Abstract
خلال العدوى والالتهابات، وحيدات تعميم مغادرة مجرى الدم وتنتقل إلى أنسجة، حيث تفرق في الضامة. الضامة تعبر عن سطح مستقبلات تول مثل (TLRs)، والتي تعترف أنماط الجزيئية الحفظ من خلال التطور في مجموعة واسعة من الكائنات الحية الدقيقة. TLRs تلعب دورا محوريا في تنشيط البلاعم التي عادة ما يرتبط التعبير الجيني التغيير. الضامة حاسمة في كثير من الأمراض، وقد ظهرت كما أهدافا جذابة للعلاج. في بروتوكول التالية، وصفنا إجراء لعزل الضامة البريتوني في الفئران باستخدام المتوسطة thioglycollate بيرة. وهذا الأخير سوف تعزز الهجرة الوحيدات في الصفاق، وفقا لهذا سيرفع العائد بلعم بنسبة 10 أضعاف. وقد أجريت العديد من الدراسات باستخدام نخاع العظم والطحال أو البريتوني المستمدة الضامة. ومع ذلك، فقد أظهرت الضامة البريتوني لتكون أكثر نضجا على العزلة وأكثر استقرارا في الوظيفيةإيتي والنمط الظاهري. وبالتالي، الضامة معزولة عن التجويف البريتوني الفئران تعرض السكان خلية الهام الذي يمكن أن تخدم في مختلف الدراسات المناعية والتمثيل الغذائي. مرة واحدة معزولة، وحفز الضامة مع يغاندس TLR مختلفة، وبالتالي تم تقييم التعبير الجيني.
Introduction
ويتكون النظام أكلة شبكية من الخلايا في الأنسجة والأعضاء المختلفة مثل نخاع العظام والدم والكبد والطحال. يتم توزيع الضامة على نطاق واسع في جميع أنحاء الجسم، حيث يشارك خصوصا في فطرية وقابلة للتكيف الاستجابات المناعية للسيطرة على العدوى واضحة. بالإضافة إلى دورها في الدفاع المضيف، الضامة أيضا أن تلعب دورا هاما في شفاء الجروح والحفاظ على النسيج التوازن 1،2. وعلاوة على ذلك، الضامة ليست مهمة فقط لعمل جهاز المناعة ولكن أيضا تشارك بنشاط في الحديد التوازن 3. في الجسم، ما يقرب من 80٪ من الحديد موجودة في الهيموجلوبين في كريات الدم الحمراء، والتي عندما يتم هضم هرمة الضامة 4. يوميا، هذه الضامة إعادة تدوير 25 ملغ من الحديد المشتق من كرات الدم الحمراء وتوفير وسائل النقل لفي البلازما 5. وعلاوة على ذلك، خلال العدوى والالتهابات، الضامة الموالية للالتهابات تصادر الحديد في الدم للحد من availabili الحديدتي واي لمسببات الأمراض، على الصعيدين النظامية والمحلية 6-8. كذلك، فقد أظهرت الدراسات أن الضامة وأساسا خلايا الكبد تنتج الببتيد مضادات الميكروبات اسمه hepcidin الذي يعتبر المنظم الرئيسي لاستقلاب الحديد 9، 10. يتم زيادة Hepcidin أساسا من محفزات للالتهابات ويكون مسؤولا جزئيا عن عزل الحديد في بلعم على التهاب مزمن 11-13. كما لم يتم فهم التعبير hepcidin في الضامة بشكل جيد للغاية، درسنا الدور المحتمل للمستقبلات تول مثل (TLRs) في هذه اللائحة. تم العثور على TLRs في المقام الأول على الضامة، وتلعب دورا محوريا في تفعيلها. بالإضافة إلى ذلك، LPS hepcidin الناجم عن التعبير في الكبد يعتمد على TLR4 13. لذلك، لتنفيذ دراستنا، استخدمنا طريقة تقوم على عزل الضامة البريتوني في الفئران.
