Abstract
Durante la infección y la inflamación, los monocitos circulantes abandonan el torrente sanguíneo y migran hacia los tejidos, donde se diferencian en macrófagos. Los macrófagos expresan receptores de superficie de tipo Toll (TLRs), que reconocen patrones moleculares conservados a través de la evolución en una amplia gama de microorganismos. TLRs jugar un papel central en la activación de macrófagos que generalmente se asocia con la alteración de la expresión génica. Los macrófagos son críticos en muchas enfermedades y se han convertido en objetivos atractivos para la terapia. En el siguiente protocolo, se describe un procedimiento para aislar los macrófagos peritoneales murinos utilizando medio de tioglicolato de Brewer. Este último será impulsar la migración de monocitos en el peritoneo, en consecuencia esto elevará el rendimiento de los macrófagos por 10 veces. Varios estudios se han llevado a cabo utilizando la médula ósea, el bazo o peritoneales macrófagos derivados. Sin embargo, los macrófagos peritoneales se mostró a ser más maduro tras el aislamiento y son más estables en su funcionaldad y fenotipo. Por lo tanto, los macrófagos aislados de la cavidad peritoneal murino presentan una importante población de células que pueden servir en diferentes estudios inmunológicos y metabólicos. Una vez aislado, los macrófagos fueron estimulados con diferentes ligandos de TLR y en consecuencia se evaluó la expresión génica.
Introduction
El sistema reticuloendotelial fagocítica se compone de células en diversos tejidos y órganos tales como la médula ósea, la sangre, el hígado y el bazo. Los macrófagos se distribuyen ampliamente en todo el cuerpo, donde principalmente participan en innata y adaptativa la respuesta inmune para controlar las infecciones y claros. Además de su papel en la defensa del huésped, los macrófagos también juegan un papel importante en la cicatrización de heridas y en el mantenimiento de la homeostasis del tejido 1,2. Además, los macrófagos no sólo son importantes para la función inmune, pero también participan activamente en la homeostasis del hierro 3. En el cuerpo, aproximadamente 80% de hierro está presente en la hemoglobina dentro de los eritrocitos, que cuando senescentes son fagocitadas por los macrófagos 4. Todos los días, estos macrófagos reciclan 25 mg de hierro eritrocitos derivados y proporcionar su transporte en el plasma 5. Por otra parte, durante la infección y la inflamación, los macrófagos pro-inflamatorias secuestran hierro sérico para reducir DISPONIBIL hierrodad a los patógenos, tanto a nivel sistémico y local 6-8. Además, los estudios han demostrado que los macrófagos y principalmente los hepatocitos producen un péptido antimicrobiano llamado hepcidina que es considerado el maestro regulador del metabolismo del hierro 9, 10. La hepcidina se incrementa principalmente por estímulos inflamatorios y es parcialmente responsable de secuestro de hierro en los macrófagos en inflamación crónica 11-13. Como expresión de hepcidina en los macrófagos no se entiende muy bien, hemos estudiado el posible papel de los receptores tipo Toll (TLR) en este reglamento. Los TLRs se encuentran principalmente en los macrófagos y juegan un papel central en su activación. Además, LPS expresión de hepcidina inducida en el hígado es dependiente de TLR4 13. Por lo tanto, para ejecutar nuestro estudio, hemos utilizado un método basado en el aislamiento de macrófagos peritoneales murinos.
Líneas celulares de macrófagos se utilizan ampliamente en espárrago macrófagoss; no obstante, la cultura extendida puede provocar la pérdida de genes y la disminución de las funciones inmunes en estas líneas celulares. Por lo tanto, el aislamiento de los macrófagos de la cavidad peritoneal es crucial.
