Abstract
Lors de l'infection et l'inflammation, les monocytes circulants quittent la circulation sanguine et migrent dans les tissus, où ils se différencient en macrophages. Les macrophages expriment des récepteurs de surface Toll-like (TLR), qui reconnaissent des motifs moléculaires conservés à travers l'évolution dans une large gamme de micro-organismes. TLR jouent un rôle central dans l'activation des macrophages qui est généralement associée à l'expression du gène altération. Les macrophages sont essentiels dans de nombreuses maladies et sont apparus comme des cibles attrayantes pour la thérapie. Dans le protocole suivant, nous décrivons une procédure d'isoler les macrophages péritonéaux murins en utilisant un milieu thioglycollate de Brewer. Ce dernier va stimuler la migration des monocytes dans le péritoine, en conséquence, cela posera des macrophages rendement de 10 fois. Plusieurs études ont été effectuées en utilisant la moelle osseuse, la rate ou péritonéale macrophages dérivés. Toutefois, les macrophages péritonéaux sont avérés plus mature sur l'isolement et sont plus stables dans leur fonctionnellité et le phénotype. Ainsi, macrophages isolés de la cavité péritonéale murin présentent une population de cellules importantes qui peuvent servir dans différentes études immunologiques et métaboliques. Une fois isolé, les macrophages ont été stimulées avec les différents ligands de TLR et par conséquent l'expression génique a été évaluée.
Introduction
Le système réticulo-endothélial phagocytaire est composé de cellules dans différents tissus et organes tels que la moelle osseuse, le sang, le foie et la rate. Les macrophages sont largement distribués autour du corps, où ils participent notamment à des innées et adaptatives des réponses immunitaires à contrôler et infections claires. En plus de leur rôle dans la défense de l'hôte, les macrophages jouent également un rôle important dans la cicatrisation des plaies et dans le maintien de l'homéostasie tissulaire 1,2. En outre, les macrophages ne sont pas seulement importants pour la fonction immunitaire, mais participent aussi activement à l'homéostasie du fer 3. Dans le corps, environ 80% de fer est présent en hémoglobine dans les erythrocytes, qui, lorsqu'il est sénescente sont phagocytés par les macrophages 4. Quotidien, ces macrophages recyclent 25 mg de fer érythrocytaire dérivés et fournissent son transport dans le plasma 5. En outre, lors de l'infection et l'inflammation, les macrophages pro-inflammatoires séquestrent le fer sérique de réduire availabili de ferty aux pathogènes, aux niveaux systémiques et locaux 6-8. En outre, des études ont montré que les macrophages et hépatocytes produisent principalement un peptide antimicrobien appelé hepcidine qui est considéré comme le maître régulateur du métabolisme du fer 9, 10. L'hepcidine est principalement augmenté par des stimuli inflammatoires et est partiellement responsable de la séquestration du fer dans les macrophages sur l'inflammation chronique 11-13. Comme expression de l'hepcidine dans les macrophages est pas très bien compris, nous avons étudié le rôle possible des récepteurs Toll-like (TLR) dans le présent règlement. Les TLR se trouvent principalement sur les macrophages et jouent un rôle central dans leur activation. En outre, le LPS induit l'expression de l'hepcidine dans le foie dépend de TLR4 13. Par conséquent, pour exécuter notre étude, nous avons utilisé une méthode basée sur l'isolement des macrophages péritonéaux murins.
lignées de cellules macrophages sont largement utilisés dans le goujon macrophagess; néanmoins culture prolongée peut provoquer la perte du gène et une diminution de la fonction immunitaire dans ces lignées cellulaires. Ainsi, l'isolement des macrophages de la cavité péritonéale est crucial.
