Abstract
Durante a infecção e inflamação, os monócitos circulantes na corrente sanguínea e deixar migrar para os tecidos, onde eles diferenciam-se em macrófagos. Os macrófagos expressam receptores de superfície semelhantes a Toll (TLRs) que reconhecem padrões moleculares conservadas através da evolução de uma vasta gama de microorganismos. TLRs desempenhar um papel central na activação de macrófagos, que está geralmente associada com a expressão do gene alteração. Os macrófagos são críticas em muitas doenças e surgiram como alvos atractivos para terapia. No seguinte protocolo, que descrevem um procedimento para isolar macrófagos peritoneais de murino, utilizando meio de tioglicolato de Brewer. Este último irá aumentar a migração dos monócitos para o peritoneu, por conseguinte irá aumentar este rendimento de macrófagos por 10 vezes. Vários estudos têm sido realizados utilizando medula óssea, baço ou peritoneal derivada macrófagos. No entanto, os macrófagos peritoneais foram mostrados para ser mais maduro no isolamento e são mais estáveis no seu funcionaldade e fenótipo. Assim, macrófagos isolados a partir da cavidade peritoneal de murino apresentar uma população de células importante que pode servir em diferentes estudos imunológicos e metabólicos. Uma vez isolados, os macrófagos foram estimulados com diferentes ligandos de TLR e, consequentemente, a expressão do gene foi avaliada.
Introduction
O sistema reticuloendotelial fagocítico é composto de células em vários tecidos e órgãos, tais como a medula óssea, sangue, fígado e baço. Os macrófagos são amplamente distribuídos ao redor do corpo, onde elas nomeadamente participar inata e adaptativa respostas imunes para controlar infecções e claras. Em adição ao seu papel na defesa do hospedeiro, os macrófagos desempenham também um papel importante na cicatrização de feridas e na manutenção da homeostase dos tecidos 1,2. Além disso, os macrófagos não só são importantes para a função imune, mas também participar activamente na homeostase do ferro 3. No corpo, cerca de 80% do ferro está presente na hemoglobina dentro de eritrócitos, que quando senescentes são fagocitadas por macrófagos 4. Diariamente, estes macrófagos reciclar 25 mg de ferro derivados do eritrócito e fornecer o seu transporte para o plasma 5. Além disso, durante a infecção e inflamação, os macrófagos pró-inflamatórias seqüestrar ferro sérico para reduzir availabili ferroty a patógenos, em ambos os níveis sistêmicos e locais 6-8. Assim, os estudos mostraram que os macrófagos e principalmente hepatócitos produzir um péptido antimicrobiano denominado hepcidina que é considerado o principal regulador do metabolismo do ferro 9, 10. A hepcidina é aumentado principalmente por estímulos inflamatórios e é parcialmente responsável pelo seqüestro de ferro em macrófagos em cima inflamação crônica 11-13. Como expressão da hepcidina em macrófagos não é muito bem compreendido, estudamos o possível papel dos receptores Toll-like (TLR) neste regulamento. Os TLRs são encontrados principalmente em macrófagos e desempenham um papel central na sua activação. Além disso, o LPS hepcidina expressão induzida no fígado é dependente de TLR4 13. Portanto, para executar o nosso estudo, foi utilizado um método com base no isolamento de macrófagos peritoneais murinos.
Linhas celulares de macrófagos são amplamente utilizados em parafuso prisioneiro de macrófagoss; no entanto, a cultura prolongada pode provocar perda de gene e diminuiu funções imunológicas nestas linhas celulares. Assim, o isolamento de macrófagos da cavidade peritoneal é crucial.
A cavidade peritoneal do rato apresenta um local ideal para a colheita macrófagos 13-15. Isolado macrófagos peritoneais de murino são convenientes para diversos estudos em relação à sua função imunológica. No entanto, o número de macrófagos do peritoneu é insuficiente para estudos extensivos e é estimado em cerca de 1 x 10 6 macrófagos por rato. Assim, para aumentar a produção de macrófagos, provocando um agente de estéril tal como tioglicolato foi injectada na cavidade peritoneal anterior à colheita de células. Após a injecção de tioglicolato, o rendimento de macrófagos por rato foi aumentada em 10 vezes. Apesar do aumento na produção de macrófagos, tioglicolato de Brewer médias atos como um irritante que induz uma resposta inflamatória, resultando no recrutamento de macrófagos, que may mas não é necessário afectar a expressão do gene. Assim, um grupo de controlo que consiste em macrófagos não-tratados devem ser incluídos em cada experiência. Nas nossas mãos, hepcidina expressão que é altamente estimulada pela inflamação não foi detectada em tioglicolato não-tratados induziu macrófagos peritoneais. Além disso, estudos têm mostrado que tioglicolato de cerveja recruta numerosos macrófagos, mas não ativá-los 16. Por outro lado, tioglicolato de Brewer eliciada macrófagos mostraram um aumento na enzima lisossómica, mas uma diminuição na morte de microorganismos ingeridos 17. No entanto, a capacidade fagocitária não foi afetado quando comparado com os macrófagos não provocou 16.