وتستخدم خطوط الخلايا البلعمية على نطاق واسع في استيلاد بلعمالمنشأ. مع ذلك يمكن أن ثقافة ممتدة يثير فقدان الجينات وانخفضت وظائف المناعة في هذه خطوط الخلايا. وبالتالي، عزل الضامة من التجويف البريتوني أمر بالغ الأهمية.
يعرض التجويف البريتوني الماوس موقع مثالي لحصاد الضامة 13-15. المعزولة الضامة البريتوني الفئران هي مريحة لعدة دراسات حول وظيفتها المناعية. ومع ذلك، فإن عدد الضامة في الصفاق غير كاف لدراسات مستفيضة ويقدر حوالي 1 × 10 6 الضامة في الماوس. وهكذا، لزيادة الانتاج بلعم، تم حقن عامل انتزاع معقمة مثل thioglycollate في التجويف البريتوني التي تسبق الحصاد الخلية. بعد حقن thioglycollate، تم زيادة العائد من الضامة في الماوس بنسبة 10 أضعاف. على الرغم من الزيادة في العائد الضامة، أعمال متوسطة thioglycollate بيرة كما مصدرا للإزعاج الذي يسبب استجابة التهابية، مما أدى إلى توظيف الضامة، والتي أماهذ لكن ليس من الضروري تؤثر على التعبير الجيني. وبالتالي، يجب أن تدرج مجموعة مراقبة تتكون من الضامة غير المعالجة في كل تجربة. في أيدينا، لم يتم الكشف عن التعبير hepcidin التي يتم تحفيز كبير من قبل التهاب في thioglycollate غير المعالجة أثارت الضامة البريتوني. وعلاوة على ذلك، فقد أظهرت الدراسات أن thioglycollate بيرة تجند العديد من الضامة، ولكن لا تفجيرها 16. من جهة أخرى، أثارت thioglycollate بيرة أظهرت الضامة زيادة في انزيم الليزوزومية لكن انخفاضا في قتل الكائنات الحية الدقيقة بلعها 17. ومع ذلك، لم تتأثر القدرة أكلة بالمقارنة مع الضامة غير استخلاصها 16.
مرة واحدة مثقف في أطباق، الضامة البريتوني تصبح ملتصقة، وبالتالي السماح فصلهم عن نوع آخر من الخلايا المعزولة من التجويف البريتوني. وفي وقت لاحق، وقد تم الطعن الضامة معزولة مع منبهات TLRs مختلفة.وأخيرا، تم استخراج مرنا من الخلايا المستزرعة وتم تحليل التعبير الجيني باستخدام كمية عكس سلسلة الناسخ-تفاعل البلمرة (QRT-PCR).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا للمجلس الكندي للمبادئ التوجيهية رعاية الحيوان بعد موافقة اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان في مركز البحوث دو مركز HOSPITALIER DE L'جامعة مونتريال (CRCHUM).
1. عزل، تحديد الهوية، والثقافة الفئران البريتوني الضامة
- إعداد 3.8٪ البيرة المتوسطة thioglycollate. للقيام بذلك، تعليق 38 غرام من thioglycollate المتوسطة في 1000 مل من الماء المقطر. جلب حل لتغلي بحل المتوسطة تماما. تعقيم بواسطة التعقيم على درجة حرارة 121 مئوية لمدة 15 دقيقة. تخزين ما يصل إلى 3 أشهر في الظلام، في RT 18.
ملاحظة: تجاهل إذا تعكر يتطور وهو ما يشير إلى وجود تلوث جرثومي. يمكن أن تظل الحل لسنة واحدة في الظلام إذا ما واصلت عقيمة. - باستخدام 1 مل الحقن المرفقة إلى 23 الإبر G، حقن 1 مل من 3.8٪ بروير thioglycollate المتوسطة في التجويف البريتوني كل مذكرة التفاهمحد ذاتها، والانتظار لمدة 3 أيام. استخدام حقنة جديدة وإبرة لكل الماوس.
