Abstract
Во-инфекции и воспаления, циркулирующих моноцитов оставить кровоток и мигрируют в ткани, где они дифференцируются в макрофаги. Макрофаги экспрессируют поверхностные Toll-подобные рецепторы (TLR,), которые распознают консервативные молекулярные модели в процессе эволюции в широком диапазоне микроорганизмов. TLRs играть центральную роль в активации макрофагов, которые, как правило, связанные с изменением экспрессии генов. Макрофаги имеют решающее значение при многих заболеваниях и появились как привлекательных объектов для терапии. В следующем протоколе мы опишем процедуру, чтобы изолировать перитонеальных макрофагов с помощью тиогликолята среду пивные. Последнее будет стимулировать миграцию моноцитов в брюшину, соответственно это повысит макрофагов выход 10-кратным. Несколько исследований было проведено с использованием костного мозга, селезенки или перитонеальные макрофаги происходит. Тем не менее, перитонеальные макрофаги было показано, что более зрелые при отрыве и более стабильны по своим функциональнымность и фенотип. Таким образом, макрофаги, выделенные из мышиного брюшную полость представить важную клеточной популяции, которые могут служить в различных иммунологических и метаболических исследований. После выделения макрофаги стимулировали различными лигандами TLR и, следовательно, экспрессии генов оценивали.
Introduction
Ретикулоэндотелиальной фагоцитарной система состоит из клеток различных тканей и органов, таких как костный мозг, кровь, печень и селезенка. Макрофаги широко распространены по всему телу, где они особенно участие в врожденного и адаптивного иммунного ответа для управления и ясные инфекции. В дополнение к их роли в защите организма, макрофаги, также играют важную роль в заживлении ран и в поддержании гомеостаза тканей 1,2. Кроме того, макрофаги важны не только для иммунной функции, но также активно участвовать в гомеостазе железа 3. В организме, примерно 80% железа присутствует в гемоглобина в эритроцитах, что при стареющей фагоцитированы макрофагов 4. Ежедневно эти макрофаги перерабатывать 25 мг эритроцитов, полученных железа и обеспечить его транспортировку в плазме 5. Кроме того, во время инфекции и воспаления, провоспалительных макрофагов секвестр сывороточного железа восстановления железа Доступностти к патогенам, как на системных и местных уровнях 6-8. Кроме того, исследования показали, что макрофаги и главным гепатоциты производят антимикробного пептида по имени гепсидин, что считается главный регулятор метаболизма железа 9, 10. Гепцидин в основном увеличился на воспалительные стимулы и частично отвечает за поглощения железа в макрофагах при хроническом воспалении 11-13. Как гепсидин выражение в макрофагах не очень хорошо понял, мы изучали возможную роль Toll-подобные рецепторы (TLR,) в этом регулировании. В первую очередь TLRs найти на макрофагах и играют центральную роль в их активации. Кроме того, ЛПС индуцированных гепсидин выражение в печени зависит от TLR4 13. Поэтому, чтобы выполнить наше исследование, мы использовали метод, основанный на выделении мышиных перитонеальных макрофагов.
Линии макрофагов клеток широко используются в макрофагов шпильких годов; тем не менее, расширенная культура может спровоцировать потерю гена и снижением иммунных функций в этих клеточных линий. Таким образом, выделение макрофагами брюшную полость имеет решающее значение.