Uma vez cultivadas em placas, os macrófagos peritoneais se tornar aderente, permitindo assim a sua separação a partir de outro tipo de células isoladas da cavidade peritoneal. Subsequentemente, os macrófagos isolados foram estimulados com diferentes agonistas de TLRs.Por fim, o ARNm foi extraído a partir das células cultivadas e a expressão do gene foi analisada utilizando reacção em cadeia da polimerase-transcriptase reversa quantitativo (qRT-PCR).
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Protocol
Todos os procedimentos foram realizados de acordo com a Canadian Council on Animal Care orientações após a aprovação pelo Comitê Animal Care Institucional do Centro de recherche du Centre Hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM).
1. Isolamento, identificação e Cultura de Murino macrófagos Peritoneal
- Prepare meio de tioglicolato de 3,8% de cerveja. Para fazê-lo, suspensão 38 g de tioglicolato em 1000 ml de água destilada. Traga solução para ferver para dissolver o meio completamente. Esterilizar por autoclavagem a 121 ° C durante 15 min. Armazenar até 3 meses no escuro, à temperatura ambiente 18.
NOTA: Descarte se desenvolve turbidez o que indica uma contaminação bacteriana. A solução pode ser mantida por até um ano no escuro, se manteve estéril. - Usando seringas de 1 ml ligados a 23 agulhas G, injectar 1 ml de 3,8% de tioglicolato Brewer para dentro da cavidade peritoneal de cada mouse e esperar por 3 dias. Use nova seringa e agulha para cada rato.
- Anestesiar ratos por injecção intraperitoneal de pentobarbital de sódio (100 mg / kg) e a eutanásia ratos por deslocamento cervical. Confirme anestesia adequada, verificando a freqüência respiratória. Normalmente respirações rápidas indicam que o mouse não está profundamente anestesiados.
- Lavar o abdómen de cada rato com etanol a 70%. Usando uma tesoura, realizar uma incisão lateral ao longo da linha média inferior do peritônio.
- Usando uma pinça, puxar para trás a pele abdominal para expor a pele peritoneal transparente. Usando 5 ml seringas unidas a 20 agulhas G, injectar 5 ml de DPBS frio para dentro da cavidade peritoneal de cada rato.
- Realizar uma massagem suave na cavidade peritoneal e, em seguida, aspirar o fluido com cuidado, sem perfurar qualquer órgão. Remover a agulha e dispensar o fluido peritoneal em tubos de 50 ml de centrífuga cónicos.
- Centrifugar durante 10 minutos a 400 xg numa centrifugadora refrigerada.As células devem ficar frio durante todo o procedimento. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em meio RPMI 1640.
- Usando um hemocitómetro, contagem de células e ajustar a densidade celular para 1 x 10 6 células / ml.
- Caracterizar o fenótipo de células isoladas por citometria de fluxo utilizando 1 x 10 6 culas por rato e antibodie contra F4 / 80 (um antigénio de superfície expresso em macrófagos).
2. tratamentos com células-
- Directamente, após isolamento, adicionar 1 x 10 6 células em cada poço. Deixar os macrófagos peritoneais murinos para aderir em placas de 6 poços por cultura durante 1 a 2 horas a 37 ° C. Remover as células não aderentes por lavagem suave três vezes com PBS quente.
- Subsequentemente, as células de cultura em 900 ul de DMEM isento de soro durante 24 horas na presença das seguintes ligandos de TLR: (Pam3CSK4-TLR1 / 2 (0,5 mg / ml); poli (I: C) -TLR3 (10 mg / ml) ; LPS-TLR4 (100 ng / mL); A flagelina-TLR5 (100 ng / ml); FSL1-TLR6 / 2 (100 ng / ml); ssRNA40-TLR7 (1 ug / ml); ODN1826-TLR9 (1 uM).
NOTA: Prepare-se para cada ligando uma solução 10x estoque. Adicionar 100 ul desta última em cada poço, realizando assim uma diluição de 10 vezes.