- تخدير الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق من بنتوباربيتال الصوديوم (100 ملغ / كلغ) والموت ببطء الفئران عن طريق التفكك عنق الرحم. تأكيد التخدير المناسبة عن طريق التحقق من معدل التنفس. عادة التنفس السريع تشير إلى أن الماوس لا إفقاد إحساس عميق.
- يغسل البطن من كل الفأر مع الايثانول 70٪. باستخدام مقص، وإجراء شق الوحشي على طول خط الوسط السفلي من الغشاء البريتوني.
- باستخدام ملقط، والتراجع جلد البطن لفضح الجلد البريتوني شفافة. باستخدام 5 مل الحقن تعلق على 20 الإبر G، حقن 5 مل من DPBS الباردة في التجويف البريتوني من كل فأر.
- إجراء تدليك لطيف على التجويف البريتوني ثم نضح السوائل بعناية دون ثقب أي جهاز. إزالة الإبرة والاستغناء السائل البريتوني إلى 50 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية.
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 400 x ج في أجهزة الطرد المركزي المبردة.الخلايا يجب أن تبقى باردة أثناء الإجراء بأكمله. تجاهل طاف و resuspend الخلية بيليه في RPMI المتوسطة 1640.
- باستخدام عدادة الكريات، عد الخلايا وضبط لكثافة الخلايا إلى 1 × 10 6 خلية / مل.
- تميز النمط الظاهري للخلايا منعزلة عن طريق التدفق الخلوي باستخدام 1 × 10 6 خلايا في الماوس وantibodie ضد F4 / 80 (أ المستضد السطحي أعرب عن الضامة).
2. العلاج بالخلايا
- مباشرة بعد العزلة، إضافة 1 × 10 6 خلايا في كل بئر. ترك الضامة البريتوني الفئران على الانضمام إلى 6 لوحات جيدا من قبل زراعة لهم ل1-2 ساعة عند 37 ° C. إزالة الخلايا غير ملتصقة عن طريق غسل بلطف 3 مرات مع PBS الدافئ.
- وفي وقت لاحق، والخلايا الثقافة في 900 ميكرولتر المصل خالية DMEM لمدة 24 ساعة في وجود بروابط TLR التالية: (Pam3CSK4-TLR1 / 2 (0.5 ملغ / مل)؛ بولي (I: C) -TLR3 (10 ملغ / مل) ؛ LPS-TLR4 (100 نانوغرام / مل)؛ فلاجيلين-TLR5 (100 نانوغرام / مل)؛ FSL1-TLR6 / 2 (100 نانوغرام / مل)؛ ssRNA40-TLR7 (1 ميكروغرام / مل)؛ ODN1826-TLR9 (1 ميكرومتر).
ملاحظة: إعداد لكل يجند حل 10X الأسهم. إضافة 100 ميكرولتر من هذه الأخيرة إلى كل بئر، وبالتالي إجراء التخفيف 10 أضعاف.
3. عزل الحمض النووي الريبي
- إزالة جميع الخلايا المتوسطة وليز مباشرة في لوحات ستة جيدا عن طريق إضافة 1 مل TRIzol إلى كل بئر واجتياز المحللة الخلية عدة مرات من خلال ماصة. احتضان عينات متجانسة لمدة 5 إلى 10 دقيقة في RT، للسماح التفكك الكامل للمجمعات البروتين النووي.
- نقل المحللة إلى 1.5 مل RNase- وأنابيب microcentrifuge خالية من الدناز. إضافة 0.2 مل كلوروفورم في 1ML TRIzol. هزة بقوة أنابيب باليد لمدة 15 ثانية، واحتضان لهم في RT لمدة 5 إلى 10 دقيقة. الطرد المركزي في 12000 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية. مراقبة الخليط يفصل في أقل المرحلة الحمراء (الفينول كلوروفورم)، والبيني والمرحلة المائية العليا عديم اللون. RNA يبقى حصرا في المرحلة المائية.
