Abstract
التعرض للمواد الكيميائية (بما في ذلك مؤلكل عوامل الحرب الكيميائية مثل الكبريت والنيتروجين الخردل) يسبب عدد كبير من الأعراض السريرية بما في ذلك الجرح اضطراب الشفاء. عملية فسيولوجية التئام الجروح معقدة للغاية. تشكيل النسيج الحبيبي هو خطوة أساسية في هذه العملية مما أدى إلى إغلاق الجرح الأولي وتوفير شبكة من الأوعية الدموية الشعرية الجديدة - إما عن طريق تكون الأوعية (تشكيل رواية) أو الأوعية الدموية (تنتشر السفن الموجودة). كلا vasculo- والأوعية الدموية تتطلب وظيفية، والهجرة الموجهة من الخلايا البطانية. وهكذا، والتحقيق في وقت مبكر من الخلايا البطانية (EEC) الهجرة غير المهم أن نفهم الفيزيولوجيا المرضية من المواد الكيميائية الناجمة عن التئام الجروح الاضطرابات ويحتمل أن تحديد استراتيجيات جديدة للتدخل العلاجي.
قمنا بتقييم ضعف التئام الجروح بعد مؤلكل التعرض لعامل واختبار المركبات المرشحة المحتملة للجراراتeatment. كنا مجموعة من التقنيات الواردة في هذا البروتوكول. A غرفة بويدن المعدلة للتحقيق من الناحية الكمية يوصف تنشيط كيميائي من EEC. وعلاوة على ذلك، ويتضح استخدام التئام الجروح فحص في تركيبة مع تحليل المسار لتقييم نوعيا الهجرة. أخيرا، علينا أن نظهر استخدام TMRM صبغة الفلورسنت للتحقيق في احتمال غشاء الميتوكوندريا إلى تحديد الآليات الكامنة وراء هجرة الخلايا المضطربة. يصف بروتوكول التالية التقنيات الأساسية التي تم تكييفها للتحقيق في EEC.
Introduction
هجرة الخلايا مهمة في العديد من العمليات الفسيولوجية والمرضية بما في ذلك تطوير والأمراض المختلفة، والتئام الجروح بعد إصابة الجلد.
بعد إصابة الجلد، التهاب الأنسجة ويزيل تحبيب محركات الأقراص التالفة أو الميتة إغلاق الجرح الأولي ويسمح تشكيل شبكة من الشعيرات الدموية الجديدة من خلال تكون الأوعية (تشكيل رواية) أو الأوعية الدموية (تبرعم الحويصلات الموجودة) 1-3. كلا vasculo- والأوعية الدموية تتطلب هجرة الخلايا البطانية. شبكة متنامية من الأوعية الدموية أمر ضروري لنقل الأكسجين والمواد المغذية إلى الخلايا الكيراتينية المتكاثرة التي تخضع في نهاية المطاف التقرن، تشكيل ظهارة جديدة وتوفير إغلاق الجرح.
الهجرة ضعف الخلايا البطانية هو السبب الكامن وراء الجرح اضطراب 4،5 الشفاء. ويلزم بذلك، وأساليب تقييم هجرة الخلايا البطانية في وقت مبكر لاستكشاف pathophysiolتتبناها من اضطرابات الهجرة الخلية وتحديد استراتيجيات جديدة للتدخل العلاجي.
تعرض البشرة للعوامل مؤلكل (على سبيل المثال، والكبريت والنيتروجين الخردل) يسبب الجرح اضطراب 6 الشفاء. واستخدمت هذه المركبات كما عوامل الحرب الكيميائية في العديد من الصراعات في القرن 20 ويبقى سبب قلق شديد بسبب المخزونات الموجودة في المناطق غير المستقرة سياسيا وتركيب بسيط نسبيا. على الرغم من خردل الكبريت تم تصنيعه لأول مرة في عام 1822، ليست مفهومة علم الأمراض الجزيئية والسريرية التعرض SM في التفاصيل، ويتم تحديد أي ترياق للتعرض SM.
