Abstract
Under infektion og inflammation, cirkulerende monocytter forlader blodbanen og migrere ind i væv, hvor de differentierer til makrofager. Makrofager ekspres overflade Toll-lignende receptorer (TLRs), som genkender molekylmønstre konserverede gennem evolutionen i en lang række mikroorganismer. TLRs spiller en central rolle i makrofagaktivering som er normalt forbundet med genekspression ændring. Makrofager er kritiske i mange sygdomme og er dukket op som attraktive mål for terapi. I den følgende protokol, beskriver vi en fremgangsmåde til isolering af murine peritoneale makrofager under anvendelse af Brewer thioglycollat medium. Sidstnævnte vil øge monocyt migration til bughinden derfor dette vil øge makrofag udbytte ved 10-fold. Adskillige undersøgelser er blevet udført under anvendelse af knoglemarv, milt eller peritoneale afledte makrofager. Imidlertid blev peritoneale makrofager sig at være mere modne efter isolering og er mere stabile i deres funktionellehed og fænotype. Således makrofager isoleret fra murine peritoneale kavitet præsentere en vigtig cellepopulation, der kan tjene i forskellige immunologiske og metaboliske undersøgelser. Efter isolering blev makrofager stimuleret med forskellige TLR ligander og dermed genekspression blev evalueret.
Introduction
Det retikuloendoteliale fagocytiske system består af celler i forskellige væv og organer, såsom knoglemarv, blod, lever og milt. Makrofager er udførligt fordelt rundt i kroppen, hvor de bl.a. deltage i medfødte og adaptive immunrespons til kontrol og klare infektioner. Ud over deres rolle i vært forsvar, makrofager spiller også en vigtig rolle i sårheling og i at opretholde vævshomeostase 1,2. Desuden makrofager er ikke kun vigtigt at immunforsvaret, men også deltage aktivt i jern homeostase 3. I kroppen, cirka 80% af jern er til stede i hæmoglobin inden erythrocytter, som, når senescent fagocyteres af makrofager 4. Dagligt, disse makrofager genbruge 25 mg erythrocyt-afledte jern og give sin transport ind i plasmaet 5. Øvrigt under infektion og inflammation, pro-inflammatoriske makrofager udskille serum jern til at reducere jern availability til patogener, i begge de systemiske og lokale niveau 6-8. Samt, har undersøgelser vist, at makrofager og især hepatocytter producere et antimikrobielt peptid med navnet hepcidin, der anses skibsføreren regulator af jern metabolisme 9, 10. Hepcidin hovedsageligt steget med inflammatoriske stimuli, og er delvist ansvarlig for jern binding i makrofag på kronisk inflammation 11-13. Som hepcidin udtryk i makrofager ikke er meget godt forstået, vi studerede den mulige rolle af Toll-lignende receptorer (TLRs) i denne regel. De TLRs findes primært på makrofager og spille en central rolle i deres aktivering. Desuden LPS-induceret hepcidin ekspression i leveren er afhængig TLR4 13. Derfor, for at udføre vores undersøgelse, brugte vi en metode baseret på isolering af murine peritoneale makrofager.
Makrofagcellelinier er bredt anvendt i makrofag studerne; alligevel udvidet kultur kan fremprovokere gen tab og nedsat immunfunktioner i disse cellelinier. Således isolering af makrofager fra bughulen er afgørende.
