Abstract
Under infektion och inflammation, cirkulerande monocyter lämnar blodet och vandrar in i vävnader, där de skiljer i makrofager. Makrofager uttrycker yt Toll-liknande receptorer (TLRs), som känner igen molekylära mönster konserverade genom evolutionen i ett brett spektrum av mikroorganismer. TLRs spelar en central roll i makrofagaktivering som vanligtvis förknippas med genuttryck ändring. Makrofager är avgörande för många sjukdomar och har visat sig vara attraktiva mål för terapi. I följande protokoll, beskriver vi ett förfarande för att isolera murina peritoneala makrofager med användning av Brewers tioglykolatmedium. Den senare kommer att öka monocyt migration i bukhinnan, följaktligen kommer detta att öka makrofag avkastning med 10-faldigt. Flera studier har utförts med användning av benmärg, mjälte eller peritoneala makrofager. Emellertid var peritoneala makrofager visade sig vara mer mogna vid isolering och är mer stabila i sina funktionellaten och fenotyp. Således, makrofager som isolerats från mus bukhålan presentera en viktig cellpopulation som kan tjäna i olika immunologiska och metaboliska studier. När isolerade, var makrofager stimulerades med olika TLR ligander och därmed genuttryck utvärderades.
Introduction
Det retikuloendoteliala fagocytiska systemet består av celler i olika vävnader och organ, såsom benmärg, blod, lever och mjälte. Makrofager distribueras i stor utsträckning i kroppen, där de bland annat delta i medfödda och adaptiva immunsvar för att kontrollera och klara infektioner. Förutom deras roll i värdförsvar, makrofager spelar också en viktig roll vid sårläkning och för att bibehålla vävnadshomeostas 1,2. Dessutom, makrofager är inte bara viktigt att immunförsvaret utan också aktivt delta i järn homeostas 3. I kroppen, är cirka 80% av järn som finns i hemoglobin i erytrocyter, som när åldrande fagocyteras av makrofager 4. Dagligen dessa makrofager återvinna 25 mg erytrocythärledd järn och ge dess transport in i plasmat 5. Dessutom, under infektion och inflammation, pro-inflammatoriska makrofager binda serumjärn för att minska järn availability för patogener, både på systemiska och lokal nivå 6-8. Som väl, har studier visat att makrofager och främst hepatocyter producerar en antimikrobiell peptid som heter hepcidin som anses vara huvudregulator av järn metabolism 9, 10. Hepcidin främst ökade med inflammatoriska stimuli och är delvis ansvarig för järn upptag i makrofager vid kronisk inflammation 11-13. Som hepcidin uttryck i makrofager inte mycket väl förstått, studerade vi den eventuella rollen av Toll-liknande receptorer (TLR) i denna förordning. De TLRs finns främst på makrofager och spelar en central roll i deras aktivering. Dessutom är LPS-inducerad hepcidin expression i levern beroende TLR4 13. Därför att utföra vår studie har vi använt en metod baserad på isoleringen av murina peritoneala makrofager.
Makrofagcellinjer är i stort sett används i makrofager studer; ändå förlängd kultur kan framkalla gen förlust och minskad immunfunktioner i dessa cellinjer. Sålunda är avgörande isolering av makrofager från peritonealhålan.
Musen bukhålan utgör en idealisk plats för att skörda makrofager 13-15. Isolerade murina peritoneala makrofager är bekvämt för flera studier om deras immunologiska funktion. Dock är otillräcklig för omfattande studier antalet makrofager i peritoneum och beräknas cirka 1 x 10 6 makrofager per mus. Således, för att höja makrofag utgång framställdes en steril framkallande medel såsom tioglykolat injiceras i peritonealhålan föregår cellskörden. Efter tioglykolat injektion, var utbytet av makrofager per mus ökade med 10-faldigt. Trots ökningen av makrofager utbyte Bryggeri tioglykolatmedium fungerar som en irriterande som inducerar ett inflammatoriskt svar, vilket resulterar i rekryteringen av makrofager, som may men inte nödvändigt påverkar genuttrycket. Följaktligen måste en kontrollgrupp bestående av icke-behandlade makrofager inkluderas i varje experiment. I våra händer, var hepcidin uttryck som är mycket stimuleras av inflammation detekterades inte i icke-behandlade tioglykolat framkallade peritoneala makrofager. Dessutom har studier visat att Brewer s tioglykolat rekryterar många makrofager, men inte aktivera dem 16. Å andra sidan, Brewer tioglykolat framkallade makrofager visade en ökning av lysosomala enzymet men en minskning i att döda ingested mikroorganismer 17. Men var fagocytiska kapaciteten inte påverkas när jämfört med icke-framkallade makrofager 16.