وقد أجريت العديد من الدراسات لفهم ونمذجة ضعف التئام الجروح بعد التعرض SM واختبار المركبات المرشحة المحتملة قادرة على الاحتفاظ بهذا المعنى. شميت وآخرون (2009) اختبار تأثير الكلوراميوسيل، وهو مركب مؤلكل مع خصائص مشابهة لSM في مذكرة التفاهمحد ذاتها نماذج الجسم مضغي وجدت مثيرة، وأحيانا للحد من أكثر من 99٪ في تكوين الاوعية 7. كان هذا تأثير سلبي أكثر وضوحا في مرحلة التنمية التي، في ظل الظروف الفسيولوجية، يهيمن عليها انتشار وهجرة الخلايا السلائف بطانة الأوعية الدموية. وهكذا، تم تحديد هذه الخلايا لتكون حساسة بشكل خاص لمؤلكل الوكلاء. Steinritz وآخرون (2010) اختبار الزبالين من أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS)، ولا سيما، N أسيتيل (NAC) وحمض اللينولينيك ألفا (ALA) لقدرتها على تقليل SM سمية في الماوس مضغي نماذج الجسم وعلى وجه الخصوص، ل استعادة تكوين الاوعية 8. وقد لوحظت آثار وقائية مؤقتة، مشيرا إلى أن تشكيل ROS المفرط على الأرجح تساهم في الآثار السلبية لSM على التئام الجروح. وكانت هذه الآثار يست دائمة وربما لا تكون المركبات مرشح اثنين قادرة على استعادة تكوين الاوعية والتئام الجروح على المدى الطويل 8. Howeveص، أجريت تلك التجارب في نموذج 3D المعقدة التي لم تسمح التحقيق في الهجرة الخلية. وبالتالي، نحن اختبار في وقت لاحق NAC وALA للآثار مفيدة على هجرة الخلايا من EEC التي لها دور أساسي في عملية تكوين الاوعية 9.
وعلاوة على ذلك، هناك أدلة على أن الخلية القطبية مطلوب للهجرة الخلية. وقد أظهرت ضعف الميتوكوندريا مما يؤدي إلى تشكيل ROS مخلا قطبية الخلية وبالتالي قد تؤثر سلبا على الهجرة الخلية. لذلك، تم إجراء تصوير الخلايا الحية فيما يتعلق ظيفة الميتوكوندريا وتم فحص آثار الزبالين ROS. يصف بروتوكول التالية المتطلبات العامة للزراعة EEC، وغرفة فحص بويدن، والتئام الجروح مقايسة بما في ذلك تحليل تتبع الخلية واستخدام TMRM لتقييم وظيفة الميتوكوندريا في التفاصيل. ويسلط الضوء على جوانب هامة من البروتوكولات التجريبية لزراعة الجماعة الاقتصادية الأوروبية والهجرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يصف بروتوكول التالية تقنيات التحقيق في وقت مبكر من هجرة الخلايا البطانية. زراعة السليم للخلايا بطانة الأوعية الدموية تتطلب قبل طلاء قوارير زراعة الخلايا مع الجيلاتين لضمان الانتشار السليم والمحافظة على النمط الظاهري البطانية.
1. قبل طلاء قوارير خلية ثقافة
- حل الجيلاتين في 0.1 M PBS إلى تركيز النهائي من 0.1٪.
- الأوتوكلاف الحل مع المعلمات من أجل التعقيم السائل (لمزيد من التفاصيل انظر تعليمات الأوتوكلاف معين).
- إضافة كمية كافية من محلول الجيلاتين تعقيمها إلى قارورة معقمة ثقافة الخلية (على سبيل المثال، لا يقل عن 5 مل للثقافة قارورة خلية T25).
- نقل قوارير في حاضنة (37 ° C، 5٪ CO 2 غير مطلوب ولكن لا تتدخل) لمدة 30 دقيقة على الأقل.
- إزالة حل الجيلاتين المتبقية. استخدام قوارير المغلفة مسبقا في وقت لاحق (انظر زراعة الخلية) أو الصورةمزق تحت ظروف معقمة حتى الاستخدام.
2. زراعة خلية من الخلايا البطانية في وقت مبكر
ملاحظة: تم الحصول على الخلايا الجذعية الجنينية المستمدة الخلايا البطانية في وقت مبكر (EEC) من الهيئات مضغي الفئران متباينة من قبل المغناطيسي تنشيط فرز الخلايا من جزء الخلية إيجابي PECAM-1 كما هو موضح سابقا 10،11.