Musen bughulen præsenterer et ideelt sted at høste makrofager 13-15. Isolerede murine peritoneale makrofager er bekvemt for flere undersøgelser vedrørende deres immunologiske funktion. Imidlertid er antallet af makrofager i bughinden er utilstrækkelig til omfattende undersøgelser og skønnes omkring 1 x 10 6 makrofager per mus. Således, at hæve makrofag produktion blev en steril fremkalde middel såsom thioglycollat injiceres i den peritoneale kavitet forud for cellehøst. Efter thioglycollat injektion blev udbyttet af makrofager per mus steg med 10 gange. Trods stigningen i makrofager udbytte, bryggeriets thioglycollat medium fungerer som et irritationsmoment, der inducerer en inflammatorisk reaktion, der resulterer i rekruttering af makrofager, hvilket may men ikke nødvendigt påvirker genekspression. Derfor skal en kontrolgruppe bestående af ikke-behandlede makrofager medtages i hvert forsøg. I vores hænder blev hepcidin udtryk, der er stærkt stimuleret af betændelse ikke påvist i ubehandlet thioglycollat fremkaldte peritoneale makrofager. Desuden har undersøgelser vist, at Brewer thioglycollat rekrutterer mange makrofager, men ikke aktivere dem 16. På den anden side, Brewer thioglycollat fremkaldte makrofager viste en stigning i lysosomale enzym, men et fald i dræbende indtagne mikroorganismer 17. Imidlertid blev den fagocytiske kapacitet ikke påvirket, når sammenlignet med ikke-fremkaldte makrofager 16.
Når dyrket i skåle, de peritoneale makrofager bliver klæbende, derfor tillader deres adskillelse fra andre typer af celler isoleret fra den peritoneale kavitet. Efterfølgende blev de isolerede makrofager udfordret med forskellige TLRs agonister.Endelig blev mRNA ekstraheret fra de dyrkede celler og genekspression blev analyseret ved anvendelse af kvantitativ revers transkriptase-polymerasekædereaktion (QRT-PCR).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med den canadiske Rådet om Animal Care retningslinjer efter godkendelse af den institutionelle Animal Care udvalg for Centre de recherche du Centre Hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM).
1. Isolering, identifikation og Kultur af murint peritonealmakrofager
- Forbered 3,8% bryggeriets thioglycollat medium. For at gøre dette, suspendere 38 g thioglycollat medium i 1.000 ml destilleret vand. Bring løsning i kog for at opløse mediet fuldstændigt. Steriliseres i autoklave ved 121 ° C i 15 min. Gem op til 3 måneder i mørke, ved RT 18.
BEMÆRK: kasseres, hvis udvikles uklarhed hvilket indikerer en bakteriel forurening. Løsningen kan opbevares i op til et år i mørke, hvis de holdes steril. - Anvendelse af 1 ml sprøjter knyttet til 23 g nåle, injiceres 1 ml 3,8% Brewer thioglycollat medium ind i bughulen af hver mouSE og vent i 3 dage. Brug ny sprøjte og nål til hver mus.
- Bedøver mus ved intraperitoneal injektion af natriumpentobarbital (100 mg / kg) og aflive musene ved cervikal dislokation. Bekræft ordentlig bedøvelse ved at kontrollere respirationsfrekvens. Normalt hurtige respirations indikerer, at musen ikke er dybt bedøvet.
- Vask abdomen hver mus med 70% ethanol. Ved hjælp af en saks, udføre en lateral incision langs bunden midterlinjen af bughinden.
- Ved hjælp af en pincet, trække sig tilbage den abdominale hud for at blotlægge den transparente peritoneal hud. Anvendelse af 5 ml sprøjter, der er knyttet til 20 g nåle, injicere 5 ml kold DPBS i bughulen på hver mus.
- Udfør en blid massage på det peritoneale hulrum og derefter opsuge væsken forsigtigt, uden at punktere helst organ. Fjern nålen og dispensere den peritoneale væske i 50 ml koniske centrifugerør.
- Centrifugeres i 10 minutter ved 400 xg i en afkølet centrifuge.Celler skal forblive kold under hele proceduren. Supernatanten kasseres og resuspender cellepelleten i RPMI-medium 1640.
- Anvendelse af et hæmocytometer, tælle celler og tilpasse sig celledensitet til 1 x 10 6 celler / ml.
- Karakterisere fænotypen af isolerede celler ved flowcytometri under anvendelse af 1 x 10 6 celler pr mus og antibodie mod F4 / 80 (et overfladeantigen udtrykkes på makrofager).