När odlades i skålar, de peritoneala makrofagerna blir vidhäftande, därför möjliggör deras separation från andra typer av celler isolerade från den peritoneala kaviteten. Därefter fick de isolerade makrofager utmanade med olika TLRs agonister.Slutligen tillsattes mRNA extraherat från de odlade cellerna och genuttryck analyserades med användning av kvantitativ omvänd transkriptas-polymeraskedjereaktion (QRT-PCR).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden genomfördes i enlighet med den kanadensiska rådet om Animal Care riktlinjer efter godkännande av den institutionella Animal Care kommittén för Centre de recherche du Centre Hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM).
1. Isolering, identifiering och kultur Murina peritoneala makrofager
- Bered 3,8% bryggeriets tioglykolatmedium. För att göra det, skjuta upp 38 g tioglykolatmedium i 1000 ml destillerat vatten. Värms lösningen att koka för att lösa upp mediet helt. Sterilisera genom autoklavering vid 121 ° C under 15 minuter. Lagra upp till 3 månader i mörker, vid rumstemperatur 18.
OBS: Kasta om turbiditet utvecklas vilket tyder på en bakteriell kontamination. Lösningen kan förvaras i upp till ett år i mörker om de hålls sterilt. - Med användning av en ml sprutor anslutna till 23 G nålar, injicera en ml av 3,8% Brewer tioglykolatmedium i peritonealhålan hos varje mouse och vänta i 3 dagar. Använd ny spruta och nål för varje mus.
- Söva möss genom intraperitoneal injektion av natriumpentobarbital (100 mg / kg) och euthanize möss genom cervikal dislokation. Bekräfta korrekt anesthetization genom att kontrollera andningsfrekvens. Vanligtvis snabba andetag tyder på att musen inte är djupt nedsövd.
- Tvätta buken hos varje mus med 70% etanol. Med hjälp av en sax, utföra en lateral snitt längs botten mittlinje bukhinnan.
- Med hjälp av en pincett, dra tillbaka bukhuden att exponera den transparenta peritonealdialys huden. Med användning av 5 ml sprutor anslutna till 20 G nålar, injicera 5 ml kall DPBS in i peritonealhålan hos varje mus.
- Utför en mjuk massage på bukhålan och sedan aspirera vätska försiktigt utan att punktera alla organ. Ta bort nålen och dispensera peritonealvätska in 50 ml koniska centrifugrör.
- Centrifugera i 10 minuter vid 400 xg i en kyld centrifug.Cellerna måste stanna kallt under hela proceduren. Kassera supematanten och återsuspendera cellpelleten i RPMI-medium 1640.
- Med användning av en hemocytometer, räkna celler och justera till celldensiteten till en x 10 6 celler / ml.
- Karakterisera fenotypen av isolerade celler genom flödescytometri med användning av en x 10 6 celler per mus och antibodie mot F4 / 80 (ett ytantigen uttryckta på makrofager).
2. Cell Behandlingar
- Direkt efter isolering, tillsätt 1 x 10 6 celler i varje brunn. Lämna de murina peritoneala makrofager att vidhäfta till de 6-brunnars plattor genom att odla dem under 1 till 2 h vid 37 ° C. Avlägsna icke-adherenta celler genom försiktig tvättning tre gånger med varm PBS.
- Därefter kulturceller i 900 | j, l serumfritt DMEM under 24 h i närvaro av följande TLR ligander: (Pam3CSK4-TLR1 / 2 (0,5 mg / ml); Poly (l: C) -TLR3 (10 mg / ml) ; LPS-TLR4 (100 ng / ml); flagellin-TLR5 (100 ng / ml); FSL1-TLR6 / 2 (100 ng / ml); ssRNA40-TLR7 (1 mikrogram / ml); ODN1826-TLR9 (1 M).
OBS: Förbered för varje ligand en 10x stamlösning. Lägg 100 pl av den senare till varje brunn, vilket sålunda utför en 10-faldig spädning.
3. RNA-isolering
- Ta bort alla medelstora och lyserar celler direkt i sex brunnar genom att tillsätta 1 ml TRIzol till varje brunn och passerar cellysatet flera gånger genom en pipett. Inkubera de homogeniserade proverna i 5 till 10 minuter vid RT, för att medge fullständig dissociation av nukleoprotein komplex.