La cavité péritonéale de la souris présente un site idéal pour la récolte macrophages 13-15. Macrophages péritonéaux murins isolés sont commode pour plusieurs études concernant leur fonction immunologique. Cependant, le nombre de macrophages dans le péritoine est insuffisante pour des études approfondies et est estimée à environ 1 x 10 6 par souris, des macrophages. Ainsi, pour augmenter la production de macrophages, un agent provoquant stérile tel que de thioglycolate ont été injectés dans la cavité péritonéale précédant la récolte des cellules. Après injection thioglycollate, le rendement des macrophages par souris a été augmenté de 10 fois. Malgré l'augmentation du rendement des macrophages, des actes moyennes thioglycollate Brewer comme un irritant qui induit une réponse inflammatoire, résultant dans le recrutement des macrophages, qui may mais pas nécessaire affectent l'expression des gènes. Par conséquent, un groupe de contrôle constitué de macrophages non traités doit être inclus dans chaque expérience. En nos mains, l'hepcidine expression qui est fortement stimulée par l'inflammation n'a pas été détecté dans thioglycolate non traité suscité des macrophages péritonéaux. En outre, des études ont montré que la thioglycollate Brewer recrute de nombreux macrophages, mais ne les active pas 16. D'autre part, le thioglycolate de Brewer a suscité macrophages ont montré une augmentation des enzymes lysosomales, mais une diminution de tuer les microorganismes ingérés 17. Cependant, la capacité de phagocytose n'a pas été affectée par rapport aux macrophages non provoquée 16.
Une fois cultivées dans des boîtes, les macrophages péritonéaux deviennent adhérentes, permettant ainsi leur séparation d'avec d'autres types de cellules isolées à partir de la cavité péritonéale. Par la suite, les macrophages isolés ont été exposés à différents agonistes TLR.Enfin, l'ARNm a été extrait des cellules cultivées et l'expression des gènes a été analysée en utilisant une réaction en chaîne transcriptase-polymerase inverse quantitative (qRT-PCR).
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Protocol
Toutes les procédures ont été effectuées en conformité avec le Conseil canadien sur les lignes directrices des soins des animaux après l'approbation par le Comité institutionnel de protection des animaux du Centre de recherche du Centre hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM).
1. Isolement, identification, et de la culture des macrophages murins péritonéale
- Préparer le milieu thioglycollate de 3,8% brasseur. Pour ce faire, suspendre 38 g de milieu au thioglycolate dans 1000 ml d'eau distillée. Apportez solution à ébullition pour dissoudre complètement le milieu. Stériliser par autoclavage à 121 ° C pendant 15 min. Stockez jusqu'à trois mois dans l'obscurité, à température ambiante 18.
NOTE: Jeter si la turbidité développe ce qui indique une contamination bactérienne. La solution peut être conservée pendant jusqu'à un an dans l'obscurité si gardé stérile. - Utilisation de seringues de 1 ml attachés à 23 G aiguilles, injecter 1 ml de 3,8% Brewer thioglycollate moyenne dans la cavité péritonéale de chaque mousoi et attendre pendant 3 jours. Utilisez nouvelle seringue et une aiguille pour chaque souris.
- Anesthésier les souris par injection intraperitoneale de pentobarbital sodique (100 mg / kg) et euthanasie les souris par dislocation cervicale. Confirmez anesthésie appropriée en cochant la fréquence respiratoire. Habituellement respirations rapides indiquent que la souris est pas profondément anesthésié.
- Laver l'abdomen de chaque souris avec 70% d'éthanol. En utilisant une paire de ciseaux, réaliser une incision latérale le long de la ligne médiane inférieure du péritoine.
- En utilisant une pince, retirer la peau abdominale pour exposer la peau péritonéale transparent. Utilisation de seringues de 5 ml attachés à aiguilles 20 G, injecter 5 ml de DPBS froid dans la cavité peritoneale de chaque souris.
- Effectuer un massage doux sur la cavité péritonéale puis aspirer soigneusement le liquide sans perforer un organe. Retirez l'aiguille et distribuer le liquide péritonéal en tubes de 50 ml de centrifugation coniques.
