tissus dynamiques comme les vaisseaux sanguins, il est difficile de mesurer le calcium ou les niveaux de NO in vivo en utilisant des techniques à base de microscopie. 2 La limitation principale ici est que presque tous les vaisseaux sanguins sur le côté artériel de la circulation ont une limitante élastique interne qui se trouve entre l'endothélium et la couche la plus interne des cellules musculaires lisses. 8 En outre, la plupart du matériel extracellulaire entre le muscle lisse et la couche adventice est collagène. 8 élastine et de collagène sont une source majeure d'auto-fluorescence avec une grande intensité et une large gamme de longueurs d'ondes d'excitation . La fluorescence de fond forte couplée avec une augmentation de la diffusion de la lumière lors de l'imagerie confocale produit à faible résolution du signal et par conséquent, réduit la détection de la signalisation de calcium ou de la production de NO. Le facteur limitant de chargement fluorescentes sondes dans les cellules vasculaires à des concentrations suffisantes pour prendre des mesures significatives peut être résolu en utilisant un ex vivo préparation, un microscope à deux photons, et l'application d'une nouvelle classe d'ionophores, tels que Asante-Rouge, qui émet une fluorescence à longue longueurs d'onde, où il existe moins d'interférence à partir de l'auto-fluorescence des tissus conjonctifs et des fibres. Cependant, une des principales limitations de ce procédé est qu'il est difficile de combiner deux ou plusieurs colorants lors de l'imagerie. Les spectres d'excitation pour la plupart des colorants disponible pour l'imagerie par deux photons possèdent des caractéristiques de largeur, de polymodaux de distribution, ce qui rend difficile pour la mesure de deux ionophores différents simultanément. Cependant, les détecteurs à faible bruit hybrides peuvent être utilisées pour affiner les spectres d'émission détectées en supposant que les ionophores émettent de la lumière à différentes longueurs d'onde. Par exemple, dans ce mode opératoire décrit, il est impossible de mesurer à la fois la production de NO et de Ca2 + changements de concentration du fait que les spectres d'émission se chevauchent.
Les cellules endothéliales vasculaires qui sont en contact direct avec le flux sanguin sont exposés au stress de cisaillement fluide et régulent l'homéostasie vasculaire. 9 La méthode actuelle peuvent également être appliqués pour surveiller les transitoires calciques induites par l'écoulement et la production de NO dans les cellules endothéliales ex vivo. En outre, cette méthode peut être appliquée avec succès à l'étude de Ca 2+ concentrationchangements tion dans les cellules musculaires lisses des petites artères de résistance extraites du rein. Dans ce cas, les petites artères de résistance disséqués doivent être incubées à Ca 2+ solution exempt d'éviter lisse dommages aux cellules du muscle en raison de la surcharge de Ca2 +. Cette modification peut également être appliquée à l'aorte à réduire la mort cellulaire.
Perspectives. L'imagerie par fluorescence a été largement utilisé pour étudier la physiologie cellulaire in vitro; Cependant, les modèles de cellules isolées ne pas toujours récapitulent les processus physiologiques qui se produisent lorsque les cellules sont dans leur environnement natif. Cela a limité l'applicabilité de lignées cellulaires à la recherche translationnelle. 10 Comme décrit ici, l'utilisation des ex vivo des préparations nous a donné la possibilité de surveiller le comportement cellulaire dans les tissus fraîchement isolés où tous les processus physiologiques locales et l'interaction avec d'autres types de cellules se produisent encore . Avec le nombre croissant d'engin génétiquetechnologies de l'ingé- disponibles et le développement de modèles qui récapitulent les maladies humaines, ex vivo préparations seront un outil utile pour la recherche translationnelle. Pour les études décrites ici, la sensibilité au sel (SS / JrHsdMcwi) hypertensive souche de rat Dahl a été utilisé. Le rat est un modèle SS génétique consanguin d'origine naturelle de l'hypertension sensible au sel qui reprend de nombreux aspects de l'hypertension humaine progressive. Ce modèle est largement utilisé et a fourni des informations clés sur les mécanismes qui sous-tendent la sensibilité au sel et la dysfonction vasculaire. 11-13 Avec ce modèle de rat, les chercheurs ont été en mesure de tester la contribution des mécanismes clés à des maladies complexes (comme l'hypertension) en utilisant ZFNs , / technologies gène d'édition basés Cas TALENs, et CRISPR. 6,14-17 Utilisation de la procédure expérimentale décrite ici avec ces ressources gène-édition, il est maintenant possible de commencer à tester la contribution de calcium et d'autres facteurs clés au sel -sensiblel'hypertension et au dysfonctionnement vasculaire dans de nombreux modèles animaux différents.