- Överför lysatet i 1,5 ml RNase- och DNas-fria mikrocentrifugrör. Lägg 0,2 ml kloroform per 1 ml TRIzol. Skaka rören kraftigt för hand i 15 sekunder och inkubera dem vid RT under 5 till 10 minuter. Centrifugera vid 12.000 xg under 15 minuter vid 4 ° C. Observera blandningen separerar i en lägre röd fas (fenol-kloroform), en interfas och en färglös övre vattenfasen. RNA förblir uteslutande i den vattenhaltiga fasen.
- TranSfer noggrant den övre vattenfasen till ett nytt rör utan att störa interfas. Fälla ut RNA från den genom blandning med 0,5 ml isopropylalkohol. Inkubera proverna vid RT under 10 minuter och centrifugera vid 12.000 xg under 10 minuter vid 4 ° C. RNA fällningar bildar en vit pellet på sidan och botten av röret.
- Avlägsna supernatanten. Tvätta RNA-pelleten en gång med 1 ml 75% etanol. Blanda proverna genom att vortexa och centrifugera vid 7500 xg under 5 min vid 4 ° C. Torka korthet RNA (lufttorka i 10 min). Lös RNA i 0,1 ml DEPC (RNas fritt vatten) och inkubera under 10 min vid 55 ° C.
- Kvantifiera RNA med användning av en spektrofotometer. För att göra detta, späd proverna 100 gånger i DEPC vatten och läste vid våglängder av 260 nm. RNA-koncentrationen blir då: OD 260 x 40 ng / ul x spädningsfaktor.
- Utjämna RNA koncentrationer och syntetisera cDNA enligt tillverkarens anvisningar med hjälp av RT-PCR-system för första Strand cDNA Synthesis Kit. Somenligt tillverkarens instruktioner, mäta gen-mRNA-nivåer genom realtids-PCR (45 cykler) i ett realtidssystem DNA upptäckt. Normalisera genuttryck nivåer med två hushållning genen till exempel β-aktin och GAPDH.
OBS: Normalisera RNA-koncentration till 500 pg / ml och använd 0,5 pg för cDNA-syntes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi först präglat isolerade murina peritoneala makrofager genom flödescytometri. För att göra detta använde vi (F4 / 80) antikroppar som specifikt känner igen markörer endast uttrycks av makrofager. Denna karakterisering krävs för att bestämma den procentuella andelen av isolerade makrofager och för att skilja dem bland celler erhållna under isoleringsprocessen. Såsom visas i (fig 1), den procentuella andelen celler som uttrycker antigenen F4 / 80 genomgående visat sig vara över 95%. Därefter för att studera genuttryck i makrofager, har de isolerade cellerna som behandlats med flera TLR ligander: Pam3CSK4 (TLR1 / 2), LPS (TLR4) och FSL1 (TLR6 / 2). Därefter tillsattes mRNA-nivåer av hepcidin (Hamp), vår gen av intresse, mätt med RT-PCR. Såsom visas i (fig 2), TLR1 / 2, TLR4 och TLR6 / 2-ligander var i stånd att stimulera hepcidin mRNA i murina makrofager 19. Tillsammans visar dessa resultat användbarheten av detta protokoll för att lyckasly isolera murina peritoneala makrofager och att undersöka exakt molekylär reglering av genuttryck.
Figur 1. Karakterisering av celler isolerade från den peritoneala kaviteten. Anrikning av de utvunna makrofagerna bekräftades genom flödescytometrisk analys med användning av F4 / 80-antikroppen efter blockering icke-specifik färgning med CD16 / CD32-antikroppar och var genomgående visat sig vara över 95%.
Figur 2. TLR ligander inducera hepcidin expression i murina peritoneala makrofager. Efter murina peritoneala makrofager isolering och stimulering med TLR1 / 2, TLR4 och TLR6 / 2-ligander, hepcidin mRNA-nivåer studerades med kvantitativ omvänd transkriptas-polymeraskedjereaktion. Data presenteras som medelvärde ± SEM;nd (ej detekterbar); * P <0,05 jämfört med kontroll (Ctrl). Resultaten är representativa för tre liknande experiment utförda oberoende av varandra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Makrofager är avgörande för överlevnad och ger en frestande mål att manipulera värd för immunologiska mål. Upptäckten av TLRs och andra igenkänningsmolekyler har genomfört makrofagerna till mitten av immunologiska debatt. Makrofager svara på en mängd olika stimuli, inklusive cytokiner, skadeassocierade molekylära mönster molekyler (dämpas) 20 och molekyler som är förknippade med grupper av patogener (PAMPs) 21. Dessa olika stimuli svar representerar loppet av makrofager aktivering, och vanligtvis förknippas med plötsliga förändringar i genuttryck 22.