2. Cell Behandlinger
- Direkte, efter isolering, tilsættes 1 x 10 6 celler i hver brønd. Efterlad de murine peritoneale makrofager til at klæbe ind i de 6-brønds plader ved at dyrke dem i 1 til 2 timer ved 37 ° C. Fjerne ikke-adhærerende celler ved forsigtigt at vaske 3 gange med varmt PBS.
- Efterfølgende kultur celler i 900 pi serumfrit DMEM i 24 timer i nærvær af følgende TLR ligander: (Pam3CSK4-TLR1 / 2 (0,5 mg / ml); Poly (I: C) -TLR3 (10 mg / ml) ; LPS-TLR4 (100 ng / ml); flagellin-TLR5 (100 ng / ml); FSL1-TLR6 / 2 (100 ng / ml); ssRNA40-TLR7 (1 ug / ml); ODN1826-TLR9 (1 uM).
BEMÆRK: Forbered hver ligand en 10x stamopløsning. Tilsættes 100 pi af sidstnævnte til hver brønd, således at udføre en 10 ganges fortynding.
3. RNA-isolering
- Fjern alle mellem- og lysere celler direkte i seks-brønds plader ved tilsætning af 1 ml TRlzol til hver brønd og passerer cellelysatet flere gange gennem en pipette. Inkuber de homogeniserede prøver i 5 til 10 minutter ved stuetemperatur, for at tillade fuldstændig dissociation af nukleoprotein komplekser.
- Overfør lysat i 1,5 ml RNase- og DNase-fri mikrocentrifugerør. Tilsæt 0,2 ml chloroform pr 1 ml TRlzol. Ryst rør kraftigt i hånden i 15 sekunder og inkubere dem ved stuetemperatur i 5 til 10 min. Centrifuger ved 12.000 xg i 15 minutter ved 4 ° C. Observere blandingen separere i en nedre rød fase (phenol-chloroform), en interfase og et farveløst øvre vandige fase. RNA fortsat udelukkende i den vandige fase.
- TranSfer omhyggeligt den øvre vandige fase til et nyt rør uden at forstyrre interfasen. Udfælde RNA fra det ved blanding med 0,5 ml isopropylalkohol. Inkuber prøver ved stuetemperatur i 10 minutter og centrifugeres ved 12.000 xg i 10 minutter ved 4 ° C. RNA udfældninger danner en hvid pellet på siden og bunden af røret.
- Fjern supernatanten. Vask RNA-pelleten en gang med 1 ml 75% ethanol. Bland prøver ved hvirvelblanding og centrifuger ved 7.500 xg i 5 min ved 4 ° C. Kort fortalt tørre RNA (lufttørre i 10 min). Opløs RNA i 0,1 ml DEPC (RNAse frit vand) og inkuberes i 10 minutter ved 55 ° C.
- Kvantificere RNA ved anvendelse af et spektrofotometer. For at gøre dette, fortyndes prøverne 100 gange i DEPC vand og læse ved bølgelængder på 260 nm. RNA-koncentrationen vil derefter være: OD 260 x 40 ng / ul x fortyndingsfaktor.
- Udligne RNA-koncentrationer og syntetisere cDNA ifølge producentens instruktioner ved anvendelse af RT-PCR System for First-Strand cDNA Synthesis Kit. Sompr fabrikantens anvisninger, måle gen mRNA niveauer ved real-time PCR (45 cykler) i en Real-Time DNA-detektion system. Normalisere genekspression niveauer med to housekeeping gen for eksempel β-actin og GAPDH.