La cavidad peritoneal de ratón presenta un sitio ideal para cosechar los macrófagos 13-15. Macrófagos peritoneales murinos aislados son convenientes para varios estudios con respecto a su función inmunológica. Sin embargo, el número de macrófagos en el peritoneo es insuficiente para estudios extensos y se estima alrededor de 1 x 10 6 macrófagos por ratón. Por lo tanto, para aumentar la producción de macrófagos, un agente de provocar estéril tal como tioglicolato se inyectó en la cavidad peritoneal anterior a la cosecha de células. Después de la inyección de tioglicolato, el rendimiento de los macrófagos por ratón se incrementó en 10 veces. A pesar del aumento en los macrófagos rendimiento, tioglicolato actos medianas de cerveza como un irritante que induce una respuesta inflamatoria, lo que resulta en el reclutamiento de macrófagos, que may pero no es necesario afectar a la expresión génica. Por lo tanto, un grupo de control que consiste en macrófagos no tratados debe ser incluido en cada experimento. En nuestras manos, la expresión de hepcidina que está muy estimulada por la inflamación no se detectó en tioglicolato no tratado provocada macrófagos peritoneales. Por otra parte, los estudios han demostrado que tioglicolato de Brewer recluta numerosos macrófagos, pero no activa ellos 16. Por otro lado, tioglicolato de Brewer suscitó macrófagos mostraron un aumento en la enzima lisosomal, pero una disminución en matar microorganismos ingeridos 17. Sin embargo, la capacidad fagocítica no se vio afectada en comparación con los macrófagos no-suscitó 16.
Una vez cultivadas en platos, los macrófagos peritoneales se convierten adherente, por lo tanto permitiendo su separación de otro tipo de células aisladas de la cavidad peritoneal. Posteriormente, los macrófagos aislados fueron desafiados con diferentes agonistas de TLR.Finalmente, el ARNm se extrajo de las células cultivadas y la expresión génica se analizó mediante reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa (QRT-PCR).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con el Consejo Canadiense de Cuidado de Animales directrices después de la aprobación por el Comité institucional Cuidado de Animales del Centre de recherche du Centre Hospitalier de la Universidad de Montreal (CRCHUM).
1. El aislamiento, identificación, y Cultura de Murino macrófagos peritoneales
- Preparar medio tioglicolato 3,8% de cerveza. Para ello, suspender 38 g de tioglicolato medio en 1000 ml de agua destilada. Llevar a hervir solución para disolver completamente el medio. Esterilizar en autoclave a 121 ° C durante 15 minutos. Almacene hasta 3 meses en la oscuridad, a temperatura ambiente 18.
NOTA: Desechar si la turbidez se desarrolla lo que indica una contaminación bacteriana. La solución puede conservarse durante un máximo de un año en la oscuridad si se mantiene estéril. - Uso de 1 ml jeringas unidas a agujas 23 G, inyectar 1 ml de 3,8% de tioglicolato de Brewer medio en la cavidad peritoneal de cada mouse y esperar durante 3 días. Use nueva jeringa y la aguja para cada ratón.
- Anestesiar los ratones por inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (100 mg / kg) y la eutanasia a los ratones por dislocación cervical. Confirmar anestesia adecuada marcando la frecuencia respiratoria. Por lo general, las respiraciones rápidas indican que el ratón no está profundamente anestesiado.
- Lavar el abdomen de cada ratón con etanol al 70%. Usando una tijera, realizar una incisión lateral a lo largo de la línea media inferior de la peritoneo.
- Usando unas pinzas, tire hacia atrás la piel del abdomen para exponer la piel peritoneal transparente. Uso de 5 ml jeringas unidas a agujas 20 G, inyectar 5 ml de DPBS frío en la cavidad peritoneal de cada ratón.
- Realizar un masaje suave en la cavidad peritoneal y luego aspirar el líquido cuidadosamente sin perforar cualquier órgano. Retire la aguja y dispensar el líquido peritoneal en 50 ml tubos de centrífuga cónicos.
- Centrifugar durante 10 min a 400 xg en una centrífuga refrigerada.Las células deben mantenerse frío durante todo el procedimiento. Desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento de células en medio RPMI 1640.