3. Isolamento de ARN
- Remover todas as células de média e lisam directamente nas placas de seis poços por adição de 1 ml de TRIzol a cada poço e a passagem do ligado de células várias vezes através de uma pipeta. Incubar as amostras homogeneizadas durante 5 a 10 min à temperatura ambiente, para permitir a dissociação completa do complexo de nucleoproteínas.
- Transferir ligado em 1,5 ml RNase- e microtubos livre de DNase. Adicionar 0,2 ml de clorofórmio por cada 1 mL de TRIzol. Agitar tubos vigorosamente à mão durante 15 segundos e incubar à temperatura ambiente durante 5 a 10 min. Centrifuga-se a 12000 xg durante 15 min a 4 ° C. Observe-se a mistura para uma fase de separação vermelho (fenol-clorofórmio) inferior, uma interfase e uma fase aquosa superior incolor. ARN permanece exclusivamente na fase aquosa.
- Transfer cuidadosamente a fase aquosa superior para um tubo fresco, sem perturbar a interfase. Precipitar o ARN a partir dele por mistura com 0,5 ml de álcool isopropílico. Incubar as amostras à temperatura ambiente durante 10 min e centrifuga-se a 12.000 xg durante 10 min a 4 ° C. O ARN precipitados formando um sedimento branco no lado e no fundo do tubo.
- Remover o sobrenadante. Lava-se a pelete de ARN, uma vez com 1 ml de etanol a 75%. Misturar as amostras com vórtex e centrifugar a 7500 xg durante 5 min a 4 ° C. Resumidamente secar o ARN (secar ao ar durante 10 min). Dissolve-se o ARN em 0,1 mL de DEPC (ARNase isenta de água) e incubar durante 10 min a 55 ° C.
- Quantificar ARN utilizando um espectrofotómetro. Para fazê-lo, amostras diluídas 100 vezes em água com DEPC e lidas a comprimentos de onda de 260 nm. A concentração de RNA será então: OD 260 x 40 ng / ul x fator de diluição.
- Equalizar as concentrações de RNA e síntese de cDNA, conforme as instruções do fabricante e utilizando RT-PCR Sistema de kit de primeiros-Strand cDNA Synthesis. Comoacordo com as instruções do fabricante, medir os níveis de ARNm do gene por PCR em tempo real (45 ciclos) em um sistema de detecção de ADN em tempo real. Normalizar os níveis de expressão gênica com gene dois arrumação por exemplo β-actina e GAPDH.
NOTA: A concentração de RNA Normalizar a 500 ug / ml e 0,5 ug utilizar para a síntese de cDNA.
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Representative Results
Nós caracterizado pela primeira vez os macrófagos peritoneais murinos isolados por citometria de fluxo. Para isso, utilizou-se 80 / (F4) anticorpos que reconhecem especificamente marcadores única expressas por macrófagos. Esta caracterização é necessária para determinar a percentagem de macrófagos isolados e para os distinguir entre células obtidas durante o processo de isolamento. Tal como mostrado na (figura 1), a percentagem de células que expressam o antigénio F4 / 80 foi consistentemente encontrado para ser superior a 95%. Em seguida, para estudar a expressão de genes em macrófagos, as células isoladas foram tratados com vários ligandos de TLR: Pam3CSK4 (TLR1 / 2), LPS (TLR4) e FSL1 (TLR6 / 2). Subsequentemente, os níveis de mRNA de Hepcidina (Hamp), o nosso gene de interesse, foram medidas por RT-PCR. Tal como mostrado na (figura 2), TLR1 / 2, e TLR4 / 2 TLR6 ligandos foram capazes de estimular a ARNm hepcidina em macrófagos murinos 19. Juntos, estes resultados demonstram a utilidade deste protocolo para o sucessoly isolar macrófagos peritoneais murinos e precisamente para investigar a regulação da expressão genética molecular.
Figura 1. Caracterização de células isoladas da cavidade peritoneal. O enriquecimento dos macrófagos recuperados foi confirmada por análise de citometria de fluxo utilizando o anticorpo F4 / 80 após o bloqueio coloração não específica com anticorpos / CD32 CD16 e foi consistentemente encontrado para ser superior a 95%.
Figura 2. ligandos de TLR induzir a expressão de hepcidina em macrófagos peritoneais murinos. Depois de macrófagos peritoneais de murino isolamento e estimulação com TLR1 / 2, RST4 e / TLR6 dois ligandos, os níveis de mRNA hepcidina foram estudados por reacção inversa quantitativa em cadeia transcriptase-polimerase. Os dados são apresentados como média ± SEM;ND (não detectável); * P <0,05 versus controlo (Ctrl). Os resultados são representativos de três experiências semelhantes realizadas independentemente.