BEMÆRK: Normalize RNA-koncentrationen til 500 ug / ml og anvende 0,5 ug til cDNA-syntese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi først karakteriseret de isolerede murine peritoneale makrofager ved flowcytometri. For at gøre det, vi brugte (F4 / 80) antistoffer, der specifikt genkender markører kun udtrykkes af makrofager. Denne karakteristik er nødvendig for at bestemme procentdelen af isolerede makrofag og til at skelne dem blandt celler opnået under isoleringen processen. Som vist i (figur 1), den procentdel af celler, der udtrykker antigen F4 / 80 blev konsekvent fundet at være over 95%. Dernæst at studere genekspression i makrofager, blev de isolerede celler behandlet med flere TLR ligander: Pam3CSK4 (TLR1 / 2), LPS (TLR4), og FSL1 (TLR6 / 2). Efterfølgende blev mRNA-niveauer af hepcidin (Hamp), vores gen af interesse, målt ved RT-PCR. Som vist i (figur 2), TLR1 / 2, TLR4 og TLR6 / 2-ligander var i stand til at stimulere hepcidin mRNA i murine makrofager 19. Tilsammen viser disse resultater nytten af denne protokol til en succesly isolere murine peritoneale makrofager og til at undersøge præcis den molekylære regulering af genekspression.
Figur 1. Karakterisering af celler isoleret fra den peritoneale kavitet. Berigelse af de udvundne makrofager blev bekræftet ved flowcytometrisk analyse ved anvendelse af F4 / 80-antistof efter blokering uspecifik farvning med CD16 / CD32-antistoffer og konsekvent fundet at være over 95%.
Figur 2. TLR ligander inducerer hepcidin ekspression i murine peritoneale makrofager. Efter murine peritoneale makrofager isolation og stimulering med TLR1 / 2, TLR4 og TLR6 / 2-ligander, hepcidin mRNA-niveauer blev undersøgt ved kvantitativ revers transkriptase-polymerasekædereaktion. Data er præsenteret som gennemsnit ± SEM;nd (ikke detekterbar); * P <0,05 versus kontrol (Ctrl). Resultaterne er repræsentative for 3 lignende eksperimenter udført uafhængigt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Makrofager er afgørende for overlevelse og tilvejebringe en fristende mål at manipulere vært for immunologiske mål. Opdagelsen af TLRs og andre molekyler anerkendelse ledet makrofager til centrum af immunologiske debat. Makrofager reagere på en række stimuli, herunder cytokiner, ødelægge-associeret molekylære mønster molekyler (dæmper) 20 og molekyler, der er forbundet med grupper af patogener (PAMPs) 21. Disse forskellige stimuli reaktioner repræsenterer løbet af makrofager aktivering, og er normalt forbundet med pludselige ændringer i genekspression 22.
I ikke-inflammatoriske tilstande, de fleste af makrofager opholde sig i strategiske steder i kroppen. De findes i alle væv og som cirkulerende monocytter i blodet. Derfor makrofager er til stede i de mest modtagelige steder for mikrobiel invasion.
Værtsforsvaret er beskrevet som en inflammatory reaktion til fjernelse af intracellulære patogener associeret med klassisk makrofagaktivering. Den klassiske aktivering af makrofager induceres af mikrobielle produkter, såsom lipopolysaccharider i en Th1 cytokin miljø, som vil føre til pro-inflammatorisk M1-makrofager polarisering. Den vedvarende inflammation resulterer i vævsbeskadigelse og udvikling af anti-inflammatoriske mekanismer, der er nødvendige for overlevelsen af værten. Derfor Th2-cytokiner tillader derefter at indføre anti-inflammatorisk M2-makrofager polarisering, som inhiberer og regulerer M1 respons, og fremmer også vævsreparation. I protokollen beskrevet i dette dokument, thioglycollat injektion i bughulen stimulerer den klassiske inflammatoriske kaskade og fører til ansættelse af M1 makrofager.