- ثقافة EEC على أطباق زراعة الخلايا المغلفة الجيلاتين في DMEM تستكمل مع 15٪ FCS، 50 U / البنسلين مل، 50 U / مل الستربتومايسين، و 200 ميكرومتر L-الجلوتامين، و 100 ميكرومتر ß المركابتويثانول و 1٪ الأحماض الأمينية غير الأساسية. التعامل مع الخلايا تحت ظروف معقمة. زراعة الخلايا مع CO 2 5٪ عند 37 درجة مئوية والرطوبة 95٪ حتى-التقاء الفرعية (بحد أقصى 80٪).
- في التقاء الفرعي، وتقسيم الخلايا في نسبة 1: 5. ملاحظة: المفرزة من الخلايا البطانية هو خطوة حاسمة.
- حصاد الخلايا مع RT accutase. إزالة وسائل الإعلام، وشطف مع برنامج تلفزيوني وإضافة 1 مل من accutase في 25 سم
- احتضان القارورة في RT ل10/02 دقيقة حتى فصل الخلايا. تفريق الخلايا ونقلها إلى التطبيق المطلوب. ملاحظة: لا حاجة لتحييد الكيميائي للaccutase كما يحدث عندما يتم تخزين الخلايا المصنفة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية. ومع ذلك، يمكن أيضا أن انخفض accutase النشاط من خلال إضافة DMEM تحتوي على FCS.
- حصاد الخلايا مع RT accutase. إزالة وسائل الإعلام، وشطف مع برنامج تلفزيوني وإضافة 1 مل من accutase في 25 سم
3. بويدن غرفة
ملاحظة: يتم إجراء فحوصات غرفة بويدن باستخدام أنظمة ضوئية مبهمة إدراج البولي ايثلين مع 8 ميكرون حجم المسام.
- قبل معطف إدراج مرشح (التي تناسب داخل الآبار زراعة الخلايا وبالتالي خلق غرفة بويدن) وذلك بإضافة 500 ميكرولتر من 0.1٪ الجيلاتين المذاب في 0.1 M PBS لمدة 30 دقيقة على الأقل.
- إذا الخلايا هي أن تتعرض لمواد كيميائية سامة، فضح وفقا لتصميم تجريبي معين قبل الحصاد الخلية. خلايا تعرضت إلى 12.5 ميكروغرام الكلوراميوسيل / مل DMEM: مذكرةلمدة 24 ساعة. وفيما يتعلق التصميم التجريبي معين، قد تختلف التعليمات.
- حصاد EEC وتحديد عدد الخلايا باستخدام غرفة خلية العد. ملاحظة: أجهزة الفرز الآلي يمكن استخدامها، ولكن يجب استخدامها بحذر: دليل العد الخلية هو أكثر دقة وينصح بشدة.
- إضافة 500 ميكرولتر مستنبت الخلية إلى انخفاض حجرة غرفة لغرفة بويدن.
- إضافة بالضبط 10 4 EEC في 500 ميكرولتر مستنبت الخلية في إدراج مرشح في الدائرة المقصورة العليا. القضاء على الفقاعات.
- احتضان إدراج مرشح في الحاضنة لمدة 8 ساعات بالضبط.
- شطف مع PBS مرة واحدة واستبدال المتوسطة مع 0.5 مل بارافورمالدهيد 4٪ في كل من المقصورات لمدة 25 دقيقة لتثبيت الخلية. غسل المرشح على نطاق واسع ولكن على الأقل 3 مرات مع 0.1 M PBS.
- استئصال الأغشية مع مشرط.
- جبل الغشاء بين اثنين من زلات غطاء زجاجي مع تصاعد المتوسط تحتوي على دابي لstainin النوويةز. الالتفات إلى التوجه. تأكد من أن الخلايا الوحيدة التي هاجروا نحو الجانب مقصورة السفلي من الغشاء تحسب.
- عدد الخلايا التي هاجرت نحو الجانب مقصورة السفلي من الغشاء مع المجهر مضان في 400X التكبير. لا تخلط بين مسام الغشاء مع خلايا هاجر (الشكل 1A، 1B). التحقيق في عدد معقول من مكررات البيولوجية (على الأقل 3 مكررات البيولوجية في حالة).
4. التئام الجروح الفحص
- اعتمادا على المعدات المتاحة، تختار بعناية أطباق زراعة الخلايا أو لوحات: عند استخدام DIC المجهر، وتجنب الأطباق الثقافة القائمة على سطح البلاستيك أو لوحات جيدة ولكن استخدام الأجهزة القائمة على الزجاج بدلا من ذلك.