- Utilizando un hemocitómetro, contar las células y adaptarse a la densidad de células a 1 x 10 6 células / ml.
- Caracterizar el fenotipo de células aisladas por citometría de flujo utilizando 1 x 10 6 células por ratón y antibodie contra F4 / 80 (un antígeno de superficie expresada en macrófagos).
2. Tratamientos Celulares
- Directamente, después del aislamiento, agregue 1 x 10 6 células en cada pocillo. Deje los macrófagos peritoneales murinos para adherirse a las placas de 6 pocillos cultivándolas durante 1 a 2 horas a 37 ° C. Retire las células no adherentes lavando suavemente 3 veces con PBS caliente.
- Posteriormente, las células de cultivo de 900 l DMEM libre de suero durante 24 horas en la presencia de los siguientes ligandos TLR: (Pam3CSK4-TLR1 / 2 (0,5 mg / ml); Poly (I: C) -TLR3 (10 mg / ml) ; LPS-TLR4 (100 ng / ml); flagelina-TLR5 (100 ng / ml); FSL1-TLR6 / 2 (100 ng / ml); ssRNA40-TLR7 (1 mg / ml); ODN1826-TLR9 (1 M).
NOTA: Prepararse para cada ligando una solución 10x. Añadir 100 l de este último a cada pocillo, realizando así una dilución de 10 veces.
3. Aislamiento de ARN
- Eliminar todas las células medianas y lisan directamente en las placas de seis pocillos mediante la adición de 1 ml de TRIzol a cada pocillo y el lisado celular que pasa varias veces a través de una pipeta. Incubar las muestras homogeneizadas durante 5 a 10 min a TA, para permitir la disociación completa de los complejos de nucleoproteína.
- Traslado lisado en 1,5 ml RNasa y tubos de microcentrífuga-DNasa libre. Añadir 0,2 ml de cloroformo por TRIzol 1 ml. Agitar los tubos vigorosamente a mano durante 15 segundos e incubar ellos a TA durante 5 a 10 min. Centrifugar a 12000 xg durante 15 min a 4 ° C. Observar la mezcla se separa en una fase roja (fenol-cloroformo) inferior, una interfase y una fase acuosa superior incoloro. ARN permanece exclusivamente en la fase acuosa.
- TranSfer cuidadosamente la fase acuosa superior a un tubo nuevo sin perturbar la interfase. Precipitar el RNA de ella por la mezcla con 0,5 ml de alcohol isopropílico. Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 10 min y se centrifuga a 12.000 xg durante 10 min a 4 ° C. El ARN precipitados de la formación de un sedimento blanco en el lado y la parte inferior del tubo.
- Eliminar el sobrenadante. Lavar el pellet de ARN una vez con 1 ml de etanol al 75%. Mezclar las muestras mediante vórtex y centrifugar a 7500 xg durante 5 min a 4 ° C. Brevemente secar el ARN (secar al aire durante 10 min). Disolver ARN en 0,1 ml de DEPC (RNasa libre de agua) y se incuba durante 10 minutos a 55 ° C.
- Cuantificar ARN usando un espectrofotómetro. Para ello, diluir las muestras 100 veces en agua DEPC y leer en longitudes de onda de 260 nm. La concentración de ARN será entonces: OD 260 x 40 / ul x factor de dilución ng.
- Igualar las concentraciones de ARN y síntesis de ADNc según las instrucciones del fabricante utilizando RT-PCR System para Kit primer capítulo de síntesis de cDNA. Comosegún las instrucciones del fabricante, medir los niveles de ARNm de genes por PCR en tiempo real (45 ciclos) en un sistema de detección de ADN en tiempo real. Normalizar los niveles de expresión de genes con genes de dos de limpieza, por ejemplo, β-actina y GAPDH.
