Abstract
Durante l'infezione e l'infiammazione, monociti circolanti lasciano il flusso sanguigno e migrare nei tessuti, dove si differenziano in macrofagi. I macrofagi esprimono i recettori di superficie Toll-like (TLR), che riconoscono pattern molecolari conservate attraverso l'evoluzione in una vasta gamma di microrganismi. TLR svolgono un ruolo centrale nella attivazione dei macrofagi, che è di solito associata con l'espressione genica alterazione. I macrofagi sono fondamentali per molte malattie e sono emersi come bersagli attraenti per la terapia. Nel seguente protocollo, si descrive una procedura per isolare i macrofagi peritoneali murini utilizzando medio Thioglycollate di birra. Quest'ultimo incrementare la migrazione dei monociti nel peritoneo, di conseguenza tale da far salire il rendimento dei macrofagi per 10 volte. Diversi studi sono stati condotti utilizzando midollo osseo, milza o peritoneali derivati da macrofagi. Tuttavia, i macrofagi peritoneali hanno dimostrato di essere più maturo sull'isolamento e sono più stabili nella loro funzionalitàlità e fenotipo. Così, macrofagi isolati da murino cavità peritoneale presentano una popolazione importante cella che può servire in diversi studi immunologici e metabolici. Una volta isolato, i macrofagi sono state stimolate con differenti ligandi TLR e di conseguenza l'espressione del gene è stata valutata.
Introduction
Il sistema reticoloendoteliale fagocitica è composto di cellule in vari tessuti ed organi come il midollo osseo, sangue, fegato e milza. I macrofagi sono ampiamente distribuiti in tutto il corpo, dove in particolare partecipano innata e risposte immunitarie per il controllo e le infezioni chiare. Oltre al loro ruolo nella difesa dell'ospite, macrofagi giocano un ruolo importante nella guarigione delle ferite e nel mantenimento dell'omeostasi tissutale 1,2. Inoltre, i macrofagi non sono importanti solo per la funzione immunitaria, ma anche partecipare attivamente nell'omeostasi del ferro 3. Nel corpo, circa il 80% di ferro è presente in emoglobina entro eritrociti, che quando sono senescente fagocitato dai macrofagi 4. Ogni giorno, i macrofagi riciclare 25 mg di ferro eritrociti di derivazione e di fornire il suo trasporto nel plasma 5. Inoltre, durante l'infezione e l'infiammazione, macrofagi pro-infiammatori sequestrano sideremia per ridurre DISPONIBIL ferroty agli agenti patogeni, sia a livello sistemico e locale 6-8. Inoltre, studi hanno dimostrato che i macrofagi e soprattutto epatociti producono un peptide antimicrobico denominato hepcidin che è considerato il principale regolatore del metabolismo del ferro 9, 10. Hepcidin è aumentato principalmente da stimoli infiammatori ed è parzialmente responsabile per il sequestro di ferro in macrofagi su infiammazione cronica 11-13. Come espressione di epcidina in macrofagi non è molto ben compreso, abbiamo studiato il possibile ruolo dei recettori Toll-like (TLR) nel presente regolamento. I TLR si trovano principalmente sui macrofagi e svolgono un ruolo centrale nella loro attivazione. Inoltre, LPS espressione hepcidin indotta nel fegato è dipendente TLR4 13. Pertanto, per eseguire il nostro studio, abbiamo usato un metodo basato sull'isolamento dei macrofagi peritoneali murini.
Linee di cellule macrofagi sono ampiamente utilizzati in stallone macrofagiies; tuttavia la cultura estesa può provocare la perdita di geni e diminuzione delle funzioni immunitarie in queste linee cellulari. Pertanto, l'isolamento dei macrofagi dalla cavità peritoneale è cruciale.