- Centrifuger pendant 10 min à 400 g dans une centrifugeuse réfrigérée.Les cellules doivent rester froid pendant toute la procédure. Rejeter le surnageant et remettre en suspension culot cellulaire dans un milieu RPMI 1640.
- En utilisant un hémocytomètre, et compter les cellules à ajuster la densité des cellules à 1 x 10 6 cellules / ml.
- Caractériser le phénotype des cellules isolées par cytométrie de flux en utilisant 1 x 10 6 cellules par souris contre antibodie et F4 / 80 (un antigène de surface exprimé sur les macrophages).
2. Traitements cellulaires
- Directement, après isolement, ajouter 1 x 10 6 cellules dans chaque puits. Laissez les macrophages péritonéaux murins à adhérer dans des plaques à 6 puits en les cultivant pendant 1-2 heures à 37 ° C. Éliminer les cellules non-adhérentes en lavant doucement 3 fois avec du PBS chaud.
- Par la suite, des cellules en culture dans du DMEM exempt de sérum 900 ul pendant 24 heures en présence des ligands de TLR suivants: (PAM3CSK4-TLR1 / 2 (0,5 mg / ml); le poly (I: C) -TLR3 (10 mg / ml) ; LPS-TLR4 (100 ng / ml); flagelline au TLR5 (100 ng / ml); FLS1-TLR6 / 2 (100 ng / ml); ssRNA40-TLR7 (1 ug / ml); ODN1826-TLR9 (1 uM).
NOTE: Préparer pour chaque ligand une solution 10x de stock. Ajouter 100 ul de celle-ci dans chaque puits, effectuant ainsi une dilution de 10 fois.
3. Isolement de l'ARN
- Retirer toutes les cellules du milieu et lyse directement dans les plaques à six puits par addition de 1 ml de TRIzol dans chaque puits et le passage du lysat de cellules plusieurs fois à travers une pipette. Incuber les échantillons homogénéisés pendant 5 à 10 min à la température ambiante, afin de permettre la dissociation complète des complexes de nucléoprotéine.
- Transfert lysat dans 1,5 ml RNase- et microtubes DNase. Ajouter 0,2 ml de chloroforme par 1ml TRIzol. Agiter les tubes vigoureusement à la main pendant 15 secondes et les incuber à température ambiante pendant 5 à 10 min. Centrifugeuse à 12.000 g pendant 15 min à 4 ° C. Observer le mélange se séparer en une phase rouge (phénol-chloroforme) inférieur, une interphase et une phase aqueuse supérieure incolore. ARN reste exclusivement dans la phase aqueuse.
- Transfer attentivement la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube sans perturber l'interphase. Précipiter l'ARN de celui-ci par mélange avec 0,5 ml d'alcool isopropylique. Incuber les échantillons à température ambiante pendant 10 min et centrifugation à 12 000 xg pendant 10 min à 4 ° C. L'ARN précipités formant un culot blanc sur le côté et le bas du tube.
- Retirer le surnageant. Laver le culot une fois avec de l'ARN 1 ml d'éthanol à 75%. Mélanger les échantillons par vortex et centrifuger à 7500 g pendant 5 min à 4 ° C. Brièvement sécher l'ARN (de sécher à l'air pendant 10 min). Dissoudre ARN dans 0,1 ml DEPC (RNAse d'eau libre) et incuber pendant 10 min à 55 ° C.
- Quantifier l'ARN en utilisant un spectrophotomètre. Pour ce faire, diluer les échantillons 100 fois dans de l'eau DEPC et lire à longueurs d'onde de 260 nm. La concentration d'ARN est alors: OD 260 x 40 ng / ul x facteur de dilution.
- Egaliser concentrations d'ARN et de synthétiser l'ADNc selon les instructions du fabricant en utilisant système RT-PCR pour trousse de premiers-Strand cDNA Synthesis. Commeselon les instructions du fabricant, de mesurer les niveaux d'ARNm du gène par PCR en temps réel (45 cycles) dans un système de détection de l'ADN en temps réel. Normaliser les niveaux d'expression des gènes avec deux gènes de ménage par exemple β-actine et GAPDH.
