Descrevemos aqui um protocolo simples para isolar macrófagos peritoneais murinos. Este procedimento é seguido pela extração de RNA para realizar a análise da expressão gênica após a estimulação de receptores do tipo Toll.
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Artigo de método
Isolamento de Murino macrófagos peritoniais de Cumprir a análise de expressão gênica Após Toll-like receptors Estimulação
Neste artigo
Resumo
Resumo
Durante a infecção e inflamação, os monócitos circulantes na corrente sanguínea e deixar migrar para os tecidos, onde eles diferenciam-se em macrófagos. Os macrófagos expressam receptores de superfície semelhantes a Toll (TLRs) que reconhecem padrões moleculares conservadas através da evolução de uma vasta gama de microorganismos. TLRs desempenhar um papel central na activação de macrófagos, que está geralmente associada com a expressão do gene alteração. Os macrófagos são críticas em muitas doenças e surgiram como alvos atractivos para terapia. No seguinte protocolo, que descrevem um procedimento para isolar macrófagos peritoneais de murino, utilizando meio de tioglicolato de Brewer. Este último irá aumentar a migração dos monócitos para o peritoneu, por conseguinte irá aumentar este rendimento de macrófagos por 10 vezes. Vários estudos têm sido realizados utilizando medula óssea, baço ou peritoneal derivada macrófagos. No entanto, os macrófagos peritoneais foram mostrados para ser mais maduro no isolamento e são mais estáveis no seu funcionaldade e fenótipo. Assim, macrófagos isolados a partir da cavidade peritoneal de murino apresentar uma população de células importante que pode servir em diferentes estudos imunológicos e metabólicos. Uma vez isolados, os macrófagos foram estimulados com diferentes ligandos de TLR e, consequentemente, a expressão do gene foi avaliada.
Introdução
O sistema reticuloendotelial fagocítico é composto de células em vários tecidos e órgãos, tais como a medula óssea, sangue, fígado e baço. Os macrófagos são amplamente distribuídos ao redor do corpo, onde elas nomeadamente participar inata e adaptativa respostas imunes para controlar infecções e claras. Em adição ao seu papel na defesa do hospedeiro, os macrófagos desempenham também um papel importante na cicatrização de feridas e na manutenção da homeostase dos tecidos 1,2. Além disso, os macrófagos não só são importantes para a função imune, mas também participar activamente na homeostase do ferro 3. No corpo, cerca de 80% do ferro está presen....
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Protocolo
Todos os procedimentos foram realizados de acordo com a Canadian Council on Animal Care orientações após a aprovação pelo Comitê Animal Care Institucional do Centro de recherche du Centre Hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM).
1. Isolamento, identificação e Cultura de Murino macrófagos Peritoneal
- Prepare meio de tioglicolato de 3,8% de cerveja. Para fazê-lo, suspensão 38 g de tioglicolato em 1000 ml de água destilada. Traga solução para ferver para dissolver o meio completamente. Esterilizar por autoclavagem a 121 ° C durante 15 min. Armazenar até 3 meses no escuro, à temperatura ambiente 18.
NO....
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Resultados
Nós caracterizado pela primeira vez os macrófagos peritoneais murinos isolados por citometria de fluxo. Para isso, utilizou-se 80 / (F4) anticorpos que reconhecem especificamente marcadores única expressas por macrófagos. Esta caracterização é necessária para determinar a percentagem de macrófagos isolados e para os distinguir entre células obtidas durante o processo de isolamento. Tal como mostrado na (figura 1), a percentagem de células que expressam o antigénio F4 / 80 foi consistentemente encontrado.......
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Discussão
Os macrófagos são cruciais para a sobrevivência e fornecer um alvo tentador para manipular o host para objectivos imunológicos. A descoberta dos TLRs e outras moléculas de reconhecimento têm conduzido os macrófagos para o centro do debate imunológica. Os macrófagos responder a uma variedade de estímulos, incluindo citocinas, moléculas associadas a danos moleculares padrão (20) amortece e moléculas associadas com grupos de patógenos (PAMPs) 21. Estas respostas estímulos diferentes representam o curs.......