La cavità peritoneale del mouse presenta un luogo ideale per raccogliere i macrofagi 13-15. Isolati macrofagi peritoneali murini sono convenienti per diversi studi riguardanti la loro funzione immunologica. Tuttavia, il numero di macrofagi nel peritoneo è insufficiente per studi approfonditi ed è stimata intorno a 1 x 10 6 macrofagi per topo. Pertanto, per aumentare la produzione di macrofagi, un agente suscitando sterile come tioglicolato stato iniettato nella cavità peritoneale precedente il raccolto cella. Dopo l'iniezione tioglicolato, la resa dei macrofagi per mouse è stato aumentato di 10 volte. Nonostante l'aumento dei macrofagi rendimento, Thioglycollate atti medio di birra come irritante che induce una risposta infiammatoria, con conseguente reclutamento di macrofagi, che may ma non necessario influenzano l'espressione genica. Quindi, un gruppo di controllo costituito da macrofagi non trattata deve essere incluso in ogni esperimento. Nelle nostre mani, espressione di epcidina che è altamente stimolata da infiammazione non è stato rilevato in Thioglycollate non trattato suscitato macrofagi peritoneali. Inoltre, gli studi hanno dimostrato che il tioglicollato di birra recluta numerosi macrofagi, ma non attiva le 16. D'altra parte, tioglicolato di Brewer suscitato macrofagi hanno mostrato un aumento enzima lisosomiale ma una diminuzione uccidendo i microrganismi ingeriti 17. Tuttavia, la capacità dei fagociti non è stata influenzata se confrontato con i macrofagi non suscitato 16.
Una volta coltivate in piatti, i macrofagi peritoneali diventano aderenti, consentendo quindi la loro separazione da altri tipi di cellule isolate dalla cavità peritoneale. Successivamente, i macrofagi isolati si sono sfidati con diversi agonisti TLR.Infine, mRNA è stato estratto dalle cellule in coltura e l'espressione genica è stato analizzato utilizzando reazione inversa quantitativa a catena transcriptasi-polimerasi (qRT-PCR).
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Protocol
Tutte le procedure sono state eseguite in accordo con il Consiglio canadese sugli orientamenti per la cura degli animali, dopo l'approvazione da parte del Comitato istituzionale cura degli animali del Centro de recherche du Centre Hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM).
1. Isolamento, identificazione, e Cultura Murine Peritoneale macrofagi
- Preparare medio tioglicollato 3,8% di birra. Per fare ciò, sospendere 38 g di tioglicollato medie 1.000 ml di acqua distillata. Portare la soluzione ad ebollizione per sciogliere completamente il mezzo. Sterilizzare in autoclave a 121 ° C per 15 min. Memorizza fino a 3 mesi al buio, a temperatura ambiente 18.
NOTA: Eliminare se si sviluppa torbidità che indica una contaminazione batterica. La soluzione può essere conservato fino ad un anno al buio se mantenuto sterile. - Uso 1 ml siringhe allegate a 23 aghi G, iniettare 1 ml di 3,8% Brewer tioglicolato medio nella cavità peritoneale di ogni mouse e attendere per 3 giorni. Utilizzare nuova siringa e l'ago per ogni mouse.
- Anestetizzare topi mediante iniezione intraperitoneale di sodio pentobarbital (100 mg / kg) e eutanasia topi mediante dislocazione cervicale. Verificare il corretto anestesia controllando la frequenza respiratoria. Di solito respirazione rapida indicano che il mouse non è profondamente anestetizzato.
- Lavare l'addome di ciascun topo con il 70% di etanolo. Usando una forbice, effettuare un'incisione laterale lungo la linea mediana inferiore del peritoneo.
- Usando una pinza, tirare indietro la pelle addominale per esporre la pelle peritoneale trasparente. Utilizzando 5 ml siringhe attaccate a 20 aghi G, iniettare 5 ml di DPBS freddi nella cavità peritoneale di ciascun topo.
- Eseguire un leggero massaggio sulla cavità peritoneale e quindi aspirare accuratamente il liquido, senza pungere qualsiasi organo. Rimuovere l'ago e dispensare il liquido peritoneale in 50 ml provette da centrifuga coniche.