Мышь брюшной полости представляет собой идеальное место, чтобы урожай макрофаги 13-15. Изолированные мышиные перитонеальные макрофаги удобны в течение нескольких исследований, касающихся их иммунологической функции. Тем не менее, количество макрофагов в брюшной полости недостаточно для обширных исследований и, по оценкам около 1 × 10 6 на мышь макрофаги. Таким образом, чтобы повысить выход макрофагов, стерильный вызывая агент, такой как тиогликолята вводили в брюшную полость, предшествующий урожай клеток. После инъекции тиогликолята, выход макрофагов на мышь была увеличена в 10 раз. Несмотря на увеличение урожайности, макрофагов тиогликолята среднего актов пивные как раздражитель, который вызывает воспалительную реакцию, в результате найма макрофагов, которые мау, но не нужно влиять на экспрессию генов. Следовательно, контрольная группа, состоящая из необработанными макрофагами должны быть включены в каждом эксперименте. В наших руках, гепсидин выражение, которое высоко стимулируется воспаления не был обнаружен в необработанной тиогликолята вызвало перитонеальные макрофаги. Кроме того, исследования показали, что тиогликолята Пивные новобранцев многочисленные макрофаги, но не активирует их 16. С другой стороны, тиогликолевой Пивные вызвало макрофаги показали увеличение фермента лизосом, а снижение убивает микроорганизмы проглатывании 17. Тем не менее, фагоцитарная способность не влияет, по сравнению с не-макрофагов вызвало 16.
После культивируют в чашках, в перитонеальные макрофаги становятся присоединенными, тем самым возможность их отделения от других типов клеток, выделенных из брюшной полости. Впоследствии, выделенных макрофагах заражали различными агонистами TLR,.Наконец, мРНК экстрагировали из культивированных клеток и экспрессии генов был проанализирован с использованием количественной обратной транскриптазы-полимеразной цепной реакции (QRT-PCR).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры были выполнены в соответствии с Канадским советом по принципов ухода за животными после утверждения Уходу за животными комитета Центр по исследованиям дю Клинический центр де l'Университета Монреаля (CRCHUM) по.
1. Выделение, идентификация и культура перитонеальных макрофагов
- Подготовка тиогликолята среду 3,8% пивных. Чтобы сделать это, приостановить 38 г тиогликолевой среды в 1000 мл дистиллированной воды. Принесите решение кипения для полного растворения частиц. Стерилизовать автоклавированием при 121 ° С в течение 15 мин. Храните до 3 месяцев в темноте, при комнатной температуре 18.
ПРИМЕЧАНИЕ: Откажитесь, если мутность развивается что указывает на бактериальное загрязнение. Решение может быть до одного года в темноте при хранении стерильной. - Используя 1 мл шприцы, прикрепленные к 23 г игл, вводят 1 мл 3,8% Brewer тиогликолевой среды в брюшную полость каждой муSE и ждать в течение 3 дней. Используйте новый шприц и иглу для каждой мыши.
- Обезболить мышей путем внутрибрюшинной инъекции пентобарбитала натрия (100 мг / кг) и эвтаназии мышей путем смещени шейных позвонков. Подтвердите правильное обезболивания путем проверки дыхания. Обычно быстрые дыханий показывают, что мышь не глубоко под наркозом.
- Вымойте брюшко каждой мыши с 70% этанола. Использование ножниц, выполнить боковой разрез вдоль нижней средней линии брюшины.
- Использование щипцов, потяните кожу с живота на подвергать прозрачную перитонеальный кожу. С использованием 5 мл шприцы, прикрепленные к 20 г игл, вводят 5 мл холодного DPBS в брюшную полость каждой мыши.
- Выполните легкий массаж на брюшную полость, а затем аспирации жидкости тщательно, не прокалывая любой орган. Извлеките иглу и дозировать перитонеальной жидкости в 50 мл конических центрифужных пробирках.
- Центрифуга в течение 10 мин при 400 х г в охлаждаемой центрифуге.Клетки должны оставаться холодной в течение всей процедуры. Удалите супернатант и осадок ресуспендируют клеток в RPMI среде 1640.
- С помощью гемоцитометра, рассчитывать клеток и приспособиться к плотности клеток 1 × 10 6 клеток / мл.
- Определение характеристик фенотипа отдельных клеток методом проточной цитометрии с использованием 1 × 10 6 клеток на мышь и antibodie против F4 / 80 (поверхностный антиген экспрессируется на макрофагах).