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Discussion
Os macrófagos são cruciais para a sobrevivência e fornecer um alvo tentador para manipular o host para objectivos imunológicos. A descoberta dos TLRs e outras moléculas de reconhecimento têm conduzido os macrófagos para o centro do debate imunológica. Os macrófagos responder a uma variedade de estímulos, incluindo citocinas, moléculas associadas a danos moleculares padrão (20) amortece e moléculas associadas com grupos de patógenos (PAMPs) 21. Estas respostas estímulos diferentes representam o curso da ativação de macrófagos, e estão geralmente associados a alterações bruscas na expressão gênica 22.
Em condições de não-inflamatórios, a maioria dos macrófagos residem em locais estratégicos no corpo. Eles podem ser encontrados em todos os tecidos e como monócitos circulantes no sangue. Portanto, os macrófagos estão presentes nos locais mais susceptíveis à invasão microbiana.
A defesa do hospedeiro é descrita como um inflammatory resposta para a eliminação de agentes patogénicos intracelulares associados com a activação de macrófagos clássica. A activação de macrófagos clássica é induzida por produtos microbianos, tais como lipopolissacáridos em um ambiente de citocinas Th1 que conduzirão a pró-inflamatória M1-macrófagos polarização. A persistência de inflamação resulta em danos nos tecidos e o desenvolvimento de mecanismos de anti-inflamatórios necessários para a sobrevivência do hospedeiro. Portanto, as citocinas Th2, em seguida, permitir que a introdução de anticorpos anti-inflamatória M2 macrófagos polarização que inibe e regula a resposta M1, e também promove a reparação de tecidos. No protocolo descrito no presente documento, tioglicolato de injecção na cavidade peritoneal estimula a cascata inflamatória clássica e leva ao recrutamento de macrófagos M1.
Até à data, muitos estudos foram realizados utilizando medula óssea, baço ou macrófagos peritoneais derivado. Estes macrófagos representam hétérogèneous populações com diferentes atividades. Com base nas suas características de morfologia e de superfície molecular, estudos têm demonstrado que os macrófagos peritoniais são mais maduros do que a medula óssea e baço derivadas macrófagos 23. Ao contrário do baço e do peritoneu macrófagos derivados, macrófagos da medula óssea derivadas apresentar uma capacidade notável em pahgocytosis e proliferação e pode ser completamente diferenciadas a partir de células progenitoras de macrófagos 20,24,25. Além disso, o isolamento dos macrófagos da medula óssea apresenta um rendimento homogénea com longa vida útil. Por outro lado, estes macrófagos não se encontram totalmente caracterizados e a sua utilização em estudos experimentais apresenta complicações devido à inconstância da sua fenótipo e 26 funciona. Ao contrário da medula óssea, macrófagos derivados baço e macrófagos peritoneu parecem ser mais funcional e fenotipicamente estável 23.
Assim, o isolamento de macrófagos peritoneais murinos cum servem diferentes estudos imunológicos e análise de expressão gênica. Além disso, a cavidade peritoneal do rato proporciona um local ideal para os macrófagos residentes de colheita 27. No entanto, o número elicitada é moderada e estimado em cerca de 1 x 10 6 macrófagos por rato. Assim, para aumentar a colheita de macrófagos, provocando agentes tais como tioglicolato foi injectada na cavidade peritoneal 3 dias antes do isolamento da célula 28. Este agente irá induzir uma resposta inflamatória e, consequentemente, aumentar a culturas de macrófagos.
É imperativo para realizar uma massagem suave na cavidade peritoneal antes de retirar lentamente o fluido peritoneal sem perfurar qualquer órgão. Retirando o volume máximo possível é necessário para coletar o maior número de células. No caso de contaminação do sangue, um tampão de lise pode ser utilizado no final do procedimento para descartar células vermelhas do sangue. Os macrófagos eliciados pode, então, ser caracterizada por fluxo cytometr y utilizando anticorpos contra os antígenos que são exclusivos para os macrófagos como F4 / 80.
Durante todo o procedimento, certifique-se de que todos os reagentes estão isentos de endotoxinas e todos os animais foram alojados permanentemente em condições livres de patógenos específicos. A execução desse procedimento em condições livres de patógenos é fundamental, porque a estimulação de macrófagos antes de experimentos iminentes vai alterar significativamente a análise dos resultados.