Til dato har flere undersøgelser blevet udført under anvendelse af knoglemarv, milt eller peritoneale afledte makrofager. Disse makrofager repræsenterer heterogeneskellige befolkningsgrupper med forskellige aktiviteter. Baseret på deres morfologi og overflade molekylære karakteristika, har undersøgelser påvist, at peritoneale makrofager er mere modne end knoglemarv og milt afledte makrofager 23. I modsætning til milt og bughinden afledte makrofager, knoglemarv afledte makrofager præsentere en bemærkelsesværdig evne i pahgocytosis og proliferation og kan være helt skelnes fra makrofag progenitorceller 20,24,25. Desuden isolering af knoglemarv makrofager præsenterer en homogen udbytte med lang levetid. På den anden side er disse makrofager ikke fuldt karakteriseret, og deres anvendelse i eksperimentelle undersøgelser viser komplikationer på grund af flygtighed af deres fænotype og funktioner 26. Modsætning knoglemarv afledte makrofager, milt og bughinden makrofager synes at være mere funktionelt og fænotypisk stabile 23.
Dermed isoleringen af murine peritoneale makrofager cen tjener forskellige immunologiske undersøgelser og genekspression analyse. Derudover muse peritoneale hulrum giver et ideelt sted til høst residente makrofager 27. Men den fremkaldte nummer er moderat og anslået omkring 1 x 10 6 makrofager per mus. For således at øge høst af makrofager, fremkalde midler, såsom thioglycollat blev injiceret i det peritoneale hulrum 3 dage før celleisolering 28. Denne agent vil fremkalde en inflammatorisk reaktion, og derfor øge makrofag afgrøde.
Det er bydende nødvendigt at udføre en blid massage på bughulen før tilbagetrækning langsomt peritonealvæske uden at punktere ethvert organ. Trække den maksimale mulige volumen er nødvendig for at indsamle de største celle nummer. I tilfælde af forurening blod, kan en lyseringsbuffer anvendes ved afslutningen af proceduren for at skille røde blodlegemer. De fremkaldte makrofager kan så karakteriseres ved flow cytometr y under anvendelse af antistoffer mod antigener, som er unikke for makrofager som F4 / 80.
Hele proceduren, skal du sørge for, at alle reagenser er endotoksin-fri og alle dyr blev permanent opstaldet under specifikke patogenfrie betingelser. Udfører denne procedure under patogenfrie betingelser er kritisk, fordi makrofag stimulation før forestående eksperimenter vil ændre væsentligt analyseresultaterne.
Når isolerede, kan de peritoneale makrofager bruges i flere undersøgelser, herunder produktion af inflammatoriske cytokiner, fagocytose, cellesignalering, genekspression, kemotaksi og toksikologi 29. For eksempel, efter stimulering med forskellige TLR ligander, vi undersøgt i de fremkaldte makrofager den molekylære regulering af en central regulator af jern metabolisme navngivet hepcidin. 24 timer efter celle behandlinger blev totalt RNA isoleret med TRIzol-reagens, og gen-ekspression blev analyseret under anvendelse QRT-PCR.