2. Сотовые Лечение
- Непосредственно после изоляции, добавить 1 × 10 6 клеток в каждую лунку. Оставьте перитонеальных макрофагов придерживаться в 6-луночных планшетах с культивированием их в течение от 1 до 2 ч при 37 ° С. Удалить неприкрепленных клеток осторожно промывки 3 раза теплой PBS.
- Впоследствии, культуры клеток в 900 мкл бессывороточной DMEM в течение 24 ч в присутствии следующих лигандов TLR: (Pam3CSK4-TLR1 / 2 (0,5 мг / мл) поли (I: С) -TLR3 (10 мг / мл) ; ЛПС-TLR4 (100 нг / мл); Флагеллин-TLR5 (100 нг / мл); FSL1-TLR6 / 2 (100 нг / мл); ssRNA40-TLR7 (1 мкг / мл); ODN1826-TLR9 (1 мкМ).
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка к каждой лиганда 10x исходного раствора. Добавить 100 мкл последнего в каждую лунку, выполняя таким образом разведение в 10 раз.
3. Выделение РНК
- Удалить все средние и лизировать клетки непосредственно в шесть-луночных планшетах в добавлением 1 мл TRIzol в каждую лунку и прохождение клеточного лизата несколько раз через пипетку. Инкубируйте гомогенизированные образцы в течение 5 до 10 минут при комнатной температуре, чтобы позволить полной диссоциации комплексов нуклеопротеидных.
- Перевести лизат в 1,5 мл RNase- и ДНКазы свободный микроцентрифужные трубки. Добавить 0,2 мл хлороформа за 1мл TRIzol. Встряхнуть трубки энергично вручную в течение 15 секунд и инкубируют их при комнатной температуре в течение 5 до 10 мин. Центрифуга при 12000 х г в течение 15 мин при 4 ° С. Соблюдайте смесь, отделяющую в нижней красной фазы (фенол-хлороформ), межфазного и бесцветной верхней водной фазы. РНК остается исключительно в водной фазе.
- TranSFER тщательно верхнюю водную фазу в чистую пробирку, не нарушая интерфазу. Осадок РНК из нее путем смешивания с 0,5 мл изопропилового спирта. Инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение 10 мин и центрифугируют при 12000 х г в течение 10 мин при 4 ° С. РНК осадки образуя белый осадок на стороне и нижней части трубы.
- Удалить супернатант. Промыть осадок РНК один раз 1 мл 75% этанола. Смешайте образцы на вортексе и центрифугируют при 7500 х г в течение 5 мин при 4 ° С. Кратко сухой РНК (воздух сухой в течение 10 мин). Растворите РНК в 0,1 мл DEPC (РНКазы воды) и инкубируют в течение 10 мин при 55 ° С.
- Количественно РНК с использованием спектрофотометра. Чтобы сделать это, разбавить образцы 100 раз в DEPC воды и читать на длинах волн 260 нм. Концентрация РНК затем будет: OD 260 х 40 нг / мкл х коэффициент разбавления.
- Выровнять концентрации РНК и синтеза кДНК в соответствии с инструкциями изготовителя с использованием ОТ-ПЦР системы для первой цепи кДНК синтеза Kit. Какв соответствии с инструкциями изготовителя, измерения уровней мРНК гена от ПЦР в реальном времени (45 циклов) в режиме реального времени система обнаружения ДНК. Нормализовать уровень экспрессии генов с геном двух домашнего хозяйства например β-актина и GAPDH.