- ترانSFER بعناية المرحلة المائية العليا لأنبوب جديد دون إزعاج البيني. ترسيب الحمض النووي الريبي من ذلك عن طريق خلط مع 0.5 مل من الكحول الآيزوبروبيل. احتضان العينات في RT لمدة 10 دقيقة، وأجهزة الطرد المركزي في 12000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. الحمض النووي الريبي رواسب تشكيل بيليه الأبيض على الجانب السفلي من الأنبوب.
- إزالة طاف. غسل RNA بيليه مرة واحدة مع 1 مل من الايثانول 75٪. مزج العينات من قبل vortexing وأجهزة الطرد المركزي في 7500 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. لفترة وجيزة تجفيف RNA (الهواء الجاف لمدة 10 دقيقة). حل RNA في 0.1 مل DEPC (ريبونوكلياز المياه مجانا)، واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة 55 مئوية.
- تحديد RNA باستخدام مقياس الطيف الضوئي. للقيام بذلك، وتمييع عينات 100 مرة في المياه DEPC وقراءة في موجات من 260 نانومتر. فإن تركيز الحمض النووي الريبي ثم يكون: OD 260 × 40 نانوغرام / UL س عامل التخفيف.
- التعادل تركيزات RNA وتوليف [كدنا حسب تعليمات الشركة المصنعة باستخدام نظام RT-PCR لالإسعافات ستراند التجميعي [كدنا]. كمافي تعليمات الشركة الصانعة، وقياس مستويات مرنا الجينات التي في الوقت الحقيقي PCR (45 دورات) في نظام الكشف عن الحمض النووي في الوقت الحقيقي. تطبيع مستويات التعبير الجيني مع اثنين من الجينات التدبير المنزلي على سبيل المثال β-الأكتين وGAPDH.
ملاحظة: تطبيع تركيز الحمض النووي الريبي إلى 500 ميكروغرام / مل واستخدام 0.5 ميكروغرام لتخليق [كدنا].
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نحن يتميز أولا الضامة البريتوني في الفئران المعزولة التي التدفق الخلوي. للقيام بذلك، استخدمنا (F4 / 80) الأجسام المضادة التي تعترف تحديدا علامات أعرب إلا عن طريق الضامة. مطلوب هذا التوصيف لتحديد النسبة المئوية للبلعم معزولة والتمييز بينها وبين الخلايا التي تم الحصول عليها خلال عملية العزل. كما هو موضح في (الشكل 1)، والنسبة المئوية للخلايا معربا عن مستضد تم العثور على F4 / 80 على الدوام أن تكون فوق 95٪. المقبل، لدراسة التعبير الجيني في الضامة، وعولج الخلايا المعزولة مع عدة بروابط TLR: Pam3CSK4 (TLR1 / 2)، LPS (TLR4) وFSL1 (TLR6 / 2). وفي وقت لاحق، تم قياس مستويات مرنا من Hepcidin (HAMP)، لدينا الجينات في المصالح، من خلال RT-PCR. كما هو موضح في (الشكل 2)، TLR1 / 2، وكانت TLR4 وTLR6 / 2 بروابط قادرة على تحفيز hepcidin مرنا في الضامة الفئران 19. معا، وهذه النتائج تظهر فائدة هذا البروتوكول إلى النجاحلاي عزل الضامة البريتوني في الفئران والتحقيق بدقة التنظيم الجزيئي في التعبير الجيني.
وأكد الشكل 1. توصيف الخلايا المعزولة من التجويف البريتوني. إثراء الضامة استردادها عن طريق تحليل تدفق cytometric باستخدام الأجسام المضادة F4 / 80 بعد عرقلة تلطيخ غير محددة مع CD16 الأجسام المضادة / CD32 وعثر على الدوام أن تكون فوق 95٪.