NOTA: Normalizar la concentración de ARN a 500 mg / ml y 0,5 mg usar para la síntesis de ADNc.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En primer lugar, caracterizamos los macrófagos peritoneales murinos aislados por citometría de flujo. Para ello, hemos utilizado (F4 / 80) anticuerpos que reconocen específicamente marcadores única expresadas por los macrófagos. Se requiere esta caracterización para determinar el porcentaje de aislado de macrófagos y distinguirlos entre células obtenidas durante el proceso de aislamiento. Como se muestra en la (Figura 1), el porcentaje de células que expresan el antígeno F4 / 80 fue encontrado consistentemente a estar por encima de 95%. A continuación, para estudiar la expresión génica en macrófagos, las células aisladas fueron tratados con varios ligandos de TLR: Pam3CSK4 (TLR1 / 2), LPS (TLR4) y FSL1 (TLR6 / 2). Posteriormente, los niveles de mRNA de hepcidina (Hamp), nuestro gen de interés, se midieron por RT-PCR. Como se muestra en la (Figura 2), TLR1 / 2, TLR4 y TLR6 / 2 ligandos fueron capaces de estimular mRNA de hepcidina en macrófagos murinos 19. En conjunto, estos resultados demuestran la utilidad de este protocolo para el éxitoly aislar macrófagos peritoneales murinos y para investigar con precisión la regulación molecular de la expresión génica.
Figura 1. Caracterización de células aisladas de la cavidad peritoneal. Enriquecimiento de los macrófagos recuperados se confirmó por análisis de citometría de flujo usando el anticuerpo F4 / 80 después de bloquear la tinción inespecífica con anticuerpos / CD32 CD16 y se encontró consistentemente a estar por encima de 95%.
Figura 2. TLR ligandos inducir la expresión de hepcidina en los macrófagos peritoneales murinos. Después murino aislamiento macrófagos peritoneal y la estimulación con TLR1 / 2, TLR4 y TLR6 / 2 ligandos, hepcidina niveles de mRNA fueron estudiados por reacción inversa cuantitativa cadena de la polimerasa con transcriptasa. Los datos se presentan como media ± SEM;nd (no detectable); * P <0,05 versus control (Ctrl). Los resultados son representativos de 3 experimentos similares realizados de forma independiente.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Los macrófagos son cruciales para la supervivencia y proporcionan un objetivo tentador para manipular el anfitrión de objetivos inmunológicos. El descubrimiento de TLRs y otras moléculas de reconocimiento han llevado a cabo los macrófagos para el centro de debate inmunológica. Los macrófagos responden a una variedad de estímulos, incluyendo citoquinas, moléculas de daño asociado moleculares patrón (20) amortigua y moléculas asociadas con grupos de patógenos (PAMPs) 21. Estas respuestas diferentes estímulos representan el curso de la activación de los macrófagos, y por lo general se asocian con alteraciones repentinas en la expresión génica 22.
En condiciones no inflamatorias, la mayoría de los macrófagos residen en ubicaciones estratégicas en el cuerpo. Se pueden encontrar en todos los tejidos y, como monocitos circulantes en la sangre. Por lo tanto, los macrófagos están presentes en los sitios más susceptibles a la invasión microbiana.
La defensa del huésped se describe como una inflammatory respuesta a la eliminación de patógenos intracelulares asociados con la activación de macrófagos clásica. La activación clásica de macrófagos es inducida por los productos microbianos, tales como lipopolisacáridos en un entorno de citoquinas Th1 que conducirán a pro-inflamatoria M1-macrófagos polarización. La persistencia de los resultados de la inflamación en el daño tisular y el desarrollo de mecanismos anti-inflamatorias necesarias para la supervivencia del huésped. Por lo tanto, citocinas Th2 permiten entonces la introducción de anti-inflamatoria M2-macrófagos polarización que inhibe y regula la respuesta M1, y también promueve la reparación de tejidos. En el protocolo descrito en este documento, tioglicolato de inyección en la cavidad peritoneal estimula la cascada inflamatoria clásica y conduce al reclutamiento de macrófagos M1.