Примечание: нормализовать концентрацию РНК 500 мкг / мл и 0,5 мкг использовать для синтеза кДНК.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Сначала характеризуется изолированные перитонеальных макрофагов с помощью проточной цитометрии. Чтобы сделать это, мы использовали (F4 / 80) антитела, которые специфически распознают маркеры только выраженные макрофагов. Эта характеристика необходима, чтобы определить процент изолированной макрофагов и отличать их среди клеток, полученных в процессе выделения. Как показано в (фиг.1), процент клеток, экспрессирующих антиген F4 / 80 последовательно найдено быть выше 95%. Далее, для изучения экспрессии генов в макрофагах, изолированные клетки обрабатывали несколькими лигандами TLR: Pam3CSK4 (TLR1 / 2), LPS (TLR4) и FSL1 (TLR6 / 2). Впоследствии уровни мРНК гепсидина (Hamp), нашего интересующего гена, были измерены с помощью RT-PCR. Как показано на рисунке (2), TLR1 / 2, TLR4 и TLR6 / 2 лиганды способны стимулировать гепсидина мРНК в мышиных макрофагах 19. Вместе, эти результаты демонстрируют полезность этого протокола к успешнымлы изолировать перитонеальных макрофагов и исследовать точно молекулярную регуляции экспрессии генов.
Рисунок 1. Характеристика клеток, выделенных из брюшной полости. Обогащение восстановленных макрофагов была подтверждена анализом проточной цитометрии с использованием F4 / 80 антитела после блокирования неспецифическое окрашивание с CD16 / CD32 антителами и последовательно установлено, что более 95%.
Рисунок 2. TLR лиганды индуцируют экспрессию гепсидина в мышиных перитонеальных макрофагах. После мышиного изоляции перитонеальных макрофагов и стимуляции TLR1 / 2, TLR4 и TLR6 / 2-лиганды, Hepcidin уровни мРНК были исследованы с помощью количественной обратной транскриптазы-полимеразной цепной реакции. Данные представлены в виде среднего значения ± SEM;й (не обнаруживается); * Р <0,05 в сравнении с контролем (Ctrl). Результаты представитель 3 аналогичных экспериментов, выполненных самостоятельно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Макрофаги имеют решающее значение для выживания и обеспечить заманчивой целью манипулировать хост для иммунологических целей. Открытие TLRs и других молекул распознавания провели макрофаги к центру иммунологической дискуссии. Макрофаги отвечают на множество стимулов, в том числе цитокинов, ассоциированных повреждений молекул молекулярных рисунок (DAMPS) 20 и молекул, ассоциированных с группами патогенов (PAMPs) 21. Эти различные ответы стимулы представляют собой курс макрофагов активации и, как правило, связаны с внезапными изменениями в выражении 22 генов.
В не-воспалительных заболеваний, большинство макрофагов находятся в стратегически важных местах в организме. Они могут быть найдены во всех тканях и, как циркулирующих моноцитов в крови. Таким образом, макрофаги присутствуют в наиболее уязвимых мест для микробной инвазии.
Иммунной защиты описывается как Inflammatory ответ на элиминации внутриклеточных возбудителей, связанных с активацией макрофагов классической. Классический активации макрофагов индуцируется микробных продуктов, таких как липополисахаридов в цитокинов Th1 среды, которые приведут к провоспалительного M1-макрофагов поляризации. Сохранение результатов воспаления к повреждению тканей и развитие противовоспалительных механизмов, необходимых для выживания хозяина. Поэтому Th2 цитокинов позволяют затем введение противовоспалительного M2-макрофагов поляризации, который ингибирует и регулирует реакцию M1, а также способствует восстановлению тканей. В методике, описанной в этой статье, тиогликолята инъекции в брюшную полость стимулирует классический воспалительный каскад и приводит к набору М1 макрофагов.