- Centrifugare per 10 min a 400 xg in una centrifuga refrigerata.Le cellule devono restare freddo durante l'intera procedura. Gettare il surnatante e pellet cellulare risospendere in mezzo RPMI 1640.
- Utilizzando un emocitometro, contare le cellule e regolare a densità cellulare di 1 x 10 6 cellule / ml.
- Caratterizzare il fenotipo di cellule isolate mediante citometria di flusso con 1 x 10 6 cellule per mouse e antibodie contro F4 / 80 (un antigene di superficie espresso sui macrofagi).
2. trattamenti con le cellule
- Direttamente, dopo l'isolamento, aggiungere 1 x 10 6 cellule in ciascun pozzetto. Lasciare i macrofagi peritoneali murini aderire nelle piastre da 6 pozzetti da loro coltura per 1 a 2 ore a 37 ° C. Rimuovere le cellule non aderenti lavando delicatamente per 3 volte con caldo PBS.
- Successivamente, cellule di coltura in 900 microlitri DMEM privo di siero per 24 ore in presenza dei seguenti ligandi TLR: (Pam3CSK4-TLR1 / 2 (0,5 mg / ml); poli (I: C) -TLR3 (10 mg / ml) ; LPS-TLR4 (100 ng / ml), flagellina-TLR5 (100 ng / ml); FSL1-TLR6 / 2 (100 ng / ml); ssRNA40-TLR7 (1 mg / ml); ODN1826-TLR9 (1 micron).
NOTA: Preparare per ogni legante una soluzione 10x. Aggiungere 100 ml di quest'ultima in ogni pozzetto, eseguendo così una diluizione di 10 volte.
3. RNA Isolation
- Rimuovere tutte le cellule medie e Lisare direttamente nelle piastre a sei pozzetti aggiungendo 1 ml TRIzol a ciascun pozzetto e passando il lisato cellulare più volte attraverso una pipetta. Incubare i campioni omogeneizzati per 5 a 10 min a temperatura ambiente, per consentire la completa dissociazione dei complessi nucleoproteici.
- Trasferire il lisato in 1,5 ml RNasi e microprovette senza DNasi. Aggiungere 0,2 ml di cloroformio per 1 ml TRIzol. Agitare tubi vigorosamente a mano per 15 secondi e incubare a temperatura ambiente per 5-10 minuti. Centrifugare a 12.000 xg per 15 min a 4 ° C. Osservare la miscela separa in una fase rossa (fenolo-cloroformio) inferiore, un interfase e una fase acquosa superiore incolore. RNA rimane esclusivamente nella fase acquosa.
- TranSFER accuratamente la fase acquosa superiore in una nuova provetta senza disturbare l'interfase. Precipitare il RNA da esso mescolando con 0,5 ml di alcool isopropilico. Incubare i campioni a temperatura ambiente per 10 min e centrifugare a 12.000 xg per 10 min a 4 ° C. L'RNA precipitati formare una pallina bianca sul lato e fondo del tubo.
- Rimuovere il surnatante. Lavare il RNA pellet una volta con 1 ml di etanolo al 75%. Miscelare i campioni di vortex e centrifugare a 7.500 xg per 5 minuti a 4 ° C. Brevemente asciugare l'RNA (aria secca per 10 min). Sciogliere RNA in 0.1 ml di DEPC (RNAse acqua gratuita) e incubare per 10 minuti a 55 ° C.
- Quantificare RNA utilizzando uno spettrofotometro. Per fare ciò, diluire i campioni di 100 volte in acqua DEPC e leggere a lunghezze d'onda di 260 nm. La concentrazione di RNA sarà quindi: OD 260 x 40 ng / ul x fattore di diluizione.
- Equalizza concentrazioni di RNA e sintetizzare cDNA secondo le istruzioni del fabbricante, con RT-PCR per First-Strand cDNA Synthesis Kit. Comele istruzioni del produttore, misurare i livelli di gene mRNA di real-time PCR (45 cicli) in un sistema di rilevazione del DNA in tempo reale. Normalizzare i livelli di espressione genica con due gene housekeeping ad esempio β-actina e GAPDH.