ملاحظة: إذا كنت تستخدم على النقيض من المرحلة المجهري، والأطباق البلاستيكية أساس يمكن أن تستخدم أيضا. - زراعة EEC في جهاز ثقافة الخلية المناسبة (على سبيل المثال، 4 سم الزجاج طبق بتري أسفل مناسبة لتصوير الخلايا الحية) حتى 80٪ التقاء. هام: لا زراعة الخلايا لاستكمال التقاء.
- خدش الطبقات الوحيدة العقيمة مع 10 نصائح ميكرولتر ماصة. دفع غيض بلطف دون الكثير من الضغط على سطح الطبق وتحريكه في خط مستقيم على نحو سلس من جانب واحد على other.Wash الخلايا مرتين مع 0.1 M PBS لإزالة خلايا منفصلة.
- إضافة كمية كافية من المتوسط إلى الطبق الثقافة. إذا كان ذلك ممكنا، إضافة المركبات التي ينبغي التحقيق فيها.
ملاحظة: 1.5 مل المتوسطة التي تحتوي على 15 نانوغرام / مل ألفا تمت إضافة حمض اللينولينيك. - تركيب الطبق الثقافة تحت المجهر قادرة على تصوير الخلايا الحية. ضمان 5٪ CO 2، 37 ° C وجو مرطب.
ملاحظة: الترطيب مهم بشكل خاص لتجنب التبخر المتوسط. - الحصول على صور مرور الزمن أكثر من 24 ساعة على 10 فترات دقيقة. خطة لأحجام الملفات الكبيرة. ملاحظة: القرار 512 X 512 بكسل وعادة ما يكفي. ومع ذلك، فإننا نوصي باستخدام صور من 1024 س 1،0 على الأقل24.
- قياس عرض الفجوة في تي = 0 ساعة وعند t = 24 ساعة باستخدام أداة طول البرامج المقدمة مع المجهر أو استخدام البرمجيات مفتوحة المصدر (على سبيل المثال، يماغيج). ملاحظة: في عام معين الحصول على الصور وتحليل البرامج يتم توفيرها من قبل الشركة المصنعة. لذلك، للحصول على التفاصيل التقنية المتعلقة باستخدام البرنامج، الرجوع إلى دليل.
تتبع 5. خلية
- اعتمادا على المعدات المتاحة، تختار بعناية أطباق زراعة الخلايا أو لوحات: عند استخدام DIC المجهر، وتجنب الأطباق الثقافة القائمة على سطح البلاستيك أو لوحات جيدة ولكن استخدام الأجهزة القائمة على الزجاج بدلا من ذلك.
ملاحظة: إذا كنت تستخدم على النقيض من المرحلة المجهري، والأطباق البلاستيكية أساس يمكن أن تستخدم أيضا. - البذور 5 × 10 4 EEC في استكمال DMEM في جهاز ثقافة الخلية المناسبة (على سبيل المثال، 24 لوحة multiwell) وزراعة الخلايا مع CO 2 5٪ عند 37 درجة مئوية والرطوبة 95٪ لمدة 1-2 أيام.
- عندما نمت الخلايا تصل الى 80٪ التقاء، وإزالة وسائل الإعلام والثقافة الخلايا مع وسائل الإعلام الجديدة في وجود مواد الاختبار منها (على سبيل المثال، 12.5 ميكروغرام الكلوراميوسيل / مل DMEM). تتضمن دائما خلايا التحكم (تعامل مع المذيب، على سبيل المثال، والإيثانول) في 37 ° C لفترة معينة من الزمن (24 ساعة، اعتمادا على نظام فحص فردي).
- تركيب الطبق الثقافة تحت المجهر قادرة على التصوير الحي الخلية (37 ° C، 5٪ CO 2 و 95٪ الرطوبة). الحصول على صور مرور الزمن أكثر من 24 ساعة على فترات محددة سلفا. الحصول على صور في 10 دقيقة فترات.
- أداء تتبع يدويا من EEC عن طريق استخدام البرنامج المساعد يماغيج MTrackJ. اختيار 10 الخلايا عشوائيا من مجال الرؤية وتتبع تحركاتهم عن طريق إضافة نقطة بيانات في وقت من الأوقات باستخدام "إضافة" قيادة MTrackJ.