На сегодняшний день, несколько исследований были проведены с использованием костного мозга, селезенки или перитонеальные макрофаги происходит. Эти макрофаги представляют гетерогенныхленные группы населения с различными видами деятельности. Основываясь на их морфологии и поверхностных молекулярных характеристик, исследования установили, что перитонеальные макрофаги являются более зрелыми, чем костный мозг и селезенка получены макрофагов 23. В отличие селезенки и брюшины, полученных макрофагов, костного мозга, полученные макрофаги представляют замечательной способностью в pahgocytosis и пролиферации и может быть полностью отличается от клеток-предшественников макрофагов 20,24,25. Кроме того, изоляция макрофагов костного мозга представляет однородную выход с длительным сроком службы. С другой стороны, эти макрофаги не полностью охарактеризованы, и их использование в экспериментальных исследований представлены осложнений из-за непостоянства их фенотипа и функции 26. В отличие от костного мозга, полученных макрофагов, селезенки и брюшины макрофагов, кажется, более функционально и фенотипически стабильным 23.
Следовательно, изоляция перитонеальных макрофагов Сслужить различные иммунологические исследования и анализ экспрессии генов. Кроме того, мышь брюшной полости дает идеальную площадку для макрофагов сбор резидентов 27. Тем не менее, вызвало ряд умеренный и оценивается примерно в 1 х 10 6 макрофагов на мышь. Таким образом, чтобы увеличить урожай макрофагов, вызывая агентов, таких как тиогликолята вводили в брюшную полость за 3 дня до выделения клеток 28. Этот агент будет вызывать воспалительную реакцию и, соответственно, увеличить макрофагов урожай.
Это необходимо для выполнения нежный массаж на брюшную полость до снятия медленно перитонеальной жидкости, не прокалывая любой орган. Вытащив максимальный возможный объем требуется собрать наибольшее количество клеток. В случае загрязнения крови, буфера для лизиса может быть использован в конце процедуры отбросить эритроциты. В то индуцированные макрофаги могут быть охарактеризованы с помощью проточной cytometr у использованием антител против антигенов, которые уникальны для макрофагов как F4 / 80.
На протяжении всей процедуры, убедитесь, что все реагенты эндотоксина и все животные были постоянно размещены под конкретного патогена условиях. Выполнение этой процедуры в свободных от патогенов условиях очень важно, потому макрофагов стимуляции до предстоящих экспериментов существенно изменить результаты анализа.
После выделения перитонеальные макрофаги могут быть использованы в ряде исследований, в том числе производства воспалительных цитокинов, фагоцитоз, клеточной сигнализации, экспрессии генов, хемотаксиса и токсикологии 29. Например, после стимуляции с различными лигандами TLR, мы исследовали в вызываемых макрофагов молекулярную регулирование ключевого регулятора метаболизма железа имени гепсидина. 24 ч после обработки клеток, общая РНК выделяли с реагентом TRIzol и экспрессии генов были проанализированы с использованием QRT-PCR.
_content "> Как изучают TLRs активацию и экспрессию генов, использование бессывороточной DMEM рекомендуется. бессывороточной среде уменьшает степень загрязнений и устранить любой потенциальный источник инфекционных агентов.Хотя и для выделения РНК кажется простой процесс, РНКазы и загрязнение ДНК следует избегать, чтобы предотвратить деградацию РНК и достижения точных результатов Qrt-ПЦР. Лучший способ, чтобы обнаружить загрязнение ДНК будет включать "минус-RT 'управления для каждого образца РНК в эксперименте RT-PCR. Если продукт ПЦР генерируется из образца РНК, которые не подвергали обратной транскрипции, затем продукт был амплифицирован из примесной ДНК. В случае загрязнения ДНК, использование лечения ДНКазы возможно. Тем не менее, ДНКазы должны быть полностью инактивирован до RT-PCR, так что это не ухудшает вновь синтезированной ДНК.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантом от естественных наук и инженерного исследовательский совет Канады (NSERC, не дают никаких 298515-2011). Л. является получателем к.т.н. Стипендия от естественных наук и инженерного исследовательский совет Канады (NSERC), и MS была поддержана грантом от от Канадского института исследований в области здравоохранения (CIHR, грант №. MOP123246).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | Charles River Laboratories, Inc. (Wilmington, MA, USA) | 475 | |