NOTA: Normalizzare concentrazione di RNA a 500 mg / ml e 0,5 mg utilizzare per la sintesi del DNA.
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Representative Results
Per prima cosa caratterizzati isolate macrofagi peritoneali murini mediante citometria a flusso. Per farlo, abbiamo utilizzato (F4 / 80) anticorpi che riconoscono specificamente i marcatori espressi solo da parte dei macrofagi. Questa caratterizzazione è necessaria per determinare la percentuale di isolati macrofagi e distinguerli tra cellule ottenute durante il processo di isolamento. Come mostrato in (figura 1), la percentuale di cellule che esprimono l'antigene F4 / 80 è stata costantemente risultata essere superiore al 95%. Quindi, per studiare l'espressione genica in macrofagi, le cellule isolate sono state trattate con diversi ligandi TLR: Pam3CSK4 (TLR1 / 2), LPS (TLR4) e FSL1 (TLR6 / 2). Successivamente, i livelli di mRNA di epcidina (Hamp), il nostro gene di interesse, sono stati misurati mediante RT-PCR. Come mostrato in (figura 2), TLR1 / 2, TLR4 e TLR6 / 2 ligandi erano capaci di stimolare hepcidin mRNA in macrofagi murini 19. Insieme, questi risultati dimostrano l'utilità di questo protocollo per il successoly isolare macrofagi peritoneali murini e di verificare con esattezza la regolazione molecolare dell'espressione genica.
Figura 1. Caratterizzazione di cellule isolate dalla cavità peritoneale. Arricchimento dei macrofagi recuperati è stata confermata mediante analisi citometrica a flusso utilizzando l'anticorpo F4 / 80 dopo il blocco colorazione aspecifica con anticorpi / CD32 CD16 e stato costantemente risultata essere superiore al 95%.
Figura 2. TLR ligandi indurre l'espressione di epcidina in macrofagi peritoneali murini. Dopo murino peritoneale macrofagi isolamento e stimolazione con TLR1 / 2, TLR4 e TLR6 / 2 ligandi, epcidina livelli di mRNA sono stati studiati da reazione a catena della polimerasi transcriptasi inversa quantitativa. I dati sono presentati come media ± SEM;nd (non rilevabile); * P <0,05 rispetto al controllo (Ctrl). I risultati sono rappresentativi di 3 esperimenti simili condotti in modo indipendente.
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Discussion
I macrofagi sono cruciali per la sopravvivenza e fornire un bersaglio allettante per manipolare l'host per obiettivi immunologici. La scoperta di TLR e di altre molecole di riconoscimento hanno condotto i macrofagi al centro del dibattito immunologica. Macrofagi rispondono ad una varietà di stimoli, compresi citochine, molecole danni associati molecolari modello (smorza) 20 e molecole associate a gruppi di patogeni (PAMP) 21. Queste diverse risposte stimoli rappresentano corso dell'attivazione macrofagi, e sono normalmente associati ad alterazioni improvvise nell'espressione genica 22.
In condizioni non infiammatorie, la maggior parte dei macrofagi risiedono in posizioni strategiche nel corpo. Essi possono essere trovati in tutti i tessuti e come circolanti monociti nel sangue. Pertanto, i macrofagi sono presenti nei siti più sensibili alla invasione microbica.
La difesa ospite è descritto come un irisposta nflammatory all'eliminazione di patogeni intracellulari associati attivazione macrofagica classica. L'attivazione dei macrofagi classica è indotta da prodotti microbici come lipopolisaccaridi in un ambiente citochina Th1 che porteranno a pro-infiammatoria M1-macrofagi polarizzazione. La persistenza di risultati infiammazione nel danno tissutale e lo sviluppo di meccanismi anti-infiammatori necessari alla sopravvivenza dell'ospite. Pertanto, citochine Th2 consentono quindi l'introduzione di antinfiammatori M2-macrofagi polarizzazione che inibisce e regola la risposta M1, e promuove anche la riparazione dei tessuti. Nel protocollo descritto in questo documento, tioglicollato iniezione nella cavità peritoneale stimola la cascata infiammatoria classica e porta al reclutamento di macrofagi M1.