الشكل 2. TLR بروابط لحث hepcidin التعبير في الضامة البريتوني في الفئران بعد الفئران البريتوني الضامة العزلة والتحفيز مع TLR1 / 2، TLR4 وTLR6 / 2 بروابط، درست hepcidin مستويات مرنا من قبل الكمي عكس الناسخ، البلمرة سلسلة من ردود الفعل. يتم عرض البيانات كما يعني ± SEM.الثاني (لا يمكن كشفها)؛ * P <0.05 مقابل التحكم (السيطرة). النتائج هي ممثل من 3 تجارب مماثلة يؤديها بشكل مستقل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الضامة هي الحاسمة من أجل البقاء وتوفر هدفا مغريا للتلاعب المضيف لتحقيق أهداف المناعية. وقد أجرى اكتشاف TLRs والجزيئات الأخرى الاعتراف الضامة لمحور النقاش المناعية. الضامة تستجيب لمجموعة متنوعة من المحفزات، بما في ذلك السيتوكينات، الجزيئات المرتبطة الضرر الجزيئية نمط (DAMPs) 20 والجزيئات المرتبطة بجماعات من مسببات الأمراض (PAMPs) 21. هذه الردود محفزات مختلفة تمثل مسار تفعيل الضامة، وترتبط عادة مع بعض التعديلات المفاجئة في التعبير الجيني 22.
في ظروف غير التهابية، فإن غالبية الضامة الموجودة في مواقع استراتيجية في الجسم. ويمكن العثور عليها في جميع الأنسجة وكما تعميم حيدات في الدم. لذا، الضامة موجودة في المواقع الأكثر عرضة للغزو الميكروبي.
يوصف دفاع المضيف باعتباره طاستجابة nflammatory في القضاء على مسببات الأمراض داخل الخلايا المرتبطة تنشيط البلاعم الكلاسيكية. هو فعل تفعيل الكلاسيكية الضامة المنتجات الميكروبية مثل lipopolysaccharides في بيئة خلوى TH1 الأمر الذي سيؤدي إلى الموالية للالتهابات M1-الضامة الاستقطاب. استمرار النتائج الالتهاب في تلف الأنسجة وتطوير الآليات المضادة للالتهابات اللازمة لبقاء المضيف. ولذلك، السيتوكينات TH2 تسمح ثم إدخال المضادة للالتهابات M2-الضامة الاستقطاب الذي يمنع وينظم استجابة M1، وأيضا تعزز إصلاح الأنسجة. في البروتوكول وصفها في هذه الورقة، thioglycollate حقن في التجويف البريتوني يحفز سلسلة التهابات الكلاسيكية ويؤدي إلى تجنيد الضامة M1.
حتى الآن، وقد أجريت العديد من الدراسات باستخدام نخاع العظم والطحال أو البريتوني المستمدة الضامة. هذه الضامة تمثل heterogeneالسكان الأوس مع الأنشطة المختلفة. بناء على التشكل وسطح الجزيئي خصائصها، وقد أثبتت الدراسات أن الضامة البريتوني أكثر نضجا من نخاع العظم والطحال المستمدة الضامة 23. على عكس الطحال والغشاء البريتوني الضامة المشتقة، ونخاع العظام المستمدة الضامة تظهر قدرة ملحوظة في pahgocytosis والانتشار، ويمكن أن تكون متمايزة تماما من الخلايا الاصلية بلعم 20،24،25. وبالإضافة إلى ذلك، وعزل الضامة نخاع العظم تقدم عائد متجانسة مع عمر طويل. من ناحية أخرى، لا يميز تماما هذه الضامة واستخدامها في الدراسات التجريبية ويعرض المضاعفات الناجمة عن تقلب النمط الظاهري ويعمل 26. خلافا لنخاع العظم الضامة المشتقة والطحال والضامة البريتوني يبدو أن يكون أكثر وظيفيا واستقرارا ظاهريا 23.