| Thioglycollate | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | 19032-500G | |
| 70% ethanol | |||
| 10% sodium pentobarbital (Used for mice anesthesia (80 mg/kg, i.p.)) | |||
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS), placed on ice and will serve to harvest macrophages | WISENT INC Canada (QC) | 311-425-CL | |
| RPMI medium 1640 (Supplement with penicillin, streptomycin, L-glutamine, and 10 % fetal calf serum). | WISENT INC Canada (QC) | 350-000-CL | |
| 1 and 5 ml syringes | BD USA (NJ) | 309659 | |
| 6-well plates | Corning Incorporated (NY, USA) | MCT-150-C | |
| Bacterial lipoprotein Pam3CSK4 (0.5 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-pm25 | |
| Polyionosine–polycytidylic acid (Poly(I:C)) (10 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-PIC | |
| LPS from Escherichia coli 055:B5 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | L2880 | |
| Purified flagellin from Salmonella typhimurium (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FLIC-10 | |
| Lipoprotein synthetic FSL1 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FSL | |
| ssRNA derived from the HIV-1 long terminal repeat ssRNA40 (1 μg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-LRNA-40 | |
| Type B CpG oligonucleotide ODN1826 (1 μM) | InvivoGen (San Diego, USA) | 11B16-MM | |
| TRIzol | Invitrogen, (Burlington, ON, Canada) | 15596-026 | |
| 20 G and 23 G needles | BD USA (NJ) | 305175 | |
| Scissor | |||
| Forceps | |||
| 50 ml conical tubes placed on ice | Sarstedt (Newton, MA, USA) | 62.547.205 | |
| Red Blood Cells Lysis Buffer | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | R7757-100ML | |
| Refrigerated centrifuge | |||
| Hemocytometer | |||
| F4/80 antibody | BIO-RAD ( CA, USA) | MCA497APC | |
| CD16/CD32 antibodies | Pharmingen, {Mississauga, ON, CA) | 553141 | |
| Flow cytometer | Coulter Epics Elite counter, Coulter, (Hialeah, FL,USA) | ||
| 1.5 ml Eppendorf tubes | Axygen Scietific (CA,USA) | 3516 | |
| Chloroform | Fisher Scientific (ON, Canada) | UN1888 | |
| Isopropyl alcohol | JT Baker (PA, USA) | 70566 | |
| 75% ethanol (in DEPC treated water) | Commercial Alchohols (QC, Canada) | 17394 | |
| 0.01% diethyl pyrocarbonate (DEPC) treated water (let stand overnight and autoclave) | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | 216.542.8 | |
| Omniscript RT-PCR system | Qiagen, (Mississauga, ON, Canada) | 205113 | |
| Rotor Gene 3000 | Montreal Biotech, (Kirkland, QC, Canada) | ||
| QuantiTect SYBR Green I PCR kits | Qiagen, (Mississauga, ON, Canada) | 204141 |
References
- Pollard, J. W. Trophic macrophages in development and disease. Nat Rev Immunol. 9 (4), 259-270 (2009).
- Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat Rev Immunol. 3 (1), 23-35 (2003).
- Koury, M. J., Ponka, P. New insights into erythropoiesis: the roles of folate, vitamin B12, and iron. Annu Rev Nutr. 24, 105-131 (2004).
- Sheftel, A. D., Kim, S. F., Ponka, P. Non-heme induction of heme oxygenase-1 does not alter cellular iron metabolism. J Biol Chem. 282 (14), 10480-10486 (2007).
- Hershko, C. Storage iron regulation. Prog Hematol. 10, 105-148 (1977).
- Collins, H. L. Withholding iron as a cellular defence mechanism--friend or foe. Eur J Immunol. 38 (7), 1803-1806 (2008).
- Noyes, W. D., Bothwell, T. H., Finch, C. A. The role of the reticulo-endothelial cell in iron metabolism. Br J Haematol. 6, 43-55 (1960).