Ad oggi, molti studi sono stati condotti utilizzando midollo osseo, milza o peritoneali derivati da macrofagi. Questi macrofagi rappresentano hétérogènepopolazioni OU con diverse attività. Sulla base delle loro caratteristiche morfologiche e di superficie molecolare, gli studi hanno dimostrato che i macrofagi peritoneali sono più maturi di midollo osseo e milza derivato macrofagi 23. A differenza della milza e del peritoneo macrofagi derivati, del midollo osseo macrofagi derivati presentano una notevole capacità di pahgocytosis e proliferazione e può essere completamente differenziate da cellule progenitrici macrofagi 20,24,25. Inoltre, l'isolamento dei macrofagi del midollo osseo presenta una resa omogenea con lunga durata. D'altro canto, questi macrofagi non sono completamente caratterizzati e il loro uso in studi sperimentali presenta complicazioni dovute alla incostanza della loro fenotipo e funzioni 26. A differenza di midollo osseo macrofagi derivati, milza e macrofagi peritoneo sembrano essere più funzionale e fenotipicamente stabile 23.
Pertanto, l'isolamento dei macrofagi peritoneali murini cun servire diversi studi immunologici e analisi di espressione genica. Inoltre, il mouse cavità peritoneale offre un luogo ideale per la raccolta macrofagi residenti 27. Tuttavia, il numero ha suscitato è moderato e la stima è di 1 x 10 6 macrofagi per mouse. Pertanto, per aumentare la raccolta dei macrofagi, agenti suscitando quali tioglicollato è stato iniettato nella cavità peritoneale 3 giorni prima di isolamento cellulare 28. Questo agente può indurre una risposta infiammatoria e di conseguenza aumentare la coltivazione dei macrofagi.
E 'assolutamente necessario effettuare un leggero massaggio sulla cavità peritoneale prima di ritirare lentamente il liquido peritoneale, senza pungere qualsiasi organo. Tirando fuori il volume massimo possibile è necessario per raccogliere il numero di cellule più grande. In caso di contaminazione del sangue, un tampone di lisi può essere utilizzata al termine della procedura per eliminare i globuli rossi. I macrofagi suscitato possono quindi essere caratterizzate da un flusso cytometr y utilizzando anticorpi contro gli antigeni che sono unici per macrofagi come F4 / 80.
Durante tutta la procedura, assicurarsi che tutti i reagenti sono privi di endotossine e tutti gli animali sono stati alloggiati permanentemente in condizioni esenti da organismi patogeni specifici. L'esecuzione di questa procedura in condizioni esenti da organismi patogeni è fondamentale, perché la stimolazione dei macrofagi prima di esperimenti imminenti altererà notevolmente l'analisi dei risultati.
Una volta isolato, i macrofagi peritoneali possono essere utilizzati in diversi studi, tra cui la produzione di citochine infiammatorie, fagocitosi, la segnalazione cellulare, l'espressione genica, la chemiotassi e la tossicologia 29. Ad esempio, dopo stimolazione con differenti ligandi TLR, abbiamo studiato nei macrofagi suscitato la regolazione molecolare di un regolatore chiave del metabolismo del ferro chiamato epcidina. 24 ore dopo trattamenti con le cellule, l'RNA totale è stato isolato con il reagente TRIzol, e l'espressione genica è stato analizzato utilizzando qRT-PCR.
