Abstract
감염과 염증 동안, 순환 단핵 세포는 혈류를 떠나 그들이 대 식세포로 분화 조직으로 이동한다. 마크로파지는 미생물의 광범위한 발전을 통해 보존 된 분자 패턴을 인식 표면 수신자 같은 수용체 (TLR들)을 표현한다. TLR에 보통 유전자 발현의 변화와 연관된 대 식세포의 활성화에 중요한 역할을 담당한다. 대 식세포는 많은 질병에 중요하며 치료를위한 매력적인 대상으로 등장했다. 다음의 프로토콜에서는 맥주의 매체를 이용하여 티오 글리콜 레이트 뮤린 복막 대 식세포를 분리하는 과정을 설명한다. 후자는 이에 따라이 10 배 식세포 수율을 올릴 것이다, 복막에 단핵 세포 마이그레이션을 높일 것입니다. 몇몇 연구는 골수, 비장 또는 복막 대 식세포 유래를 사용하여 수행되었다. 그러나, 복강 대 식세포는 분리에 따라 더 성숙한 것으로 나타났다과 기능에 더 안정되었다성만 및 표현형. 따라서, 쥐의 복강에서 분리 한 대 식세포는 다른 면역 및 대사 연구에서 봉사 할 수있는 중요한 세포 집단을 제시한다. 격리되면 대 식세포는 다른 TLR 리간드로 자극하고, 결과적으로 유전자 발현을 평가 하였다.
Introduction
세망 내피 식세포 시스템은 골수, 혈액, 간 및 비장 등의 다양한 조직 및 기관에서의 세포로 구성된다. 대 식세포는 광범위하게 그들은 특히 타고난에 참여하고 제어하는 면역 반응과 명확한 감염을 적응 적 신체, 주위에 분포한다. 숙주 방어에서의 역할뿐만 아니라, 대 식세포는 상처 치유 및 조직 1,2- 항상성 유지에 중요한 역할을한다. 또한, 대 식세포는 면역 기능 만 중요한 것이 아니라 적극적으로 철 항상성 3에 참여한다. 체내에서 철의 약 80 %가 노화가 4 대 식세포에 의해 포식되고있는 경우에는, 적혈구 내의 헤모글로빈에 존재한다. 매일, 이러한 대 식세포는 적혈구 유래 철의 25 mg의 재활용 및 플라즈마 (5)에 자사의 전송을 제공한다. 또한, 감염 및 염증 동안 대 식세포 염증성 철 availabili 감소 혈청 철을 격리시키는모두 전신 및 지역 수준 6-8에서 병원균에 타이. 대 식세포 주로 간세포 철 대사 (9), (10)의 마스터 조절기 간주됩니다 hepcidin라는 항균 펩타이드를 생산하는 것이 아니라 연구는 보여 주었다. Hepcidin은 주로 염증 자극에 의해 증가 및 만성 염증 11 ~ 13시 대 식세포 철 격리 부분적으로 책임이있다. 대 식세포에 hepcidin 표현이 잘 이해되지 않습니다, 우리는이 규정에 수신자 같은 수용체의 가능한 역할 (TLR들)을 공부했다. TLR에 주로 대 식세포에서 발견되고 그들의 활성화에 중심적인 역할을한다. 또한, 간에서의 LPS 유도 hepcidin 식 TLR4 (13)에 의존한다. 따라서, 우리의 연구를 실행하도록, 우리는 뮤린 복막 마크로파지의 분리에 기초한 방법을 사용 하였다.
대식 세포주 대체로 대식 스터드에 이용된다이거; 그럼에도 연장 배양 유전자의 손실을 야기하고 이러한 세포주에서 면역 기능을 저하 할 수있다. 따라서, 복강 대 식세포에서의 분리는 매우 중요하다.