ملاحظة: MTrackJ متاح مجانا في ويماغيج هو التواجد [Meijering، Mtrackj "http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/".]لو في [Rasband، يماغيج. "http://rsbweb.nih.gov/ij/"]. دليل مفصل حول البرنامج المساعد MTrackJ يتوفر في "http://www.imagescience.org".
6. يعيش التصوير خلية / تقييم الميتوكوندريا غشاء المحتملة
- زراعة EEC في جهاز ثقافة الخلية المناسبة (على سبيل المثال، 4 سم الزجاج طبق بتري أسفل مناسبة لتصوير الخلايا الحية) تصل إلى نقطة التقاء 80٪.
هام: لا تقم زراعة الخلايا لاستكمال التقاء. - إذا كان ذلك ممكنا، وتعريض الخلايا للمواد الكيميائية. تعرض الخلايا إلى 12.5 ميكروغرام / مل الكلوراميوسيل لمدة 24 ساعة: مذكرة. وفيما يتعلق التصميم التجريبي معين، قد تختلف التعليمات.
- يعد حل 10 ملم الأوراق المالية من tetramethylrhodamine (TMRM) في DMSO. يحفظ بعيدا عن الضوء. ملاحظة: يمكن تخزين الحل السهم عند -20 درجة مئوية.
- تمييع الحل الأسهم في مستنبت الخلية إلى حل العاملة مع تركيز من 10 ميكرومتر (1: 1000 تمييع). يحفظ بعيدا عن الضوءواستخدم في أقرب وقت ممكن. ملاحظة: يمكن أن تظل الحل العاملين في RT لبعض الوقت (> 1 ساعة)، ومع ذلك، ينصح بشدة إعداد حل عمل جديدة.
- إضافة 2 ميكرولتر من حل العاملة إلى 1 مل مستنبت الخلية (حل التحميل) جديدة.
- تحميل الخلايا عن طريق استبدال مستنبت الخلية مع الحل التحميل. احتضان لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 والجو مرطب (الحاضنة). ويتم تصدير معظم المؤشرات مضان من قبل خلايا الحية على مر الزمن؛: الحذر ولتجنب تحميل لفترات طويلة أو تأخير التحليل.
- دون غسل، ووضع طبق تحت المجهر مناسبة لتصوير الخلايا الحية. هام: مؤشرات مضان شديدة الحساسية للضوء، وبالتالي، وتجنب التعرض للضوء لزوم لها.
- الحصول على صور دون تغيير المعلمات اقتناء لضمان إمكانية المقارنة بين الصور المختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تعرض البشرة للعوامل مؤلكل يثير حمامي، تشكيل نفطة وتقرح الجلد الذي يقترن اضطراب التئام الجروح. التئام الجروح يتطلب تكون الأوعية angio- والتي تقوم على هجرة الخلايا البطانية. ويمكن تقييم الهجرة الكمية عن طريق استخدام غرفة الفحص بويدن. كما هو مبين في الشكل 1C تعرض EEC إلى الكلوراميوسيل كيل مؤلكل أدى إلى انخفاض كبير في الهجرة الخلية 9. إضافة حمض اللينولينيك ROS-زبال ألفا (ALA) مباشرة بعد التعرض لالكلوراميوسيل لمدة 24 ساعة انقاذ بشكل كبير هذا النمط الظاهري، وتقريبا إلى مستويات الرقابة.
غرفة فحص بويدن هو أداة مناسبة لتقييم عدد (كمية) من الخلايا التي تم ترحيلها. ومع ذلك، فإن الفحص لا توفر معلومات حول سلوك هجرة الخلايا الشكل 2 يوضح أن غير معلن EEC قادرة على سد الفجوة في الجرح والشفاء الحمارعبد المنعم يوسف خلال 24 ساعة 9. في المقابل، لم تكن قادرة على سد الفجوة في التئام الجروح فحص 9 EEC تتعرض لالكلوراميوسيل كيل مؤلكل. وعلاوة على ذلك، كشف تتبع خلية واحدة EEC التي تحت تأثير حركة موجهة الكلوراميوسيل لم يكن لوحظ 9. وكانت معاملة EEC مع ROS-الزبالين قادرة على استعادة الموجهة الهجرة الخلية 9.