REMARQUE: Normaliser concentration d'ARN à 500 ng / ml et en utilisant 0,5 ug pour la synthèse d'ADNc.
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Representative Results
Nous avons caractérisé les premier macrophages péritonéaux murins isolés par cytométrie de flux. Pour ce faire, nous avons utilisé (F4 / 80) anticorps qui reconnaissent spécifiquement des marqueurs seulement exprimées par les macrophages. Cette caractérisation est nécessaire pour déterminer le pourcentage de macrophages isolés et de les distinguer entre les cellules obtenues au cours du processus d'isolement. Comme le montre la (figure 1), le pourcentage de cellules exprimant l'antigène F4 / 80 est toujours révélée être supérieure à 95%. Ensuite, pour étudier l'expression des gènes dans les macrophages, les cellules isolées ont été traitées avec plusieurs ligands de TLR: PAM3CSK4 (TLR1 / 2), LPS (TLR4) et FSL1 (TLR6 / 2). Par la suite, les taux d'ARNm d'hepcidine (Hamp), notre gène d'intérêt, ont été mesurés par RT-PCR. Comme le montre la (figure 2), TLR1 / 2, TLR4 et / TLR6 deux ligands sont capables de stimuler l'hepcidine ARNm dans 19 les macrophages murins. Ensemble, ces résultats démontrent l'utilité de ce protocole à succèsly isoler macrophages péritonéaux murins et d'étudier précisément la régulation moléculaire de l'expression génique.
Figure 1. Caractérisation des cellules isolées à partir de la cavité péritonéale. Enrichissement des macrophages récupéré a été confirmée par analyse par cytométrie de flux en utilisant l'anticorps F4 / 80 après blocage coloration non spécifique avec des anticorps / CD16 et CD32 a été trouvé pour être constamment au-dessus de 95%.
Figure 2. TLR ligands induire l'expression de l'hepcidine dans les macrophages péritonéaux murins. Après murin péritonéale macrophages isolement et la stimulation avec TLR1 / 2, TLR4 et TLR6 / 2 ligands, les niveaux d'ARNm de l'hepcidine ont été étudiés par la réaction quantitative de la chaîne transcriptase-polymerase inverse. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM;nd (non détectable); * P <0,05 par rapport au contrôle (Ctrl). Les résultats sont représentatifs de 3 expériences similaires réalisées de façon indépendante.
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Discussion
Les macrophages sont cruciales pour la survie et fournissent une cible tentante pour manipuler l'hôte pour objectifs immunologiques. La découverte des TLR et d'autres molécules de reconnaissance ont mené les macrophages au centre du débat immunologique. Les macrophages répondre à une variété de stimuli, y compris des cytokines, des molécules associées à des dommages moléculaires amortit motif (20) et des molécules associées à des groupes d'agents pathogènes (PAMP) 21. Ces différentes réponses de stimuli représentent au cours de l'activation des macrophages, et sont habituellement associées à des modifications soudaines dans l'expression du gène 22.
Dans des conditions non-inflammatoires, la majorité des macrophages réside dans des endroits stratégiques dans le corps. Ils peuvent être trouvés dans tous les tissus et que les monocytes circulants dans le sang. Par conséquent, les macrophages sont présents dans les sites les plus sensibles à l'invasion microbienne.
La défense de l'hôte est décrit comme un inflammatory réponse à l'élimination des pathogènes intracellulaires associés à l'activation des macrophages classique. L'activation des macrophages classique est induite par des produits microbiens tels que des lipopolysaccharides dans un environnement de cytokines Th1 qui conduira à pro-inflammatoire des macrophages M1-polarisation. La persistance des résultats de l'inflammation des lésions tissulaires et le développement de mécanismes anti-inflammatoires nécessaires à la survie de l'hôte. Par conséquent, les cytokines Th2 permettent ensuite de l'introduction de l'anti-inflammatoire M2-macrophages polarisation qui inhibe et régule la réponse M1, et favorise la réparation des tissus. Dans le protocole décrit dans le présent document, thioglycollate injection dans la cavité péritonéale stimule la cascade inflammatoire classique et conduit au recrutement des macrophages M1.