وبالتالي، فإن العزلة من الفئران الضامة البريتوني جلخدمة الدراسات المناعية المختلفة وتحليل التعبير الجيني. بالإضافة إلى ذلك، الماوس التجويف البريتوني يتيح موقع مثالي لالضامة حصاد المقيمين 27. ومع ذلك، فإن عدد أثارت معتدل ويقدر حوالي 1 × 10 6 الضامة في الماوس. وبالتالي، من أجل زيادة حصاد الضامة، استخلاص عوامل مثل تم حقن thioglycollate في التجويف البريتوني قبل 3 أيام زنزانة انفرادية 28. وهذا عامل تحريض استجابة التهابية، وبالتالي زيادة المحصول البلاعم.
فقد أصبح من الضروري إجراء تدليك لطيف على التجويف البريتوني قبل أن تنسحب ببطء السائل البريتوني دون ثقب أي جهاز. سحب حجم اقصى حد ممكن هو مطلوب لجمع أكبر عدد الخلايا. في حالة تلوث الدم، ويمكن استخدامها لتحلل العازلة في نهاية الإجراء إلى تجاهل خلايا الدم الحمراء. ويمكن بعد ذلك أن تتسم الضامة التي تسببها cytometr تدفق ذ باستخدام الأجسام المضادة ضد المستضدات التي تنفرد بها الضامة كما F4 / 80.
في جميع أنحاء الداخلي، تأكد من أن جميع الكواشف هي خالية من الذيفان الداخلي، ويوجد جميع الحيوانات بشكل دائم في ظل ظروف خالية من مسببات الأمراض المحددة. تنفيذ هذا الإجراء في ظل ظروف خالية من مسببات المرض أمر بالغ الأهمية لتحفيز بلعم قبل التجارب وشيكة سوف يغير كثيرا من تحليل النتائج.
معزولة مرة واحدة، الضامة البريتوني يمكن استخدامها في العديد من الدراسات، بما في ذلك إنتاج السيتوكينات الالتهابية، البلعمة، الإشارات الخلوية، التعبير الجيني، الكيميائي والسموم 29. على سبيل المثال، بعد التحفيز مع يغاندس TLR مختلفة، ونحن التحقيق في الضامة أثار تنظيم الجزيئي للالمنظم الرئيسي لاستقلاب الحديد اسمه hepcidin. 24 ساعة بعد العلاج بالخلايا، تم عزل الحمض النووي الريبي مجموع مع TRIzol الكاشف، وتحليل التعبير الجيني باستخدام QRT-PCR.
_content "> ونحن ندرس تفعيل TLRs والتعبير الجيني، فمن المستحسن استخدام DMEM مجانا المصل. مصل المتوسطة مجانا يقلل من درجة من الملوثات، والقضاء على أي مصدر محتمل للعوامل المعدية.وإن كان RNA العزلة يبدو عملية بسيطة، ريبونوكلياز وتلوث DNA يجب تجنبها لمنع تدهور RNA وتحقيق نتائج QRT-PCR دقيقة. أفضل طريقة للكشف عن التلوث الحمض النووي هو لتشمل "RT-ناقص" التحكم لكل عينة الحمض النووي الريبي في تجربة RT-PCR. إذا تم إنشاء منتج PCR من عينة الحمض النووي الريبي التي لم يتم عكس كتب ثم تم تضخيم المنتج من تلويث DNA. في حالة تلوث DNA، واستخدام العلاج الدناز ممكن. ومع ذلك، الدناز يجب المعطل تماما قبل RT-PCR بحيث لا تتحلل DNA تصنيعه حديثا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من خلال منحة من العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا (NSERC، منح أي 298515-2011). AL وهو حاصل على درجة الدكتوراه وأيد منحة دراسية من العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا (NSERC)، وMS من منحة مقدمة من المعاهد الكندية لأبحاث الصحة (CIHR، منح رقم MOP123246).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | Charles River Laboratories, Inc. (Wilmington, MA, USA) | 475 | |
| Thioglycollate | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | 19032-500G | |
| 70% ethanol | |||
| 10% sodium pentobarbital (Used for mice anesthesia (80 mg/kg, i.p.)) | |||