_content "> Da vi studerer TLRs aktivering og genekspression, anbefales brug af serum frit DMEM. Serum gratis medium reducerer graden af forurenende stoffer og fjerne potentielle kilder til smitstoffer.Omend RNA-isolering synes en simpel proces, skal RNase og DNA-kontaminering undgås for at forhindre RNA-nedbrydning og opnå nøjagtige QRT-PCR-resultater. Den bedste måde at opdage DNA-kontaminering er at inkludere en "minus-RT 'kontrol for hver RNA prøve i en RT-PCR eksperiment. Hvis et PCR-produkt genereret fra en RNA-prøve, der ikke var revers transkriberet hvorefter produktet blev amplificeret fra kontaminerende DNA. I tilfælde af DNA-kontaminering, er det muligt at anvende DNase-behandling. Imidlertid DNase skal være helt inaktiveres inden RT-PCR, således at det ikke nedsætter nyligt syntetiserede DNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra naturvidenskab og teknik Forskningsråd Canada (NSERC indrømme nogen 298515-2011). AL er modtageren af en Ph.D. legat fra naturvidenskab og teknik Forskningsråd Canada (NSERC), og MS blev støttet af en bevilling fra den canadiske Institutes of Health Research (CIHR indrømme nej. MOP123246).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | Charles River Laboratories, Inc. (Wilmington, MA, USA) | 475 | |
| Thioglycollate | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | 19032-500G | |
| 70% ethanol | |||
| 10% sodium pentobarbital (Used for mice anesthesia (80 mg/kg, i.p.)) | |||
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS), placed on ice and will serve to harvest macrophages | WISENT INC Canada (QC) | 311-425-CL | |
| RPMI medium 1640 (Supplement with penicillin, streptomycin, L-glutamine, and 10 % fetal calf serum). | WISENT INC Canada (QC) | 350-000-CL | |
| 1 and 5 ml syringes | BD USA (NJ) | 309659 | |
| 6-well plates | Corning Incorporated (NY, USA) | MCT-150-C | |
| Bacterial lipoprotein Pam3CSK4 (0.5 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-pm25 | |
| Polyionosine–polycytidylic acid (Poly(I:C)) (10 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-PIC | |
| LPS from Escherichia coli 055:B5 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | L2880 | |
| Purified flagellin from Salmonella typhimurium (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FLIC-10 | |
| Lipoprotein synthetic FSL1 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FSL | |
| ssRNA derived from the HIV-1 long terminal repeat ssRNA40 (1 μg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-LRNA-40 | |
| Type B CpG oligonucleotide ODN1826 (1 μM) | InvivoGen (San Diego, USA) | 11B16-MM | |
| TRIzol | Invitrogen, (Burlington, ON, Canada) | 15596-026 | |
| 20 G and 23 G needles | BD USA (NJ) | 305175 | |
| Scissor | |||
| Forceps | |||
| 50 ml conical tubes placed on ice | Sarstedt (Newton, MA, USA) | 62.547.205 | |
| Red Blood Cells Lysis Buffer | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | R7757-100ML | |
| Refrigerated centrifuge | |||
| Hemocytometer | |||
| F4/80 antibody | BIO-RAD ( CA, USA) | MCA497APC | |
| CD16/CD32 antibodies | Pharmingen, {Mississauga, ON, CA) | 553141 | |
| Flow cytometer | Coulter Epics Elite counter, Coulter, (Hialeah, FL,USA) | ||
| 1.5 ml Eppendorf tubes | Axygen Scietific (CA,USA) | 3516 | |
| Chloroform | Fisher Scientific (ON, Canada) | UN1888 | |
| Isopropyl alcohol | JT Baker (PA, USA) | 70566 | |
| 75% ethanol (in DEPC treated water) | Commercial Alchohols (QC, Canada) | 17394 | |
| 0.01% diethyl pyrocarbonate (DEPC) treated water (let stand overnight and autoclave) | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | 216.542.8 | |
| Omniscript RT-PCR system | Qiagen, (Mississauga, ON, Canada) | 205113 | |
| Rotor Gene 3000 | Montreal Biotech, (Kirkland, QC, Canada) | ||
| QuantiTect SYBR Green I PCR kits | Qiagen, (Mississauga, ON, Canada) | 204141 |
References
- Pollard, J. W. Trophic macrophages in development and disease. Nat Rev Immunol. 9 (4), 259-270 (2009).
- Gordon, S.
- Koury, M. J., Ponka, P. New insights into erythropoiesis: the roles of folate, vitamin B12, and iron. Annu Rev Nutr. 24, 105-131 (2004).
- Sheftel, A. D., Kim, S. F., Ponka, P. Non-heme induction of heme oxygenase-1 does not alter cellular iron metabolism. J Biol Chem. 282 (14), 10480-10486 (2007).
- Hershko, C.
- Collins, H. L. Withholding iron as a cellular defence mechanism--friend or foe. Eur J Immunol. 38 (7), 1803-1806 (2008).