Hasta la fecha, varios estudios se han llevado a cabo utilizando la médula ósea, el bazo o peritoneales macrófagos derivados. Estos macrófagos representan hétérogènesas poblaciones con diferentes actividades. Sobre la base de sus características de morfología y de la superficie molecular, estudios han establecido que los macrófagos peritoneales son más maduros de la médula ósea y el bazo macrófagos derivados 23. A diferencia de bazo y peritoneo macrófagos derivados, médula ósea macrófagos derivados presentan una notable capacidad de pahgocytosis y la proliferación y pueden ser totalmente diferenciadas a partir de células progenitoras de macrófagos 20,24,25. Además, el aislamiento de los macrófagos de la médula ósea presenta un rendimiento homogéneo con larga vida útil. Por otro lado, estos macrófagos no están completamente caracterizados y su uso en estudios experimentales presenta complicaciones debido a la inconstancia de su fenotipo y funciones 26. A diferencia de la médula ósea, el bazo macrófagos derivados y macrófagos peritoneo parecen ser más funcional y fenotípicamente estables 23.
Por lo tanto, el aislamiento de los macrófagos peritoneales murinos cun servir a diferentes estudios inmunológicos y análisis de la expresión génica. Además, la cavidad peritoneal del ratón proporciona un sitio ideal para los macrófagos residentes cosecha 27. Sin embargo, el número suscitó es moderada y se estima alrededor de 1 x 10 6 macrófagos por ratón. Por lo tanto, para aumentar la cosecha de los macrófagos, los agentes tales como la obtención de tioglicolato se inyectó en la cavidad peritoneal 3 días antes del aislamiento celular 28. Este agente inducir una respuesta inflamatoria y en consecuencia aumentar cultivos de macrófagos.
Es imprescindible realizar un masaje suave en la cavidad peritoneal antes de retirar lentamente el líquido peritoneal sin perforar cualquier órgano. Sacando el volumen máximo posible es necesario para recoger el número de células más grande. En caso de contaminación de la sangre, un tampón de lisis se puede utilizar al final del procedimiento para descartar las células rojas de la sangre. Los macrófagos pueden ser provocados caracterizan por cytometr flujo y el uso de anticuerpos contra antígenos que son únicos para macrófagos como F4 / 80.
Durante todo el procedimiento, asegúrese de que todos los reactivos están libres de endotoxinas y todos los animales fueron alojados permanentemente en condiciones libres de patógenos específicos. La ejecución de este procedimiento en condiciones libres de patógenos es fundamental porque la estimulación de los macrófagos antes de los experimentos inminentes alterará significativamente el análisis de resultados.
Una vez aislado, los macrófagos peritoneales se pueden utilizar en varios estudios, incluyendo la producción de citoquinas inflamatorias, la fagocitosis, la señalización celular, la expresión génica, la quimiotaxis y la toxicología 29. Por ejemplo, después de la estimulación con diferentes ligandos de TLR, se investigó en los macrófagos suscitado la regulación molecular de un regulador clave del metabolismo del hierro llamada hepcidina. 24 hr después de los tratamientos de células, el ARN total se aisló con reactivo TRIzol, y la expresión génica se analizó mediante qRT-PCR.
