Två-foton Imaging av intracellulär Ca<sup> 2+</sup> Hantering och kväveoxidproduktion i Endothelial och glatta muskelceller av en isolerad råttaorta
Summary
Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.
Abstract
Kalcium är en mycket viktig regulator av många fysiologiska processer i kärlvävnader. De flesta endotelceller och glatta muskelceller fungerar mycket beroende på förändringar i intracellulär kalcium ([Ca2 +] i) och kväveoxid (NO). För att förstå hur [Ca2 +] i, NO och molekyler nedströms hanteras av ett blodkärl som svar på kärlsammandragande och kärlvidgande, har vi utvecklat en ny teknik som gäller kalcium märkning (eller NO-märkning) färgämnen med två foton mikroskopi för att mäta kalciumhantering (eller NO-produktion) i isolerade blodkärl. Beskrivs här är en detaljerad steg-för-steg som visar hur du isolera en aorta från en råtta, etikett kalcium eller NEJ inom endotelceller eller glatta muskelceller, och bild kalcium transienter (eller NO-produktion) med en två photon mikroskop efter fysiologisk eller farmakologiska stimuli. Fördelarna med användning av metoden är multi-faldig: 1) är det möjligt att samtidigtly mäta kalcium transienter i både endotelceller och glatta muskelceller som svar på olika stimuli; 2) det tillåter en att avbilda endotelceller och glatt muskel-celler i deras nativa miljö; 3) denna metod är mycket känslig för intracellulär kalcium eller inga förändringar och genererar högupplösta bilder för exakta mätningar; och 4) beskrivna tillvägagångssätt kan tillämpas på mätning av andra molekyler, såsom reaktiva syrespecies. Sammanfattningsvis applicering av två foton laseremissions mikroskopi övervaka kalcium transienter och NO-produktion i endotelceller och glatta muskelceller i en isolerad blodkärl har gett kvantitativa data av hög kvalitet och främja vår förståelse av de mekanismer som reglerar kärlfunktionen.
Introduction
Kalcium är en fundamental andra budbärare inom vaskulära celler såsom endotelceller och glatta muskelceller. Det är den primära stimulans för kärlsammandragning och spelar en viktig roll i kärlutvidgning, inklusive dess effekter genom NO generation inom endotel. På grund av begränsningar av avbildningstekniker, har det varit praktiskt taget omöjligt att observera kalcium hantering inom den intakta kärlet. Utvecklingen av två foton bildsystem och skapandet av nya kalcium eller ingen märkning färgämnen, gör det möjligt att bilden på ett tillräckligt djup och upplösning för att börja förstå kalcium dynamik och NO-produktion inom kärlsystemet.
Två foton mikroskopi har nyligen tillämpats i vävnads, organ och även hela djurstudier på grund av dess överlägsna förmåga att djupt penetrera vävnader med låg bakgrundsfluorescens och hög signalkänslighet. 1,2 Den smala spektrum av två-foton-excitation vid Illumination brännpunkt och användning av icke-descanned detektorer är anledningarna till två foton mikroskopi är överlägsen traditionella konfokalmikroskopi. Konfokalmikroskopi kan inte producera högkvalitativa bilder med den nödvändiga vävnadsdjupet på grund av auto-fluorescens och spridningen av out-of-fokus ljus in i konfokala hål. Därför har vi utvecklat en metod där en två photon mikroskop för att mäta [Ca2 +] i signalering och NO-produktion i intakta, enskilda blodkärlsceller med hög upplösning och en låg signal-brusförhållande.
Protocol
Representative Results
Discussion
Experimentell översikt. För att bättre förstå bidrag kalcium och NO till vaskulär fysiologi, var en ny metod som utvecklats för att mäta [Ca2 +] i och NO i glatt muskulatur och endotelceller av isolerade intakta artärer. Tillsammans detta protokoll består av dessa kritiska steg: 1) Mekanisk isolering och beredning (ej enzymatisk nedbrytning) av fartyget. Det är viktigt att hålla vävnaden frisk och intakt så mycket som möjligt för att få optimala fysiologiska inspelningar. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr William Cashdollar, och Northwestern Mutual Foundation Imaging Center vid Blood Research Institute of Wisconsin för att få hjälp med imaging studier. Vi vill också tacka Dr Daria Ilatovskaya för kritisk läsning av detta manuskript och hjälpsam diskussion. Denna studie stöddes av National Institutes of Health bidrag HL108880 (till AS) och DP2-OD008396 (till AMG).