ارتبط تشكيل الميتوكوندريا ROS مع انخفاض قيمة الهجرة الخلية 12. كما هو مبين في الشكل (3) تعرض EEC لالكلوراميوسيل أدى إلى انهيار غشاء الميتوكوندريا المحتملة 9. علاج EEC مع ROS-زبال منعت الضرر الميتوكوندريا وحافظت على إمكانات غشاء الميتوكوندريا.
باختصار، كل الطرق الموضحة في قسم البروتوكول هي أدوات مناسبة لتقييم الهجرة الخلية. النتائج على الخسارة أو الحفاظ على إمكانات غشاء الميتوكوندريا قد توفر الخامستلميحات aluable بشأن الآليات الجزيئية الكامنة وراء هجرة الخلايا ضعاف.
الشكل 1. بويدن غرفة الفحص. (A) EEC والمصنفة على بويدن إدراج مرشح الدائرة، المحتضنة لمدة 8 ساعات، الثابتة وملطخة دابي. العلامات النجمية تشير هاجر EEC. في الصورة قدمت ما مجموعه 19 خلية يمكن الاعتماد (الشكل 1B). أحمر رؤساء السهم تشير الخلايا التي لم ترحيل عبر إدراج تماما أو التي ليست تماما في مجال الرؤية، وبالتالي استبعدت من العد الخلية. (ب) مسام (8 ميكرون) في الغشاء تصبح مرئية عند استخدام مرات التعرض الطويل لاقتناء الصورة. لا نخلط بينها وبين الخلايا التي تم ترحيلها. (C) تحت السيطرةشروط بمتوسط 212 خلايا هاجروا من خلال الغشاء. أدى التعرض الكلوراميوسيل في 128 فقط الخلايا التي تم ترحيلها. علاج المعرضة الكلوراميوسيل EEC مع حمض اللينولينيك ROS-زبال ألفا (ALA) الهجرة الخلية انقاذ بشكل كبير. تمثل رموز النتائج الفردية من إدراج مرشح واحد. وتشير قضبان أفقية سوداء وسائل (ن = 4)، أشرطة الخطأ تشير SD، والنجمة تشير إلى اختلافات كبيرة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. التئام الجروح فحص / تتبع الخلية. EEC كانت صورية المعالجة (تبادل المتوسطة) أو يتعرض إلى 12.5 ميكروغرام / مل الكلوراميوسيل. بعد الخدش، وخلايا ثالتحقيق يحرث لمدة 24 ساعة. كانت قادرة على سد الفجوة في التئام الجروح الفحص خلال 24 ساعة في حين الكلوراميوسيل يتعرض EEC كانت غير قادرة على سد الفجوة (A) EEC. أدت المعاملة مع ALA في تحسن كبير من الهجرة الخلية. (ن = 15 لكل مجموعة) وترد (B) متوسط القيم من 3 تجارب مستقلة لكل منها 5 مكررات الفنية لكل مجموعة. أشرطة الخطأ تمثل الانحرافات المعيارية، والنجمة تشير إلى فروق ذات دلالة إحصائية (في اتجاه واحد أنوفا، ف <0.05). تعديل من Steinritz وآخرون (2014) 9. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
كان الرقم 3. تقييم الميتوكوندريا غشاء المحتملة. EEC الشام المعالجة، ويتعرضون لالكلوراميوسيل (12.5 ميكروغرام / مل) أو chlorambيونيون كاربايد الهند المحدودة المكشوفة وALA (15 نانوغرام / مل) المعالجة. 24 ساعة بعد التعرض، تم تحميل الخلايا مع TMRM لمدة 15 دقيقة، وعلى الفور تصويرها. كشفت (A) غير معلن EEC إشارة واضحة بعد وضع العلامات TMRM مما يشير إلى إمكانية دون عوائق غشاء الميتوكوندريا. أدى التعرض (B) الكلوراميوسيل في انخفاض ملحوظ في إشارة TMRM. المستعادة (C) علاج المعرضة الكلوراميوسيل EEC مع ROS-زبال حمض ألفا لينولينيك إمكانات غشاء الميتوكوندريا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تعرض البشرة للمواد الكيميائية السامة غالبا ما يؤدي إلى اضطراب شديد التئام الجروح. الآليات الكامنة غير معروفة إلى حد كبير. التئام الجروح هو عملية معقدة تتكون من مراحل مختلفة (الارقاء، والتهاب، وانتشار وإعادة عرض). وتشارك الهجرة خلية في كل مرحلة، ومع ذلك، فإنه من الأهمية القصوى لتشكيل النسيج الحبيبي. هنا، يتم تشكيل الأوعية الدموية الجديدة إما عن طريق angio- أو تكون الأوعية.