마우스 복강 대 식세포 13-15을 수확 할 수있는 이상적인 위치를 제공합니다. 고립 된 쥐의 복강 대 식세포는 면역 기능에 관한 여러 연구 편리합니다. 그러나, 복막의 대 식세포의 수가 방대한 연구 불충분하고, 마우스 당 약 1 × 106 식세포를 추정한다. 따라서, 대 식세포의 출력을 높이기 위해, 예컨대 티오 글리콜 레이트와 같은 멸균 제는 유도 세포 수확 직전 복강 내로 주사 하였다. 티오 글리콜 레이트 주사 후, 마우스 당 식세포의 수율은 10 배 증가 하였다. 대 식세포 수율, 대 식세포의 모집, 엄마의 결과, 염증 반응을 유도하는 자극으로 맥주의 티오 글리콜 레이트 배지 행위의 증가에도 불구하고그러나 Y 불필요 유전자 발현에 영향을 미친다. 따라서, 비 처리 된 대 식세포로 구성된 대조군이 각각의 실험에 포함되어야한다. 우리의 손에, 높은 염증에 의해 자극 hepcidin 표현은 복막 대 식세포를 이끌어 비 처리 티오 글리콜 레이트 검출되지 않았다. 또한, 연구는 맥주의 티오 글리콜 레이트가 많은 대 식세포를 모집하지만 그들에게 (16)을 활성화하지 않는 것으로 나타났습니다. 한편, 맥주의 티오 글리콜 레이트는 대 식세포는 리소좀 효소의 증가하지만 섭취 미생물을 죽이는 17의 감소를 유발 하였다. 비 - 유도 대 식세포와 비교할 때 16 그러나, 탐식 능력은 영향을받지 않았다.
접시에서 배양하면, 복막 마크로파지 따라서 복강으로부터 분리 된 세포의 다른 유형에서 자신의 분리를 허용 부착된다. 이어서, 절연 식세포 다른 TLR에 작용 제로 감염시켰다.마지막의 mRNA는 배양 된 세포로부터 추출하고, 유전자 발현은 정량적 역전사 - 중합 효소 연쇄 반응 (QRT-PCR)을 이용하여 분석 하였다.
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Protocol
모든 절차는 센터 드 공들인 뒤 센터 Hospitalier 드 난 몬트리올 대학교의 기관 동물 관리위원회 (CRCHUM)의 승인 후 동물 관리 지침에 캐나다 문화원에 따라 수행 하였다.
1. 격리, 식별, 문화 쥐 복막 대 식세포의
- 3.8 %의 맥주 티오 글리콜 레이트 매체를 준비합니다. 이렇게 증류수 1,000 mL에 티오 글리콜 레이트 배지 38g을 일시 중단합니다. 완전히 매체를 용해 끓여 솔루션을 가져와. 15 분 동안 121 ° C 오토 클레이브에 의해 멸균. RT 18, 어둠 3 개월까지 보관합니다.
참고 : 탁도가 세균 오염을 나타내는 개발하는 경우 폐기하십시오. 무균 유지 경우 용액을 어둠에서 1 년 동안 유지 될 수있다. - 각각의 양해 각서 (MOU)의 복강에 3.8 % 브루 티오 글리콜 레이트 배지 1 ㎖를 주입, 23 G 바늘에 부착 된 1 ml를 주사기를 사용하여SE는 3 일 기다려. 각 마우스의 새로운 주사기와 바늘을 사용합니다.
- 나트륨 펜토 바르 비탈 (100 ㎎ / ㎏)을 복강 내 주사하여 마우스를 마취하고 경부 탈구에 의해 마우스를 안락사. 호흡을 확인하여 적절한 마취를 확인합니다. 일반적으로 빠른 호흡은 마우스가 깊이 마취되어 있지 않음을 나타냅니다.
- 70 % 에탄올로 각 마우스의 복부를 씻으십시오. 가위를 사용하여, 복막의 하부 중앙선을 따라 횡 절개를 수행한다.
- 집게를 사용하여 투명 복막 피부를 노출 복부 피부를 뒤로 당겨. 20 G 주사 바늘에 연결된 5 ㎖ 주사기를 사용하여, 각각의 마우스의 복강 내로 감기 DPBS 5 ㎖를 주입.
- 복강에 부드러운 마사지를 수행하고있는 기관을 천공하지 않고 신중하게 유체를 대기음. 바늘을 제거하고 50 ML 원뿔 원심 분리기 튜브로 복강 액을 분배.