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS), placed on ice and will serve to harvest macrophages | WISENT INC Canada (QC) | 311-425-CL | |
| RPMI medium 1640 (Supplement with penicillin, streptomycin, L-glutamine, and 10 % fetal calf serum). | WISENT INC Canada (QC) | 350-000-CL | |
| 1 and 5 ml syringes | BD USA (NJ) | 309659 | |
| 6-well plates | Corning Incorporated (NY, USA) | MCT-150-C | |
| Bacterial lipoprotein Pam3CSK4 (0.5 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-pm25 | |
| Polyionosine–polycytidylic acid (Poly(I:C)) (10 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-PIC | |
| LPS from Escherichia coli 055:B5 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | L2880 | |
| Purified flagellin from Salmonella typhimurium (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FLIC-10 | |
| Lipoprotein synthetic FSL1 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FSL | |
| ssRNA derived from the HIV-1 long terminal repeat ssRNA40 (1 μg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-LRNA-40 | |
| Type B CpG oligonucleotide ODN1826 (1 μM) | InvivoGen (San Diego, USA) | 11B16-MM | |
| TRIzol | Invitrogen, (Burlington, ON, Canada) | 15596-026 | |
| 20 G and 23 G needles | BD USA (NJ) | 305175 | |
| Scissor | |||
| Forceps | |||
| 50 ml conical tubes placed on ice | Sarstedt (Newton, MA, USA) | 62.547.205 | |
| Red Blood Cells Lysis Buffer | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | R7757-100ML | |
| Refrigerated centrifuge | |||
| Hemocytometer | |||
| F4/80 antibody | BIO-RAD ( CA, USA) | MCA497APC | |
| CD16/CD32 antibodies | Pharmingen, {Mississauga, ON, CA) | 553141 | |
| Flow cytometer | Coulter Epics Elite counter, Coulter, (Hialeah, FL,USA) | ||
| 1.5 ml Eppendorf tubes | Axygen Scietific (CA,USA) | 3516 | |
| Chloroform | Fisher Scientific (ON, Canada) | UN1888 | |
| Isopropyl alcohol | JT Baker (PA, USA) | 70566 | |
| 75% ethanol (in DEPC treated water) | Commercial Alchohols (QC, Canada) | 17394 | |
| 0.01% diethyl pyrocarbonate (DEPC) treated water (let stand overnight and autoclave) | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | 216.542.8 | |
| Omniscript RT-PCR system | Qiagen, (Mississauga, ON, Canada) | 205113 | |
| Rotor Gene 3000 | Montreal Biotech, (Kirkland, QC, Canada) | ||
| QuantiTect SYBR Green I PCR kits | Qiagen, (Mississauga, ON, Canada) | 204141 |
References
- Pollard, J. W. Trophic macrophages in development and disease. Nat Rev Immunol. 9 (4), 259-270 (2009).
- Gordon, S.
- Koury, M. J., Ponka, P. New insights into erythropoiesis: the roles of folate, vitamin B12, and iron. Annu Rev Nutr. 24, 105-131 (2004).
- Sheftel, A. D., Kim, S. F., Ponka, P. Non-heme induction of heme oxygenase-1 does not alter cellular iron metabolism. J Biol Chem. 282 (14), 10480-10486 (2007).
- Hershko, C.
- Collins, H. L. Withholding iron as a cellular defence mechanism--friend or foe. Eur J Immunol. 38 (7), 1803-1806 (2008).