Materials
| DAF-FM | Life Technologies | D-23842 | |
| Fluo 4 AM | Life Technologies | F14217 | 500µl in DMSO |
| Pluronic F-68 solution | Sigma-Aldrich | P5556 | |
| L-Name | Tocris | 0665 | |
| Olympus upright microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | |
| MaiTai HP DeepSee-OL | Spectra Physics | Ti:sapphire laser 690nm — 1040nm | |
| Filters | Olympus | FV10-MRL/R | 495 to 540 nm |
| 25× water-immersion objective lens | Olympus | XLPL25XWMP | N.A. 1.05 and working distance 2 mm |
| Slice Anchor grid | Warner Instrument | SHD-27LH | |
| Other basic reagents | Sigma-Aldrich |
References
- Molitoris, B. A. Using 2-photon microscopy to understand albuminuria. Trans. Am. Clin. Climatol. Assoc. 125, 343-357 (2014).
- Burford, J. L., et al. Intravital imaging of podocyte calcium in glomerular injury and disease. J. Clin. Invest. 124, 2050-2058 (2014).
- Palygin, O., et al. Real-time electrochemical detection of ATP and H(2)O(2) release in freshly isolated kidneys. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 305, F134-F141 (2013).
- Ilatovskaya, D. V., et al. Single-channel analysis and calcium imaging in the podocytes of the freshly isolated. J Vis. Exp. In Press, (2015).
- Zhu, J., et al. Role of superoxide and angiotensin II suppression in salt-induced changes in endothelial Ca2+ signaling and NO production in rat aorta. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 291, H929-H938 (2006).
- Endres, B. T., et al. Mutation of Plekha7 attenuates salt-sensitive hypertension in the rat. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 12817-12822 (2014).
- Williams, D. A., Fogarty, K. E., Tsien, R. Y., Fay, F. S. Calcium gradients in single smooth muscle cells revealed by the digital imaging microscope using Fura-2. Nature. 318, 558-561 (1985).
- Mansfield, J., et al. The elastin network: its relationship with collagen and cells in articular cartilage as visualized by multiphoton microscopy. J. Anat. 215, 682-691 (2009).
- Sathanoori, R., et al. Shear stress modulates endothelial KLF2 through activation of P2X4. Purinergic Signal. 11, 139-153 (2015).
- Hall, A. M., Molitoris, B. A. Dynamic Multiphoton Microscopy: Focusing Light on Acute Kidney Injury. Physiology. 29, 334-342 (2014).
- Campese, V. M. Salt sensitivity in hypertension. Renal and cardiovascular implications. Hypertension. 23, 531-550 (1994).
- Cowley, A. W. Genetic and nongenetic determinants of salt sensitivity and blood pressure. Am. J. Clin. Nutr. 65, 587S-593S (1997).
- Flister, M. J., et al. Identification of hypertension susceptibility loci on rat chromosome 12. Hypertension. 60, 942-948 (2012).
- Flister, M. J., et al. Identifying multiple causative genes at a single GWAS locus. Genome Res. 23, 1996-2002 (2013).
- Mattson, D. L., et al. Genetic mutation of recombination activating gene 1 in Dahl salt-sensitive rats attenuates hypertension and renal damage. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 304, R407-R414 (2013).
- Rudemiller, N., et al. CD247 modulates blood pressure by altering T-lymphocyte infiltration in the kidney. Hypertension. 63, 559-564 (2014).
- Flister, M. J., et al. CXM – a new tool for mapping breast cancer risk in the tumor microenvironment. Cancer Res. 74, 6419-6429 (2014).