- Noyes, W. D., Bothwell, T. H., Finch, C. A. The role of the reticulo-endothelial cell in iron metabolism. Br J Haematol. 6, 43-55 (1960).
- Layoun, A., Huang, H., Calve, A., Santos, M. M. Toll-like receptor signal adaptor protein MyD88 is required for sustained endotoxin-induced acute hypoferremic response in mice. Am J Pathol. 180 (6), 2340-2350 (2012).
- Zumerle, S., et al. Targeted disruption of hepcidin in the liver recapitulates the hemochromatotic phenotype. Blood. 123 (23), 3646-3650 (2014).
- Nguyen, N. B., Callaghan, K. D., Ghio, A. J., Haile, D. J., Yang, F. Hepcidin expression and iron transport in alveolar macrophages. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 291 (3), L417-L425 (2006).
- Nemeth, E., et al. Hepcidin, a putative mediator of anemia of inflammation, is a type II acute-phase protein. Blood. 101 (7), 2461-2463 (2003).
- Nemeth, E., et al. Hepcidin regulates cellular iron efflux by binding to ferroportin and inducing its internalization. Science. 306 (5704), 2090-2093 (2004).
- Constante, M., et al. Distinct requirements for Hfe in basal and induced hepcidin levels in iron overload and inflammation. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 291 (2), G229-G237 (2006).
- Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. Chapter 14 (Unit 14 11), (2008).
- Ray, A., Dittel, B. N. Isolation of mouse peritoneal cavity cells. J Vis Exp. (35), (2010).
- Leijh, P. C., van Zwet, T. L., ter Kuile, M. N., van Furth, R. Effect of thioglycolate on phagocytic and microbicidal activities of peritoneal macrophages. Infect Immun. 46 (2), 448-452 (1984).
- Dy, M., Debray-Sachs, M., Kamoun, P., Hamburger, J. Effect of thioglycollate on macrophage lysosomal enzymes. Biomedicine. 29 (5), 167-170 (1978).
- Li, Y. M., Baviello, G., Vlassara, H., Mitsuhashi, T. Glycation products in aged thioglycollate medium enhance the elicitation of peritoneal macrophages. J Immunol Methods. 201 (2), 183-188 (1997).
- Layoun, A., Santos, M. M. Bacterial cell wall constituents induce hepcidin expression in macrophages through MyD88 signaling. Inflammation. 35 (4), 1500-1506 (2012).
- Oppenheim, J. J., Yang, D. Alarmins: chemotactic activators of immune responses. Curr Opin Immunol. 17 (4), 359-365 (2005).
- Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. Pathogen recognition and innate immunity. Cell. 124 (4), 783-801 (2006).
- Lang, R., Patel, D., Morris, J. J., Rutschman, R. L., Murray, P. J. Shaping gene expression in activated and resting primary macrophages by IL-10. J Immunol. 169 (5), 2253-2263 (2002).
- Wang, C., et al. Characterization of murine macrophages from bone marrow, spleen and peritoneum. BMC Immunol. 14 (6), (2013).
- Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture. J Cell Physiol. 77 (2), 121-134 (1971).
- Cannon, G. J., Swanson, J. A. The macrophage capacity for phagocytosis. J Cell Sci. 101 (Pt 4), 907-913 (1992).
- Wang, Y., Harris, D. C.
- Edwards, J. P., Zhang, X., Frauwirth, K. A., Mosser, D. M. Biochemical and functional characterization of three activated macrophage populations. J Leukoc Biol. 80 (6), 1298-1307 (2006).
- Hoover, D. L., Nacy, C. A. Macrophage activation to kill Leishmania tropica: defective intracellular killing of amastigotes by macrophages elicited with sterile inflammatory agents. J Immunol. 132 (3), 1487-1493 (1984).
- Schleicher, U., Bogdan, C. Generation culture and flow-cytometric characterization of primary mouse macrophages. Methods Mol Biol. 531, 203-224 (2009).