Uma vez isolados, os macrófagos peritoneais pode ser usado em diversos estudos, incluindo a produção de citoquinas inflamatórias, a fagocitose, a sinalização celular, a expressão do gene, a quimiotaxia e a toxicologia 29. Por exemplo, após a estimulação com diferentes ligandos de TLR, nós investigamos nos macrófagos eliciados a regulação molecular de um regulador chave do metabolismo do ferro chamado hepcidina. 24 horas após os tratamentos com células, o ARN total foi isolado com o reagente de Trizol, e a expressão do gene foi analisada por meio de qRT-PCR.
_content "> Como estamos estudando ativação TLR e expressão gênica, é recomendado o uso de DMEM sem soro. meio sem soro reduz o grau de contaminantes e eliminar qualquer fonte potencial de agentes infecciosos.Embora o isolamento de ARN parece ser um processo simples, ARNase e contaminação de ADN deve ser evitada para evitar a degradação do ARN e obter resultados precisos de qRT-PCR. A melhor maneira para detectar contaminação de ADN é a de incluir um controlo para cada amostra de RNA em uma experiência RT-PCR "minus-RT". Se um produto de PCR é gerado a partir de uma amostra de ARN que não foi reversamente transcrito, em seguida, o produto foi amplificado a partir de ADN contaminante. No caso de contaminação de ADN, a utilização de tratamento com DNase é possível. No entanto, a DNase deve ser completamente inactivadas antes da RT-PCR de modo a que não degrada o ADN recém-sintetizado.
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Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da Ciências Naturais e do Conselho de Investigação do Canadá Engenharia (NSERC, conceder nenhuma 298.515-2011). AL é o destinatário de um Ph.D. bolsa de estudos das ciências naturais e Council of Canada (NSERC) Pesquisa de Engenharia, e MS foi apoiada de uma concessão dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (CIHR, conceder nenhuma. MOP123246).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | Charles River Laboratories, Inc. (Wilmington, MA, USA) | 475 | |
| Thioglycollate | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | 19032-500G | |
| 70% ethanol | |||
| 10% sodium pentobarbital (Used for mice anesthesia (80 mg/kg, i.p.)) | |||
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS), placed on ice and will serve to harvest macrophages | WISENT INC Canada (QC) | 311-425-CL | |
| RPMI medium 1640 (Supplement with penicillin, streptomycin, L-glutamine, and 10 % fetal calf serum). | WISENT INC Canada (QC) | 350-000-CL | |
| 1 and 5 ml syringes | BD USA (NJ) | 309659 | |
| 6-well plates | Corning Incorporated (NY, USA) | MCT-150-C | |
| Bacterial lipoprotein Pam3CSK4 (0.5 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-pm25 | |
| Polyionosine–polycytidylic acid (Poly(I:C)) (10 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-PIC | |
| LPS from Escherichia coli 055:B5 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | L2880 | |
| Purified flagellin from Salmonella typhimurium (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FLIC-10 | |
| Lipoprotein synthetic FSL1 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FSL | |
| ssRNA derived from the HIV-1 long terminal repeat ssRNA40 (1 μg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-LRNA-40 | |
| Type B CpG oligonucleotide ODN1826 (1 μM) | InvivoGen (San Diego, USA) | 11B16-MM | |
| TRIzol | Invitrogen, (Burlington, ON, Canada) | 15596-026 | |
| 20 G and 23 G needles | BD USA (NJ) | 305175 | |
| Scissor | |||
| Forceps | |||
| 50 ml conical tubes placed on ice | Sarstedt (Newton, MA, USA) | 62.547.205 | |
| Red Blood Cells Lysis Buffer | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | R7757-100ML | |
| Refrigerated centrifuge | |||
| Hemocytometer | |||
| F4/80 antibody | BIO-RAD ( CA, USA) | MCA497APC | |
| CD16/CD32 antibodies | Pharmingen, {Mississauga, ON, CA) | 553141 | |
| Flow cytometer | Coulter Epics Elite counter, Coulter, (Hialeah, FL,USA) | ||
| 1.5 ml Eppendorf tubes | Axygen Scietific (CA,USA) | 3516 | |
| Chloroform | Fisher Scientific (ON, Canada) | UN1888 | |
| Isopropyl alcohol | JT Baker (PA, USA) | 70566 | |
| 75% ethanol (in DEPC treated water) | Commercial Alchohols (QC, Canada) | 17394 | |
| 0.01% diethyl pyrocarbonate (DEPC) treated water (let stand overnight and autoclave) | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | 216.542.8 | |
| Omniscript RT-PCR system | Qiagen, (Mississauga, ON, Canada) | 205113 | |
| Rotor Gene 3000 | Montreal Biotech, (Kirkland, QC, Canada) | ||
| QuantiTect SYBR Green I PCR kits | Qiagen, (Mississauga, ON, Canada) | 204141 |
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