- 냉장 원심 분리기 400 XG에 10 분 동안 원심 분리기.세포는 전체 과정 동안 차가운 유지한다. RPMI 배지 1640 뜨는에 resuspend 세포 펠렛을 폐기하십시오.
- 혈구를 사용하여 세포를 계수하고 1 × 106 세포 / ml의 세포 밀도로 조정한다.
- F4 / 80과 antibodie 대해 마우스 당 1 × 106 세포를 사용하여 유동 세포 계측법에 의해 분리 된 세포의 표현형을 특성화 (표면 항원은 대 식세포에서 발현).
2. 세포 치료
- 직접, 차단 후, 각 웰에 1 × 10 6 세포를 추가합니다. 37 ℃에서 1 시간 2 그들을 배양하여 6 웰 플레이트에 부착 쥐의 복강 대 식세포를 남겨주세요. 부드럽게 따뜻한 PBS로 3 회 세척하여 비 부착 세포를 제거합니다.
- 이어서, 900 μL의 무 혈청 DMEM에서 배양 세포 다음 TLR 리간드의 존재하에 24 시간 동안 : (Pam3CSK4-TLR1 / 2 (0.5 ㎎ / ㎖), 폴리 (I : C) -TLR3 (10 ㎎ / ㎖) ; LPS-TLR4 (100 NG / ㎖), 편모 - TLR5 (100 NG / ㎖) FSLTLR6 1 / 2 (100 NG / ㎖); ssRNA40-TLR7 (1 μg의 / ㎖); ODN1826-TLR9 (1 μM).
참고 : 각 리간드 10 배 재고 솔루션을 준비합니다. 따라서 10 배 희석을 수행, 각 웰에 후자의 100 μl를 추가합니다.
3. RNA 분리
- 피펫을 통해 여러 번 각 웰에 1 ml의 트리 졸을 첨가하고, 세포 용 해물을 전달하여 6 웰 플레이트에서 직접 모든 매체를 Lyse 세포를 제거한다. 핵 단백질 복합체의 완전한 분리를 허용하도록, RT에서 5 내지 10 분 동안 균질화 된 샘플을 인큐베이션.
- 1.5 ml의에 해물을 전송 RNA 분해 효소와 DNase의 무료 마이크로 원심 튜브. 1 ㎖의 트리 졸 0.2 ml의 클로로포름을 추가합니다. 15 초 동안 손으로 적극적으로 튜브를 흔들 5 ~ 10 분 동안 실온에서 그들을 품어. 4 ℃에서 15 분 동안 12,000 XG에 원심 분리기. 낮은 붉은 단계 (페놀 - 클로로포름)로 분리 혼합물, 계면 무색 위 수성 상을 관찰한다. RNA는 수성 상에 독점적으로 남아있다.
- 트란계면을 방해하지 않고 새로운 튜브에 sfer 조심스럽게 위 수상. 이소 프로필 알콜 0.5 ㎖로 혼합하여 그것에서 RNA를 침전. 4 ℃에서 10 분 동안 12,000 XG에서 10 분간 원심 분리하고 실온에서 샘플을 인큐베이션. RNA는 튜브의 측면 및 저면에 흰 석출물 펠렛을 형성.
- 상층 액을 제거합니다. 75 % 에탄올 1 ㎖로 한 번 RNA 펠렛을 씻으십시오. 4 ℃에서 5 분 동안 7,500 XG에 텍싱 및 원심 분리하여 샘플을 섞는다. 간단히 RNA (10 분 동안 건조 공기)을 건조. 0.1 ml의 DEPC (RNAse가없는 물)에서 RNA를 녹이고 55 ℃에서 10 분 동안 품어.
- 분광 광도계를 사용하여 RNA를 정량화. 이렇게하려면 샘플을 DEPC 물에 100 배 희석하고 260 nm의 파장에서 읽을. RNA 농도는 것입니다 : 외경 260 × 40 NG / UL X 희석 계수를.