- Noyes, W. D., Bothwell, T. H., Finch, C. A. The role of the reticulo-endothelial cell in iron metabolism. Br J Haematol. 6, 43-55 (1960).
- Layoun, A., Huang, H., Calve, A., Santos, M. M. Toll-like receptor signal adaptor protein MyD88 is required for sustained endotoxin-induced acute hypoferremic response in mice. Am J Pathol. 180 (6), 2340-2350 (2012).
- Zumerle, S., et al. Targeted disruption of hepcidin in the liver recapitulates the hemochromatotic phenotype. Blood. 123 (23), 3646-3650 (2014).
- Nguyen, N. B., Callaghan, K. D., Ghio, A. J., Haile, D. J., Yang, F. Hepcidin expression and iron transport in alveolar macrophages. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 291 (3), L417-L425 (2006).
- Nemeth, E., et al. Hepcidin, a putative mediator of anemia of inflammation, is a type II acute-phase protein. Blood. 101 (7), 2461-2463 (2003).
- Nemeth, E., et al. Hepcidin regulates cellular iron efflux by binding to ferroportin and inducing its internalization. Science. 306 (5704), 2090-2093 (2004).
- Constante, M., et al. Distinct requirements for Hfe in basal and induced hepcidin levels in iron overload and inflammation. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 291 (2), G229-G237 (2006).
- Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. Chapter 14 (Unit 14 11), (2008).
- Ray, A., Dittel, B. N. Isolation of mouse peritoneal cavity cells. J Vis Exp. (35), (2010).
- Leijh, P. C., van Zwet, T. L., ter Kuile, M. N., van Furth, R. Effect of thioglycolate on phagocytic and microbicidal activities of peritoneal macrophages. Infect Immun. 46 (2), 448-452 (1984).
- Dy, M., Debray-Sachs, M., Kamoun, P., Hamburger, J. Effect of thioglycollate on macrophage lysosomal enzymes. Biomedicine. 29 (5), 167-170 (1978).
- Li, Y. M., Baviello, G., Vlassara, H., Mitsuhashi, T. Glycation products in aged thioglycollate medium enhance the elicitation of peritoneal macrophages. J Immunol Methods. 201 (2), 183-188 (1997).
- Layoun, A., Santos, M. M. Bacterial cell wall constituents induce hepcidin expression in macrophages through MyD88 signaling. Inflammation. 35 (4), 1500-1506 (2012).
- Oppenheim, J. J., Yang, D. Alarmins: chemotactic activators of immune responses. Curr Opin Immunol. 17 (4), 359-365 (2005).
- Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. Pathogen recognition and innate immunity. Cell. 124 (4), 783-801 (2006).
- Lang, R., Patel, D., Morris, J. J., Rutschman, R. L., Murray, P. J. Shaping gene expression in activated and resting primary macrophages by IL-10. J Immunol. 169 (5), 2253-2263 (2002).
- Wang, C., et al. Characterization of murine macrophages from bone marrow, spleen and peritoneum. BMC Immunol. 14 (6), (2013).
- Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture. J Cell Physiol. 77 (2), 121-134 (1971).
- Cannon, G. J., Swanson, J. A. The macrophage capacity for phagocytosis. J Cell Sci. 101 (Pt 4), 907-913 (1992).
- Wang, Y., Harris, D. C.
- Edwards, J. P., Zhang, X., Frauwirth, K. A., Mosser, D. M. Biochemical and functional characterization of three activated macrophage populations. J Leukoc Biol. 80 (6), 1298-1307 (2006).
- Hoover, D. L., Nacy, C. A. Macrophage activation to kill Leishmania tropica: defective intracellular killing of amastigotes by macrophages elicited with sterile inflammatory agents. J Immunol. 132 (3), 1487-1493 (1984).
- Schleicher, U., Bogdan, C. Generation culture and flow-cytometric characterization of primary mouse macrophages. Methods Mol Biol. 531, 203-224 (2009).