À ce jour, plusieurs études ont été effectuées en utilisant la moelle osseuse, la rate ou péritonéale macrophages dérivés. Ces macrophages représentent HeterogeneUO populations avec différentes activités. Basé sur leurs caractéristiques morphologiques et de surface moléculaire, des études ont établi que les macrophages péritonéaux sont plus matures que les os rate macrophages dérivés de moelle et 23. Contrairement à la rate et du péritoine macrophages dérivés, de moelle osseuse macrophages dérivés présentent une capacité remarquable à pahgocytosis et la prolifération et peuvent être complètement différenciées à partir de cellules progénitrices macrophages 20,24,25. En outre, l'isolation des macrophages de la moelle osseuse présente un rendement homogène avec une longue durée de vie. D'autre part, ces macrophages ne sont pas complètement caractérisés et leur utilisation dans les études expérimentales présente des complications dues à l'inconstance de leur phénotype et fonctions 26. Contrairement à la moelle osseuse, la rate macrophages dérivés et les macrophages du péritoine semblent être plus fonctionnelle et phénotypique stable 23.
Par conséquent, l'isolement des macrophages péritonéaux murins cune servir différentes études immunologiques et l'analyse de l'expression des gènes. En outre, la cavité péritonéale de la souris offre un site idéal pour la récolte macrophages résidents 27. Cependant, le nombre élicite est modéré et estimée à environ 1 x 10 6 macrophages par souris. Ainsi, pour augmenter la récolte des macrophages, des agents provoquant tels que le thioglycolate ont été injectés dans la cavité péritonéale 3 jours avant l'isolement des cellules 28. Cet agent va induire une réponse inflammatoire et en conséquence augmenter macrophages cultures.
Il est impératif d'effectuer un massage doux sur la cavité péritonéale avant de se retirer lentement le liquide péritonéal sans perforer un organe. Sortant le volume maximal possible est nécessaire de recueillir le plus grand nombre de cellules. En cas de contamination par le sang, un tampon de lyse peut être utilisée à la fin de la procédure d'écarter les globules rouges. Les macrophages induits peuvent alors être caractérisés par cytometr de flux y en utilisant des anticorps contre des antigènes qui sont uniques à des macrophages que F4 / 80.
Tout au long de la procédure, assurez-vous que tous les réactifs sont exempts d'endotoxines et de tous les animaux ont été logés de façon permanente dans des conditions exemptes d'organismes pathogènes spécifiques. L'exécution de cette procédure dans des conditions exemptes d'agents pathogènes est essentielle parce que la stimulation des macrophages avant expériences imminentes va modifier considérablement l'analyse des résultats.
Une fois isolé, les macrophages péritonéaux peuvent être utilisés dans plusieurs études, y compris la production de cytokines inflammatoires, la phagocytose, la signalisation cellulaire, l'expression des gènes, la chimiotaxie et la toxicologie 29. Par exemple, après stimulation avec différents ligands de TLR, nous avons étudié dans les macrophages suscitées la régulation moléculaire d'un régulateur clé du métabolisme du fer appelée hepcidine. 24 heures après les traitements de cellules, l'ARN total a été isolé avec un réactif de TRIzol, et l'expression des gènes a été analysée par qRT-PCR.