_content "> Como estamos estudiando la activación TLRs y la expresión génica, se recomienda el uso de DMEM sin suero. medio libre de suero reduce el grado de contaminantes y eliminar cualquier fuente potencial de agentes infecciosos.Aunque el aislamiento de ARN parece un proceso simple, RNasa y la contaminación de ADN se deben evitar para prevenir la degradación del ARN y lograr resultados precisos QRT-PCR. La mejor manera de detectar la contaminación de ADN es incluir un "RT-minus 'de control para cada muestra de ARN en un experimento de RT-PCR. Si un producto de la PCR se genera a partir de una muestra de ARN que no se transcribió inversamente a continuación, el producto se amplificó a partir de ADN contaminante. En caso de contaminación de ADN, el uso de tratamiento con DNasa es posible. Sin embargo, DNasa debe estar completamente inactivado antes de la RT-PCR de modo que no se degrada el ADN recién sintetizado.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por una beca de Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá (NSERC, conceder ninguna 298.515-2011). AL es el destinatario de un Ph.D. beca de Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá (NSERC) y MS fue apoyado por una subvención de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR, subvención no. MOP123246).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | Charles River Laboratories, Inc. (Wilmington, MA, USA) | 475 | |
| Thioglycollate | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | 19032-500G | |
| 70% ethanol | |||
| 10% sodium pentobarbital (Used for mice anesthesia (80 mg/kg, i.p.)) | |||
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS), placed on ice and will serve to harvest macrophages | WISENT INC Canada (QC) | 311-425-CL | |
| RPMI medium 1640 (Supplement with penicillin, streptomycin, L-glutamine, and 10 % fetal calf serum). | WISENT INC Canada (QC) | 350-000-CL | |
| 1 and 5 ml syringes | BD USA (NJ) | 309659 | |
| 6-well plates | Corning Incorporated (NY, USA) | MCT-150-C | |
| Bacterial lipoprotein Pam3CSK4 (0.5 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-pm25 | |
| Polyionosine–polycytidylic acid (Poly(I:C)) (10 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-PIC | |
| LPS from Escherichia coli 055:B5 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | L2880 | |
| Purified flagellin from Salmonella typhimurium (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FLIC-10 | |
| Lipoprotein synthetic FSL1 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FSL | |
| ssRNA derived from the HIV-1 long terminal repeat ssRNA40 (1 μg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-LRNA-40 | |
| Type B CpG oligonucleotide ODN1826 (1 μM) | InvivoGen (San Diego, USA) | 11B16-MM | |
| TRIzol | Invitrogen, (Burlington, ON, Canada) | 15596-026 | |
| 20 G and 23 G needles | BD USA (NJ) | 305175 | |
| Scissor | |||
| Forceps | |||
| 50 ml conical tubes placed on ice | Sarstedt (Newton, MA, USA) | 62.547.205 | |
| Red Blood Cells Lysis Buffer | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | R7757-100ML | |
| Refrigerated centrifuge | |||
| Hemocytometer | |||
| F4/80 antibody | BIO-RAD ( CA, USA) | MCA497APC | |
| CD16/CD32 antibodies | Pharmingen, {Mississauga, ON, CA) | 553141 | |
| Flow cytometer | Coulter Epics Elite counter, Coulter, (Hialeah, FL,USA) | ||
| 1.5 ml Eppendorf tubes | Axygen Scietific (CA,USA) | 3516 | |
| Chloroform | Fisher Scientific (ON, Canada) | UN1888 | |
| Isopropyl alcohol | JT Baker (PA, USA) | 70566 | |
| 75% ethanol (in DEPC treated water) | Commercial Alchohols (QC, Canada) | 17394 | |
| 0.01% diethyl pyrocarbonate (DEPC) treated water (let stand overnight and autoclave) | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | 216.542.8 | |
| Omniscript RT-PCR system | Qiagen, (Mississauga, ON, Canada) | 205113 | |
| Rotor Gene 3000 | Montreal Biotech, (Kirkland, QC, Canada) | ||
| QuantiTect SYBR Green I PCR kits | Qiagen, (Mississauga, ON, Canada) | 204141 |
References
- Pollard, J. W. Trophic macrophages in development and disease. Nat Rev Immunol. 9 (4), 259-270 (2009).
- Gordon, S.
- Koury, M. J., Ponka, P. New insights into erythropoiesis: the roles of folate, vitamin B12, and iron. Annu Rev Nutr. 24, 105-131 (2004).
- Sheftel, A. D., Kim, S. F., Ponka, P. Non-heme induction of heme oxygenase-1 does not alter cellular iron metabolism. J Biol Chem. 282 (14), 10480-10486 (2007).
- Hershko, C.
- Collins, H. L. Withholding iron as a cellular defence mechanism--friend or foe. Eur J Immunol. 38 (7), 1803-1806 (2008).