I icke-inflammatoriska tillstånd, de flesta av makrofager bor i strategiska platser i kroppen. De kan hittas i alla vävnader och som cirkulerar monocyter i blodet. Därför, makrofager är närvarande i de mest mottagliga ställen för mikrobiell invasion.
Den värdförsvar beskrivs som en inflammatory svar på eliminering av intracellulära patogener associerade med klassisk makrofagaktivering. Den klassiska aktivering av makrofager induceras av mikrobiella produkter såsom lipopolysackarider i en Th1 cytokin miljö som kommer att leda till pro-inflammatoriska M1-makrofager polarisering. Den ihållande inflammation resulterar i vävnadsskada och utveckling av anti-inflammatoriska mekanismer som krävs för överlevnad värden. Därför Th2 cytokiner tillåter sedan införandet av antiinflammatoriska M2-makrofager polarisering som hämmar och reglerar M1 svar, och även främjar vävnad reparera. I det protokoll som beskrivs i detta dokument, tioglykollat injektion i bukhålan stimulerar klassiska inflammatoriska kaskaden och leder till rekrytering av M1 makrofager.
Hittills har flera studier utförts med användning av benmärg, mjälte eller peritoneala makrofager. Dessa makrofager representerar heterogeneka populationer med olika aktiviteter. Baserat på deras morfologi och yta molekylära egenskaper, har studier konstaterat att peritoneala makrofager är mer mogen än benmärg och mjälte härrör makrofager 23. Till skillnad från mjälte och bukhinna härledda makrofager, benmärg härledda makrofager utgör en anmärkningsvärd förmåga i pahgocytosis och proliferation och kan vara helt skiljas från makrofag progenitorceller 20,24,25. Dessutom har isolering av benmärgsmakrofager uppvisar en homogen utbyte med lång livslängd. Å andra sidan är dessa makrofager inte helt karaktäriseras och deras användning i experimentella studier visar komplikationer på grund av förgänglighet av deras fenotyp och funktioner 26. Till skillnad från benmärg härledda makrofager, mjälte och bukhinna makrofager verkar vara mer funktionellt och fenotypiskt stabila 23.
Följaktligen isoleringen av murina peritoneala makrofager cen tjänar olika immunologiska studier och genuttryck analys. Dessutom ger musen bukhålan en idealisk plats för skörd residenta makrofager 27. Men den framkallade antalet måttlig och uppskattningsvis omkring 1 x 10 6 makrofager per mus. Således, för att öka skörden av makrofager, framkalla medel såsom tioglykolat injicerades i bukhålan 3 dagar före cellisolering 28. Detta medel kommer att inducera ett inflammatoriskt svar och därmed öka makrofag gröda.
Det är absolut nödvändigt att göra en lätt massage på bukhålan innan du drar långsamt peritonealvätska utan att punktera alla organ. Dra ut den maximala möjliga volym som krävs för att samla den största mobilnummer. Vid blodsmitta, kan en lysisbuffert användas i slutet av förfarandet att göra röda blodkroppar. De framkallade makrofager kan sedan karakteriseras av flödes cytometr y med användning av antikroppar mot antigener som är unika för makrofager som F4 / 80.
Under hela förfarandet, se till att alla reagenser är endotoxin-fria och alla djur var ständigt hålls under specifika patogenfria betingelser. Utföra detta förfarande enligt patogenfria förhållanden är avgörande eftersom makrofagstimulering före hotande experiment kommer att förändra betydligt resultatanalys.
När isolerade, kan peritonealmakrofager användas i flera studier, bland annat produktion av inflammatoriska cytokiner, fagocytos, cellsignalering, genuttryck, kemotaxi och toxikologi 29. Till exempel, efter stimulering med olika TLR ligander, undersökte vi i de framkallade makrofager den molekylära regleringen av en nyckelregulator för järnmetabolism namnges hepcidin. 24 timmar efter cellbehandlingar, isolerades totalt RNA med TRIzol-reagens, och genuttryck analyserades med användning QRT-PCR.