_content "> Comme nous étudions TLR activation et l'expression des gènes, l'utilisation de DMEM sans sérum est recommandé. milieu sans sérum réduit le degré de contaminants et d'éliminer toute source potentielle d'agents infectieux.Quoique ARN isolement semble un processus simple, RNase et de contamination de l'ADN doivent être évitées pour prévenir la dégradation de l'ARN et obtenir des résultats précis qRT-PCR. Le meilleur moyen pour détecter la contamination de l'ADN est d'inclure un «RT-moins" commande pour chaque échantillon d'ARN dans une expérience de RT-PCR. Si un produit de PCR est généré à partir d'un échantillon d'ARN qui n'a pas une transcription inverse, puis le produit a été amplifié à partir d'ADN contaminant. En cas de contamination de l'ADN, l'utilisation de traitement à la DNase est possible. Cependant, la DNase doit être complètement inactivée avant RT-PCR de sorte qu'il ne se dégrade pas de l'ADN nouvellement synthétisé.
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Acknowledgments
Ce travail a été financé par une subvention du Conseil de recherches en génie du Canada en sciences naturelles et (CRSNG, accorder aucune 298515-2011). AL est le récipiendaire d'un doctorat bourse du Conseil de recherches en génie du Canada (CRSNG) en sciences naturelles et, MS et a été soutenu par une subvention des Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC, accorde pas. MOP123246).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | Charles River Laboratories, Inc. (Wilmington, MA, USA) | 475 | |
| Thioglycollate | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | 19032-500G | |
| 70% ethanol | |||
| 10% sodium pentobarbital (Used for mice anesthesia (80 mg/kg, i.p.)) | |||
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS), placed on ice and will serve to harvest macrophages | WISENT INC Canada (QC) | 311-425-CL | |
| RPMI medium 1640 (Supplement with penicillin, streptomycin, L-glutamine, and 10 % fetal calf serum). | WISENT INC Canada (QC) | 350-000-CL | |
| 1 and 5 ml syringes | BD USA (NJ) | 309659 | |
| 6-well plates | Corning Incorporated (NY, USA) | MCT-150-C | |
| Bacterial lipoprotein Pam3CSK4 (0.5 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-pm25 | |
| Polyionosine–polycytidylic acid (Poly(I:C)) (10 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-PIC | |
| LPS from Escherichia coli 055:B5 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | L2880 | |
| Purified flagellin from Salmonella typhimurium (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FLIC-10 | |
| Lipoprotein synthetic FSL1 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FSL | |
| ssRNA derived from the HIV-1 long terminal repeat ssRNA40 (1 μg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-LRNA-40 | |
| Type B CpG oligonucleotide ODN1826 (1 μM) | InvivoGen (San Diego, USA) | 11B16-MM | |
| TRIzol | Invitrogen, (Burlington, ON, Canada) | 15596-026 | |
| 20 G and 23 G needles | BD USA (NJ) | 305175 | |
| Scissor | |||
| Forceps | |||
| 50 ml conical tubes placed on ice | Sarstedt (Newton, MA, USA) | 62.547.205 | |
| Red Blood Cells Lysis Buffer | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | R7757-100ML | |
| Refrigerated centrifuge | |||
| Hemocytometer | |||
| F4/80 antibody | BIO-RAD ( CA, USA) | MCA497APC | |
| CD16/CD32 antibodies | Pharmingen, {Mississauga, ON, CA) | 553141 | |
| Flow cytometer | Coulter Epics Elite counter, Coulter, (Hialeah, FL,USA) | ||
| 1.5 ml Eppendorf tubes | Axygen Scietific (CA,USA) | 3516 | |
| Chloroform | Fisher Scientific (ON, Canada) | UN1888 | |
| Isopropyl alcohol | JT Baker (PA, USA) | 70566 | |
| 75% ethanol (in DEPC treated water) | Commercial Alchohols (QC, Canada) | 17394 | |
| 0.01% diethyl pyrocarbonate (DEPC) treated water (let stand overnight and autoclave) | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | 216.542.8 | |
| Omniscript RT-PCR system | Qiagen, (Mississauga, ON, Canada) | 205113 | |
| Rotor Gene 3000 | Montreal Biotech, (Kirkland, QC, Canada) | ||
| QuantiTect SYBR Green I PCR kits | Qiagen, (Mississauga, ON, Canada) | 204141 |
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