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Divulgações
Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da Ciências Naturais e do Conselho de Investigação do Canadá Engenharia (NSERC, conceder nenhuma 298.515-2011). AL é o destinatário de um Ph.D. bolsa de estudos das ciências naturais e Council of Canada (NSERC) Pesquisa de Engenharia, e MS foi apoiada de uma concessão dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (CIHR, conceder nenhuma. MOP123246).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Camundongos C57BL/6 | Charles River Laboratories, Inc. (Wilmington, MA, EUA) | 475 | |
| Tioglicolato | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | 19032-500G | |
| 70% etanol | |||
| 10% pentobarbital sódico (Usado para anestesia em camundongos (80 mg/kg, i.p.)) | |||
| Dulbecco' s solução salina tamponada com fosfato (DPBS), colocada no gelo e servirá para colher macrófagos | WISENT INC Canada (QC) | 311-425-CL | |
| RPMI medium 1640 (Suplemento com penicilina, estreptomicina, L-glutamina e soro fetal de bezerro a 10%). | WISENT INC Canadá (QC) | 350-000-CL | |
| Seringas de 1 e 5 ml | BD USA (NJ) | ||
| placas de 6 poços | Corning Incorporated (NY, EUA) | MCT-150-C | |
| Lipoproteína bacteriana Pam3CSK4 (0,5 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, EUA) | TLRL-pm25 | |
| Poliionosina– ácido policitidílico (Poli(I:C)) (10 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, EUA) | TLRL-PIC | |
| LPS de Escherichia coli 055:B5 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, EUA) | L2880 | |
| Flagelina purificada de Salmonella typhimurium (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, EUA) | TLR-FLIC-10 | |
| Lipoproteína sintética FSL1 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, EUA) | TLR-FSL | |
| ssRNA derivado do ssRNA40 de repetição terminal longa do HIV-1 (1 μ g/ml) | InvivoGen (San Diego, EUA) | TLR-LRNA-40 | |
| Tipo B CpG oligonucleotídeo ODN1826 (1 μ M) | InvivoGen (San Diego, EUA) | 11B16-MM | |
| TRIzol | Invitrogen, (Burlington, ON, Canadá) | 15596-026 | |
| Agulhas de 20 G e 23 G | BD USA (NJ) | ||
| Pinça de tesoura | |||
| Tubos | |||
| cônicos de 50 ml colocados no gelo | Sarstedt (Newton, MA, EUA) | 62.547.205 | |
| Tampão de lise de glóbulos vermelhos | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | R7757-100ML | |
| Centrífuga | |||
| Hemocitômetro | |||
| F4 / 80 anticorpo | BIO-RAD (CA, EUA) | ||
| Anticorpos CD16 / CD32 | Pharmingen, {Mississauga, ON, CA) | 553141 | |
| Citômetro | de fluxoContador Coulter Epics Elite, Coulter, (Hialeah, FL,EUA) | ||
| Tubos Eppendorf de 1,5 ml | Axygen Scietific (CA,EUA) | 3516 | |
| Clorofórmio | Fisher Scientific (ON, Canadá) | UN1888 | |
| Álcool isopropílico | JT Baker (PA, EUA) | 70566 | |
| Etanol 75% (em água tratada com DEPC) | Álcool Comercial (QC, Canadá) | 17394 | |
| 0,01% de água tratada com dietilpirocarbonato (DEPC) (deixe repousar durante a noite e autoclave) | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | 216.542.8 | |
| Sistema Omniscript RT-PCR | Qiagen, (Mississauga, ON, Canadá) | 205113 | |
| Rotor Gene 3000 | Montreal Biotech, (Kirkland, QC, Canadá) | ||
| Kits de PCR QuantiTect SYBR Green I | Qiagen, (Mississauga, ON, Canadá) | 204141 |
Referências
- Pollard, J. W. Trophic macrophages in development and disease. Nat Rev Immunol. 9 (4), 259-270 (2009).
- Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat Rev Immunol. 3 (1), 23-35 (2003).
- Koury, M. J., Ponka, P.
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Reimpressões e permissões