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Disclosures
Les auteurs ont rien à révéler.
Acknowledgments
Nous remercions le Dr William Cashdollar, et le Centre Foundation Imaging Northwestern Mutual à l'Institut de recherche de sang du Wisconsin de l'aide pour les études d'imagerie. Nous remercions également le Dr Daria Ilatovskaya pour la lecture critique de ce manuscrit et de discussion utile. Cette étude a été soutenue par les National Institutes of Health des subventions HL108880 (AS) et DP2-OD008396 (à AMG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DAF-FM | Life Technologies | D-23842 | |
| Fluo-4 AM | Life Technologies | F14217 | 500 µl in DMSO |
| Pluronic F-68 solution | Sigma-Aldrich | P5556 | |
| L-NAME | Tocris | 0665 | |
| Olympus upright microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | |
| MaiTai HP DeepSee-OL | Spectra Physics | Ti:sapphire laser 690nm — 1040nm | |
| Filters | Olympus | FV10-MRL/R | 495 to 540 nm |
| 25× water-immersion objective lens | Olympus | XLPL25XWMP | N.A. 1.05 and working distance 2 mm |
| Slice Anchor grid | Warner Instrument | SHD-27LH | |
| Other basic reagents | Sigma-Aldrich |
References
- Molitoris, B. A. Using 2-photon microscopy to understand albuminuria. Trans. Am. Clin. Climatol. Assoc. 125, 343-357 (2014).
- Burford, J. L., et al. Intravital imaging of podocyte calcium in glomerular injury and disease. J. Clin. Invest. 124, 2050-2058 (2014).
- Palygin, O., et al. Real-time electrochemical detection of ATP and H(2)O(2) release in freshly isolated kidneys. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 305, F134-F141 (2013).
- Ilatovskaya, D. V., et al. Single-channel analysis and calcium imaging in the podocytes of the freshly isolated. J Vis. Exp. In Press, (2015).
- Zhu, J., et al. Role of superoxide and angiotensin II suppression in salt-induced changes in endothelial Ca2+ signaling and NO production in rat aorta. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 291, H929-H938 (2006).
- Endres, B. T., et al. Mutation of Plekha7 attenuates salt-sensitive hypertension in the rat. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 12817-12822 (2014).
- Williams, D. A., Fogarty, K. E., Tsien, R. Y., Fay, F. S. Calcium gradients in single smooth muscle cells revealed by the digital imaging microscope using Fura-2. Nature. 318, 558-561 (1985).
- Mansfield, J., et al. The elastin network: its relationship with collagen and cells in articular cartilage as visualized by multiphoton microscopy. J. Anat. 215, 682-691 (2009).
- Sathanoori, R., et al. Shear stress modulates endothelial KLF2 through activation of P2X4. Purinergic Signal. 11, 139-153 (2015).
- Hall, A. M., Molitoris, B. A. Dynamic Multiphoton Microscopy: Focusing Light on Acute Kidney Injury. Physiology. 29, 334-342 (2014).
- Campese, V. M. Salt sensitivity in hypertension. Renal and cardiovascular implications. Hypertension. 23, 531-550 (1994).
- Cowley, A. W. Genetic and nongenetic determinants of salt sensitivity and blood pressure. Am. J. Clin. Nutr. 65, 587S-593S (1997).
- Flister, M. J., et al. Identification of hypertension susceptibility loci on rat chromosome 12. Hypertension. 60, 942-948 (2012).
- Flister, M. J., et al. Identifying multiple causative genes at a single GWAS locus. Genome Res. 23, 1996-2002 (2013).
- Mattson, D. L., et al. Genetic mutation of recombination activating gene 1 in Dahl salt-sensitive rats attenuates hypertension and renal damage. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 304, R407-R414 (2013).
- Rudemiller, N., et al. CD247 modulates blood pressure by altering T-lymphocyte infiltration in the kidney. Hypertension. 63, 559-564 (2014).
- Flister, M. J., et al. CXM - a new tool for mapping breast cancer risk in the tumor microenvironment. Cancer Res. 74, 6419-6429 (2014).