- Layoun, A., Huang, H., Calve, A., Santos, M. M. Toll-like receptor signal adaptor protein MyD88 is required for sustained endotoxin-induced acute hypoferremic response in mice. Am J Pathol. 180 (6), 2340-2350 (2012).
- Zumerle, S., et al. Targeted disruption of hepcidin in the liver recapitulates the hemochromatotic phenotype. Blood. 123 (23), 3646-3650 (2014).
- Nguyen, N. B., Callaghan, K. D., Ghio, A. J., Haile, D. J., Yang, F. Hepcidin expression and iron transport in alveolar macrophages. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 291 (3), L417-L425 (2006).
- Nemeth, E., et al. Hepcidin, a putative mediator of anemia of inflammation, is a type II acute-phase protein. Blood. 101 (7), 2461-2463 (2003).
- Nemeth, E., et al. Hepcidin regulates cellular iron efflux by binding to ferroportin and inducing its internalization. Science. 306 (5704), 2090-2093 (2004).
- Constante, M., et al. Distinct requirements for Hfe in basal and induced hepcidin levels in iron overload and inflammation. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 291 (2), G229-G237 (2006).
- Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. Chapter 14 (Unit 14 11), (2008).
- Ray, A., Dittel, B. N. Isolation of mouse peritoneal cavity cells. J Vis Exp. (35), (2010).
- Leijh, P. C., van Zwet, T. L., ter Kuile, M. N., van Furth, R. Effect of thioglycolate on phagocytic and microbicidal activities of peritoneal macrophages. Infect Immun. 46 (2), 448-452 (1984).
- Dy, M., Debray-Sachs, M., Kamoun, P., Hamburger, J. Effect of thioglycollate on macrophage lysosomal enzymes. Biomedicine. 29 (5), 167-170 (1978).
- Li, Y. M., Baviello, G., Vlassara, H., Mitsuhashi, T. Glycation products in aged thioglycollate medium enhance the elicitation of peritoneal macrophages. J Immunol Methods. 201 (2), 183-188 (1997).
- Layoun, A., Santos, M. M. Bacterial cell wall constituents induce hepcidin expression in macrophages through MyD88 signaling. Inflammation. 35 (4), 1500-1506 (2012).
- Oppenheim, J. J., Yang, D. Alarmins: chemotactic activators of immune responses. Curr Opin Immunol. 17 (4), 359-365 (2005).
- Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. Pathogen recognition and innate immunity. Cell. 124 (4), 783-801 (2006).
- Lang, R., Patel, D., Morris, J. J., Rutschman, R. L., Murray, P. J. Shaping gene expression in activated and resting primary macrophages by IL-10. J Immunol. 169 (5), 2253-2263 (2002).
- Wang, C., et al. Characterization of murine macrophages from bone marrow, spleen and peritoneum. BMC Immunol. 14 (6), (2013).
- Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture. J Cell Physiol. 77 (2), 121-134 (1971).
- Cannon, G. J., Swanson, J. A. The macrophage capacity for phagocytosis. J Cell Sci. 101 (Pt 4), 907-913 (1992).
- Wang, Y., Harris, D. C. Macrophages in renal disease. J Am Soc Nephrol. 22 (1), 21-27 (2011).
- Edwards, J. P., Zhang, X., Frauwirth, K. A., Mosser, D. M. Biochemical and functional characterization of three activated macrophage populations. J Leukoc Biol. 80 (6), 1298-1307 (2006).
- Hoover, D. L., Nacy, C. A. Macrophage activation to kill Leishmania tropica: defective intracellular killing of amastigotes by macrophages elicited with sterile inflammatory agents. J Immunol. 132 (3), 1487-1493 (1984).
- Schleicher, U., Bogdan, C. Generation culture and flow-cytometric characterization of primary mouse macrophages. Methods Mol Biol. 531, 203-224 (2009).