_content "> När vi studerar TLRs aktivering och genuttryck, är användningen av serumfritt DMEM rekommenderas. serumfritt medium minskar graden av föroreningar och eliminera möjliga källor till smittämnen.Om än RNA-isolering verkar en enkel process, måste RNas och DNA-kontaminering undvikas för att förhindra RNA-nedbrytning och uppnå noggranna QRT-PCR-resultat. Det bästa sättet att upptäcka DNA kontaminering är att inkludera en "minus-RT" kontroll för varje RNA-prov i en RT-PCR-experiment. Om en PCR-produkt genereras från ett RNA-prov som inte transkriberades omvänt fter produkten amplifierades från kontaminerande DNA. Vid DNA-kontaminering, är det möjligt att använda DNas-behandling. Emellertid måste DNas vara helt inaktiv före RT-PCR, så att den inte bryts ned nysyntetiserade DNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ett bidrag från naturvetenskaplig och teknisk forskning Council of Canada (NSERC bevilja ingen 298.515-2011). AL är mottagare av en Ph.D. stipendium från naturvetenskaplig och teknisk forskning Council of Canada (NSERC), och MS fick stöd från ett bidrag från den kanadensiska Institutes of Health Research (CIHR bevilja nej. MOP123246).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | Charles River Laboratories, Inc. (Wilmington, MA, USA) | 475 | |
| Thioglycollate | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | 19032-500G | |
| 70% ethanol | |||
| 10% sodium pentobarbital (Used for mice anesthesia (80 mg/kg, i.p.)) | |||
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS), placed on ice and will serve to harvest macrophages | WISENT INC Canada (QC) | 311-425-CL | |
| RPMI medium 1640 (Supplement with penicillin, streptomycin, L-glutamine, and 10 % fetal calf serum). | WISENT INC Canada (QC) | 350-000-CL | |
| 1 and 5 ml syringes | BD USA (NJ) | 309659 | |
| 6-well plates | Corning Incorporated (NY, USA) | MCT-150-C | |
| Bacterial lipoprotein Pam3CSK4 (0.5 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-pm25 | |
| Polyionosine–polycytidylic acid (Poly(I:C)) (10 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-PIC | |
| LPS from Escherichia coli 055:B5 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | L2880 | |
| Purified flagellin from Salmonella typhimurium (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FLIC-10 | |
| Lipoprotein synthetic FSL1 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FSL | |
| ssRNA derived from the HIV-1 long terminal repeat ssRNA40 (1 μg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-LRNA-40 | |
| Type B CpG oligonucleotide ODN1826 (1 μM) | InvivoGen (San Diego, USA) | 11B16-MM | |
| TRIzol | Invitrogen, (Burlington, ON, Canada) | 15596-026 | |
| 20 G and 23 G needles | BD USA (NJ) | 305175 | |
| Scissor | |||
| Forceps | |||
| 50 ml conical tubes placed on ice | Sarstedt (Newton, MA, USA) | 62.547.205 | |
| Red Blood Cells Lysis Buffer | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | R7757-100ML | |
| Refrigerated centrifuge | |||
| Hemocytometer | |||
| F4/80 antibody | BIO-RAD ( CA, USA) | MCA497APC | |
| CD16/CD32 antibodies | Pharmingen, {Mississauga, ON, CA) | 553141 | |
| Flow cytometer | Coulter Epics Elite counter, Coulter, (Hialeah, FL,USA) | ||
| 1.5 ml Eppendorf tubes | Axygen Scietific (CA,USA) | 3516 | |
| Chloroform | Fisher Scientific (ON, Canada) | UN1888 | |
| Isopropyl alcohol | JT Baker (PA, USA) | 70566 | |
| 75% ethanol (in DEPC treated water) | Commercial Alchohols (QC, Canada) | 17394 | |
| 0.01% diethyl pyrocarbonate (DEPC) treated water (let stand overnight and autoclave) | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | 216.542.8 | |
| Omniscript RT-PCR system | Qiagen, (Mississauga, ON, Canada) | 205113 | |
| Rotor Gene 3000 | Montreal Biotech, (Kirkland, QC, Canada) | ||
| QuantiTect SYBR Green I PCR kits | Qiagen, (Mississauga, ON, Canada) | 204141 |
References
- Pollard, J. W. Trophic macrophages in development and disease. Nat Rev Immunol. 9 (4), 259-270 (2009).
- Gordon, S.