- RNA 농도를 균일화하고 첫 번째 가닥의 cDNA 합성 키트에 대한 RT-PCR 시스템을 사용하여 제조업체의 지침에 따라 cDNA를 합성. 으로제조자의 지침에 따라, 실시간 PCR 실시간 DNA 검출 시스템 (45 회)에 의해 유전자의 mRNA 수준을 측정한다. 예 β 액틴 및 GAPDH 두 하우스 키핑 유전자와 유전자 발현 수준을 정상화.
참고 : ml의 500 μg의 /에 RNA 농도를 정상화 및 cDNA 합성 0.5 μg의를 사용합니다.
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Representative Results
우리는 제 1 유동 세포 계측법에 의해 고립 된 쥐의 복강 대 식세포를 특징. 이렇게하려면, 우리는 구체적 만 대 식세포에 의해 표현 마커를 인식 (F4 / 80) 항체를 사용 하였다. 이 특성은 절연 식세포의 백분율을 결정하고, 분리 과정 중 얻어진 세포와 구별 할 필요가있다. (도 1)에 도시 된 바와 같이, 세포의 비율은 F4 / 80이 지속적으로 95 % 초과 인 것으로 밝혀졌다 항원을 발현. 이어서, 대 식세포에서의 유전자 발현을 연구하기 위해, 분리 된 세포는 여러 TLR 리간드로 처리 하였다 : Pam3CSK4 (TLR1 / 2), LPS (TLR4) 및 FSL1 (TLR6 / 2). 이어서, Hepcidin (HAMP), 우리의 관심 유전자의 mRNA 수준을 RT-PCR로 측정 하였다. TLR1 / 2 (도 2)에 도시 된 바와 같이, TLR4와 TLR6 / 2 리간드는 뮤린 대 식세포 19 hepcidin mRNA 발현을 자극 할 수 있었다. 함께, 이러한 결과는 성공이 프로토콜의 유용성을 입증LY는 뮤린 복막 대 식세포를 분리하고 정확하게 유전자 발현의 조절 분자를 조사.
복강 회수 식세포. 보충으로부터 분리 된 세포의도 1 특성화는 CD16 / CD32 항체와 비특이적 염색을 차단 한 후 F4 / 80 항체를 사용하여 유세포 분석으로 확인하고, 지속적으로 95 % 이상이었다.
도 2 TLR은 뮤린 복막 대 식세포에 hepcidin 발현을 유도 리간드. TLR1 / 2 쥐 복막 마크로파지의 분리 및 자극 후 TLR4와 TLR6 / 2 리간드, hepcidin mRNA 수준을 정량적 역전사 - 중합 효소 연쇄 반응에 의해 연구되었다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시하고 있습니다;ND (검출되지 않음) * P <0.05 제어 대 (CTRL). 결과는 독립적으로 수행 3 유사한 실험을 대표한다.
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Discussion
대 식세포는 생존을 위해 매우 중요하다 및 면역 학적 목표에 대한 호스트를 조작 할 수있는 유혹 대상을 제공합니다. TLRs를 인식하고 다른 분자의 발견은 면역 논쟁의 중심 대 식세포를 수행 하였다. 대 식세포는 사이토 카인, 손상 관련 분자 패턴 분자 (감쇠) (20)과 병원균 (PAMPs가) 21 그룹과 연관된 분자를 포함한 다양한 자극에 반응한다. 이러한 다양한 자극 응답은 대 식세포의 활성화 과정을 나타내며, 보통 유전자 발현 (22)에 급격한 변화와 연관된다.
비 염증 상태에서는 대 식세포의 대부분은 체내에서의 전략적 위치에 상주. 그들은 모든 조직 및 혈액 단핵구 순환으로 찾을 수있다. 따라서, 식세포는 미생물 침입에 대해 가장 민감한 부위에 존재한다.
호스트 방어는 내가 설명한다고전 식세포의 활성화와 관련된 세포 내 병원균의 제거에 nflammatory 응답. 대 식세포의 고전적인 활성화는 같은 염증성 M1-식세포 양극화로 이어질 것입니다받은 Th1 사이토 카인 환경에서 리포 폴리 사카 라이드로 미생물 제품에 의해 유도된다. 조직 손상의 염증 결과의 잔류 및 숙주의 생존에 필요한 소염 메커니즘의 개발. 따라서, TH2 사이토 카인은 억제하고 M1 응답을 조절 소염 M2-식세포 편광의 도입을 허용하고, 또한 조직 복구를 촉진한다. 이 문서에 설명 된 프로토콜에서 복강에 주입 티오 글리콜 레이트는 고전적인 염증 폭포를 자극하고 (M1)의 대 식세포의 채용으로 이어집니다.