_content "> Come stiamo studiando TLR attivazione e l'espressione genica, si consiglia l'uso del siero DMEM gratuito. mezzo privo di siero riduce il grado di contaminanti e di eliminare qualsiasi fonte potenziale di agenti infettivi.Anche se l'isolamento dell'RNA sembra un processo semplice, RNasi e la contaminazione del DNA devono essere evitate per prevenire la degradazione dell'RNA e ottenere risultati accurati qRT-PCR. Il modo migliore per rilevare la contaminazione del DNA è quello di includere un 'RT-minus' controllo per ogni campione di RNA in un esperimento di RT-PCR. Se un prodotto di PCR è generato da un campione di RNA che non è stato sottoposto a trascrizione inversa quindi il prodotto è stato amplificato dal DNA contaminante. In caso di contaminazione di DNA, è possibile l'uso del trattamento DNasi. Tuttavia, DNasi deve essere completamente inattivato prima della RT-PCR in modo che non si degrada DNA di nuova sintesi.
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Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione da parte scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada (NSERC, concedere senza 298515-2011). AL è il destinatario di un dottorato di ricerca borsa di studio le scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada (NSERC), e MS è stato sostenuto da una sovvenzione da parte del Canadian Institutes of Health Research (CIHR, concessione n. MOP123246).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | Charles River Laboratories, Inc. (Wilmington, MA, USA) | 475 | |
| Thioglycollate | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | 19032-500G | |
| 70% ethanol | |||
| 10% sodium pentobarbital (Used for mice anesthesia (80 mg/kg, i.p.)) | |||
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS), placed on ice and will serve to harvest macrophages | WISENT INC Canada (QC) | 311-425-CL | |
| RPMI medium 1640 (Supplement with penicillin, streptomycin, L-glutamine, and 10 % fetal calf serum). | WISENT INC Canada (QC) | 350-000-CL | |
| 1 and 5 ml syringes | BD USA (NJ) | 309659 | |
| 6-well plates | Corning Incorporated (NY, USA) | MCT-150-C | |
| Bacterial lipoprotein Pam3CSK4 (0.5 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-pm25 | |
| Polyionosine–polycytidylic acid (Poly(I:C)) (10 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-PIC | |
| LPS from Escherichia coli 055:B5 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | L2880 | |
| Purified flagellin from Salmonella typhimurium (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FLIC-10 | |
| Lipoprotein synthetic FSL1 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FSL | |
| ssRNA derived from the HIV-1 long terminal repeat ssRNA40 (1 μg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-LRNA-40 | |
| Type B CpG oligonucleotide ODN1826 (1 μM) | InvivoGen (San Diego, USA) | 11B16-MM | |
| TRIzol | Invitrogen, (Burlington, ON, Canada) | 15596-026 | |
| 20 G and 23 G needles | BD USA (NJ) | 305175 | |
| Scissor | |||
| Forceps | |||
| 50 ml conical tubes placed on ice | Sarstedt (Newton, MA, USA) | 62.547.205 | |
| Red Blood Cells Lysis Buffer | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | R7757-100ML | |
| Refrigerated centrifuge | |||
| Hemocytometer | |||
| F4/80 antibody | BIO-RAD ( CA, USA) | MCA497APC | |
| CD16/CD32 antibodies | Pharmingen, {Mississauga, ON, CA) | 553141 | |
| Flow cytometer | Coulter Epics Elite counter, Coulter, (Hialeah, FL,USA) | ||
| 1.5 ml Eppendorf tubes | Axygen Scietific (CA,USA) | 3516 | |
| Chloroform | Fisher Scientific (ON, Canada) | UN1888 | |
| Isopropyl alcohol | JT Baker (PA, USA) | 70566 | |
| 75% ethanol (in DEPC treated water) | Commercial Alchohols (QC, Canada) | 17394 | |
| 0.01% diethyl pyrocarbonate (DEPC) treated water (let stand overnight and autoclave) | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | 216.542.8 | |
| Omniscript RT-PCR system | Qiagen, (Mississauga, ON, Canada) | 205113 | |
| Rotor Gene 3000 | Montreal Biotech, (Kirkland, QC, Canada) | ||
| QuantiTect SYBR Green I PCR kits | Qiagen, (Mississauga, ON, Canada) | 204141 |
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