- Koury, M. J., Ponka, P. New insights into erythropoiesis: the roles of folate, vitamin B12, and iron. Annu Rev Nutr. 24, 105-131 (2004).
- Sheftel, A. D., Kim, S. F., Ponka, P. Non-heme induction of heme oxygenase-1 does not alter cellular iron metabolism. J Biol Chem. 282 (14), 10480-10486 (2007).
- Hershko, C.
- Collins, H. L. Withholding iron as a cellular defence mechanism--friend or foe. Eur J Immunol. 38 (7), 1803-1806 (2008).
- Noyes, W. D., Bothwell, T. H., Finch, C. A. The role of the reticulo-endothelial cell in iron metabolism. Br J Haematol. 6, 43-55 (1960).
- Layoun, A., Huang, H., Calve, A., Santos, M. M. Toll-like receptor signal adaptor protein MyD88 is required for sustained endotoxin-induced acute hypoferremic response in mice. Am J Pathol. 180 (6), 2340-2350 (2012).
- Zumerle, S., et al. Targeted disruption of hepcidin in the liver recapitulates the hemochromatotic phenotype. Blood. 123 (23), 3646-3650 (2014).
- Nguyen, N. B., Callaghan, K. D., Ghio, A. J., Haile, D. J., Yang, F. Hepcidin expression and iron transport in alveolar macrophages. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 291 (3), L417-L425 (2006).
- Nemeth, E., et al. Hepcidin, a putative mediator of anemia of inflammation, is a type II acute-phase protein. Blood. 101 (7), 2461-2463 (2003).
- Nemeth, E., et al. Hepcidin regulates cellular iron efflux by binding to ferroportin and inducing its internalization. Science. 306 (5704), 2090-2093 (2004).
- Constante, M., et al. Distinct requirements for Hfe in basal and induced hepcidin levels in iron overload and inflammation. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 291 (2), G229-G237 (2006).
- Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. Chapter 14 (Unit 14 11), (2008).
- Ray, A., Dittel, B. N. Isolation of mouse peritoneal cavity cells. J Vis Exp. (35), (2010).
- Leijh, P. C., van Zwet, T. L., ter Kuile, M. N., van Furth, R. Effect of thioglycolate on phagocytic and microbicidal activities of peritoneal macrophages. Infect Immun. 46 (2), 448-452 (1984).
- Dy, M., Debray-Sachs, M., Kamoun, P., Hamburger, J. Effect of thioglycollate on macrophage lysosomal enzymes. Biomedicine. 29 (5), 167-170 (1978).
- Li, Y. M., Baviello, G., Vlassara, H., Mitsuhashi, T. Glycation products in aged thioglycollate medium enhance the elicitation of peritoneal macrophages. J Immunol Methods. 201 (2), 183-188 (1997).
- Layoun, A., Santos, M. M. Bacterial cell wall constituents induce hepcidin expression in macrophages through MyD88 signaling. Inflammation. 35 (4), 1500-1506 (2012).
- Oppenheim, J. J., Yang, D. Alarmins: chemotactic activators of immune responses. Curr Opin Immunol. 17 (4), 359-365 (2005).
- Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. Pathogen recognition and innate immunity. Cell. 124 (4), 783-801 (2006).
- Lang, R., Patel, D., Morris, J. J., Rutschman, R. L., Murray, P. J. Shaping gene expression in activated and resting primary macrophages by IL-10. J Immunol. 169 (5), 2253-2263 (2002).
- Wang, C., et al. Characterization of murine macrophages from bone marrow, spleen and peritoneum. BMC Immunol. 14 (6), (2013).
- Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture. J Cell Physiol. 77 (2), 121-134 (1971).
- Cannon, G. J., Swanson, J. A. The macrophage capacity for phagocytosis. J Cell Sci. 101 (Pt 4), 907-913 (1992).
- Wang, Y., Harris, D. C.
- Edwards, J. P., Zhang, X., Frauwirth, K. A., Mosser, D. M. Biochemical and functional characterization of three activated macrophage populations. J Leukoc Biol. 80 (6), 1298-1307 (2006).
- Hoover, D. L., Nacy, C. A. Macrophage activation to kill Leishmania tropica: defective intracellular killing of amastigotes by macrophages elicited with sterile inflammatory agents. J Immunol. 132 (3), 1487-1493 (1984).
- Schleicher, U., Bogdan, C. Generation culture and flow-cytometric characterization of primary mouse macrophages. Methods Mol Biol. 531, 203-224 (2009).