지금까지 여러 연구는 골수, 비장 또는 복막 대 식세포 유래를 사용하여 수행되었다. 이 대 식세포는 heterogene을 나타냅니다다양한 활동과 OU에 인구. 자신의 형태와 표면 분자 특성에 따라, 연구는 복막 대 식세포는 골수, 비장 유래 대 식세포 (23)보다 더 성숙한 것을 설립했다. 파생 된 대 식세포 비장와 달리 복막, 골수 유래 대 식세포는 pahgocytosis 및 확산에 뛰어난 능력을 제시하고 완전히 식세포 전구 세포 20,24,25 구별 할 수 있습니다. 또한, 골수 대 식세포 분리는 긴 수명을 가진 균질 수율을 제시한다. 한편, 이들 대 식세포는 완전히 특징되지 않으며 실험 연구에서의 용도는 표현형의 변덕에 의한 합병증을 제시하고 26 기능한다. 골수 유래 대 식세포, 비장과 복막 대 식세포와 달리 더 기능적으로 23 표현형 안정 될 것으로 보인다.
뮤린 복막 대 식세포 (C)의 그러므로, 분리다른 면역 학적 연구 및 유전자 발현 분석을 제공. 또한, 마우스 복강 수확 상주 식세포 27 이상적인 위치를 제공한다. 그러나, 유발 된 번호는 중간 및 마우스 1 마리당 1 × 106 개 대 식세포 주변 추정된다. 따라서, 티오 글리콜 레이트가 삼일 세포 격리 28 전에 복강에 주입과 같은 에이전트를 도출, 대 식세포의 수확을 증가시킵니다. 이 에이전트는 염증 반응을 유도하고 그에 따라 대 식세포 작물을 증가시킬 것이다.
그것은 어떤 기관을 천공하지 않고 천천히 복강 액을 인출하기 전에 복강에 부드러운 마사지를 수행하는 것이 필수적이다. 최대 가능한 볼륨을 당기는 것은 가장 큰 휴대폰 번호를 수집해야합니다. 혈액 오염의 경우에, 용해 버퍼는 적혈구를 폐기 절차의 끝에서 이용 될 수있다. 유도 식세포이어서 유동 cytometr 특징으로 할 수있다 Y는 F4 / 80 식세포에 고유 한 항원에 대한 항체를 사용.
절차 전반에 걸쳐, 모든 시약은 독소 무료이며 모든 동물이 영구적으로 특정 병원균이없는 상태에서 보관하고 있는지 확인하십시오. 이전에 임박한 실험에 대 식세포 자극이 크게 결과 분석을 변경하기 때문에 무균 상태에서이 절차를 수행하는 것은 매우 중요하다.
일단 격리 복막 대 식세포 염증성 사이토 카인, 식균 작용, 세포 신호, 유전자 발현, 화학 주성 및 독물학 (29)의 생산을 포함하여 여러 연구에서 사용될 수있다. 예를 들어, 다른 TLR 리간드 자극 후에는 유도 대 식세포에서 철 대사라는 hepcidin의 키 조정기의 분자량 조절을 연구 하였다. 세포 치료 후 24 시간이 총 RNA는 트리 졸 시약으로 고립시키고, 유전자 발현은 QRT-PCR을 사용하여 분석 하였다.