- Noyes, W. D., Bothwell, T. H., Finch, C. A. The role of the reticulo-endothelial cell in iron metabolism. Br J Haematol. 6, 43-55 (1960).
- Layoun, A., Huang, H., Calve, A., Santos, M. M. Toll-like receptor signal adaptor protein MyD88 is required for sustained endotoxin-induced acute hypoferremic response in mice. Am J Pathol. 180 (6), 2340-2350 (2012).
- Zumerle, S., et al. Targeted disruption of hepcidin in the liver recapitulates the hemochromatotic phenotype. Blood. 123 (23), 3646-3650 (2014).
- Nguyen, N. B., Callaghan, K. D., Ghio, A. J., Haile, D. J., Yang, F. Hepcidin expression and iron transport in alveolar macrophages. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 291 (3), L417-L425 (2006).
- Nemeth, E., et al. Hepcidin, a putative mediator of anemia of inflammation, is a type II acute-phase protein. Blood. 101 (7), 2461-2463 (2003).
- Nemeth, E., et al. Hepcidin regulates cellular iron efflux by binding to ferroportin and inducing its internalization. Science. 306 (5704), 2090-2093 (2004).
- Constante, M., et al. Distinct requirements for Hfe in basal and induced hepcidin levels in iron overload and inflammation. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 291 (2), G229-G237 (2006).
- Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. Chapter 14 (Unit 14 11), (2008).
- Ray, A., Dittel, B. N. Isolation of mouse peritoneal cavity cells. J Vis Exp. (35), (2010).
- Leijh, P. C., van Zwet, T. L., ter Kuile, M. N., van Furth, R. Effect of thioglycolate on phagocytic and microbicidal activities of peritoneal macrophages. Infect Immun. 46 (2), 448-452 (1984).
- Dy, M., Debray-Sachs, M., Kamoun, P., Hamburger, J. Effect of thioglycollate on macrophage lysosomal enzymes. Biomedicine. 29 (5), 167-170 (1978).
- Li, Y. M., Baviello, G., Vlassara, H., Mitsuhashi, T. Glycation products in aged thioglycollate medium enhance the elicitation of peritoneal macrophages. J Immunol Methods. 201 (2), 183-188 (1997).
- Layoun, A., Santos, M. M. Bacterial cell wall constituents induce hepcidin expression in macrophages through MyD88 signaling. Inflammation. 35 (4), 1500-1506 (2012).
- Oppenheim, J. J., Yang, D. Alarmins: chemotactic activators of immune responses. Curr Opin Immunol. 17 (4), 359-365 (2005).
- Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. Pathogen recognition and innate immunity. Cell. 124 (4), 783-801 (2006).
- Lang, R., Patel, D., Morris, J. J., Rutschman, R. L., Murray, P. J. Shaping gene expression in activated and resting primary macrophages by IL-10. J Immunol. 169 (5), 2253-2263 (2002).
- Wang, C., et al. Characterization of murine macrophages from bone marrow, spleen and peritoneum. BMC Immunol. 14 (6), (2013).
- Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture. J Cell Physiol. 77 (2), 121-134 (1971).
- Cannon, G. J., Swanson, J. A. The macrophage capacity for phagocytosis. J Cell Sci. 101 (Pt 4), 907-913 (1992).
- Wang, Y., Harris, D. C.
- Edwards, J. P., Zhang, X., Frauwirth, K. A., Mosser, D. M. Biochemical and functional characterization of three activated macrophage populations. J Leukoc Biol. 80 (6), 1298-1307 (2006).
- Hoover, D. L., Nacy, C. A. Macrophage activation to kill Leishmania tropica: defective intracellular killing of amastigotes by macrophages elicited with sterile inflammatory agents. J Immunol. 132 (3), 1487-1493 (1984).
- Schleicher, U., Bogdan, C. Generation culture and flow-cytometric characterization of primary mouse macrophages. Methods Mol Biol. 531, 203-224 (2009).