_content "> 우리는 TLR에 활성화 및 유전자 발현을 공부하고있는 바와 같이, 무 혈청 DMEM의 사용을 권장합니다. 무 혈청 배지는 오염 물질의 정도를 감소시키고 전염 물질의 잠재적 인 원인을 제거한다.RNA 분리가 간단한 프로세스를 보인다 긴하지만, DNA의 RNase 및 오염은 RNA의 분해를 방지하고 정확한 QRT-PCR 결과를 달성하기 위해 피해야한다. DNA의 오염을 검출하기위한 가장 좋은 방법은 RT-PCR 실험의 각 RNA 샘플 용 마이너스-RT '제어를 포함하는 것이다. PCR 생성물은 다음 역전사되지 않은 생성물을 오염시키는 DNA 증폭 RNA 샘플로부터 생성되는 경우. DNA 오염의 경우의 DNase 처리의 사용이 가능하다. 이 새로 합성 된 DNA를 저하되지 않도록 그러나, DNase를 완전히 이전의 RT-PCR을 불 활성화해야합니다.
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Acknowledgments
이 작품은 자연 과학 및 캐나다의 공학 연구위원회에서 보조금에 의해 지원되었다 (NSERC, 더 298515-2011을 부여하지 않음). AL은 박사 학위를받는 사람입니다 자연 과학 및 캐나다 (NSERC)의 공학 연구 협의회 및 MS에서 장학금 (, 아니 부여합니다. MOP123246 CIHR) 건강 연구의 캐나다 연구소에서 교부금에서 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | Charles River Laboratories, Inc. (Wilmington, MA, USA) | 475 | |
| Thioglycollate | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | 19032-500G | |
| 70% ethanol | |||
| 10% sodium pentobarbital (Used for mice anesthesia (80 mg/kg, i.p.)) | |||
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS), placed on ice and will serve to harvest macrophages | WISENT INC Canada (QC) | 311-425-CL | |
| RPMI medium 1640 (Supplement with penicillin, streptomycin, L-glutamine, and 10 % fetal calf serum). | WISENT INC Canada (QC) | 350-000-CL | |
| 1 and 5 ml syringes | BD USA (NJ) | 309659 | |
| 6-well plates | Corning Incorporated (NY, USA) | MCT-150-C | |
| Bacterial lipoprotein Pam3CSK4 (0.5 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-pm25 | |
| Polyionosine–polycytidylic acid (Poly(I:C)) (10 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-PIC | |
| LPS from Escherichia coli 055:B5 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | L2880 | |
| Purified flagellin from Salmonella typhimurium (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FLIC-10 | |
| Lipoprotein synthetic FSL1 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FSL | |
| ssRNA derived from the HIV-1 long terminal repeat ssRNA40 (1 μg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-LRNA-40 | |
| Type B CpG oligonucleotide ODN1826 (1 μM) | InvivoGen (San Diego, USA) | 11B16-MM | |
| TRIzol | Invitrogen, (Burlington, ON, Canada) | 15596-026 | |
| 20 G and 23 G needles | BD USA (NJ) | 305175 | |
| Scissor | |||
| Forceps | |||
| 50 ml conical tubes placed on ice | Sarstedt (Newton, MA, USA) | 62.547.205 | |
| Red Blood Cells Lysis Buffer | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | R7757-100ML | |
| Refrigerated centrifuge | |||
| Hemocytometer | |||
| F4/80 antibody | BIO-RAD ( CA, USA) | MCA497APC | |
| CD16/CD32 antibodies | Pharmingen, {Mississauga, ON, CA) | 553141 | |
| Flow cytometer | Coulter Epics Elite counter, Coulter, (Hialeah, FL,USA) | ||
| 1.5 ml Eppendorf tubes | Axygen Scietific (CA,USA) | 3516 | |
| Chloroform | Fisher Scientific (ON, Canada) | UN1888 | |
| Isopropyl alcohol | JT Baker (PA, USA) | 70566 | |
| 75% ethanol (in DEPC treated water) | Commercial Alchohols (QC, Canada) | 17394 | |
| 0.01% diethyl pyrocarbonate (DEPC) treated water (let stand overnight and autoclave) | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | 216.542.8 | |
| Omniscript RT-PCR system | Qiagen, (Mississauga, ON, Canada) | 205113 | |
| Rotor Gene 3000 | Montreal Biotech, (Kirkland, QC, Canada) | ||
| QuantiTect SYBR Green I PCR kits | Qiagen, (Mississauga, ON, Canada) | 204141 |
References
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