تتطلب كل من عمليات الهجرة غير المتضررة من السلائف والخلايا البطانية في وقت مبكر. تقييم هجرة الخلايا وتوضيح الآليات الكامنة وراء هجرة الخلايا المضطربة هي ذات أهمية كبيرة من أجل وضع استراتيجيات علاجية جديدة ضد اضطرابات شفاء من السموم الناجمة عن الجرح.
يمكن تقييم هجرة الخلايا بمناهج مختلفة. وهناك تقنية شائعة الاستخدام هي فحص غرفة بويدن الذي تم عرضه في الأصل لتحليل الأجسام المضادة antigتسبب أون الكيميائي على الكريات البيض 13. هذا الاختبار هو فحص نقطة النهاية الكمي الذي يعكس قدرة غزو الخلايا من المقصورة العليا من إدراج transwell إلى انخفاض مقصورة ردا على جاذب كيميائي. في هذه التقنية الموصوفة هنا، وإضافة أي جاذب كيميائي لمجلس النواب. وكان التحقيق وبالتالي تنشيط كيميائي (الهجرة العشوائية بدون جاذب كيميائي معين) من EEC تحت ظروف مراقبة أو استجابة لالكلوراميوسيل.
يتكون إدراج غشاء يسهل اختراقها والتي تسمح ثلاثة هجرة الخلايا الأبعاد من خلال مسام الغشاء. حجم المسام في الغشاء أن يتم اختياره فيما يتعلق حجم الخلية: المسام التي هي صغيرة جدا ومنع الهجرة الخلية تماما، المسام التي تكون كبيرة جدا تسمح بمرور دون عوائق لجميع الخلايا. لخلايا بطانة الأوعية الدموية في وقت مبكر، ويوصى حجم المسام من 8 ميكرون. فإن استخدام حجم المسام غير مناسب يؤدي إلى نتائج irreproducible. في أورديص لتكييف بروتوكول للخلايا ذات خصائص مختلفة كما EEC، نوصي بدءا من حجم المسام أكبر من النوى وزيادة حجم المسام خطوة بخطوة إذا لزم الأمر. على سبيل المثال، للخلايا صغيرة مثل الكريات البيض يوصى حجم المسام من 3 ميكرون.
والمسألة الحاسمة هي تحديد فترة حضانة حتى التحليل. مع مرور الوقت، سوف تكاثر الخلايا (على الأقل في مجموعات المراقبة) تأخذ مكان. وهذا بدوره سوف تضخيم عدد الخلايا التي يمكن أن تخترق الغشاء، يمكن أن يقلل من حساسية الأسلوب: حتى مع قدرات المهاجرة ضعف قليلا، قد تكون قادرة على الهجرة على مدى فترات طويلة من الزمن الخلايا. ولذلك، لا ينصح فترات طويلة (على سبيل المثال 24 ساعة) لخلايا بطانة الأوعية الدموية. من ناحية أخرى، إذا كانت الحضانة قصيرة جدا بعد البذر الخلية، سيكون قد مر كميات ضئيلة فقط من خلايا الغشاء. تم العثور على الحضانة 8 ساعة الأمثل. بعد فترة حضانة محددة من 8 ساعات، خلاياإعادة الثابتة والملون وعدها يدويا.
هناك ثلاثة مناهج محتملة للتحليل: (1) خلايا على رأس الغشاء (التي لم هاجروا) يتم إزالتها عن طريق مسحة. ثم هي ملطخة الخلايا على الجانب السفلي من الغشاء (خلايا هاجر) إما مع النسيجية (على سبيل المثال، الهيماتوكسيلين) أو صبغة الفلورسنت (على سبيل المثال، دابي) وتحسب. (2) وبدلا من ذلك، الخلايا على الجانب السفلي يمكن ملطخة صبغة الفلورسنت أولا وبعد ذلك يتم فصل (على سبيل المثال، عن طريق استخدام التربسين). ثم يتم كميا مضان باستخدام قارئ مضان. (3) ونحن نوصي باستخدام أغشية مسامية الملونة الداكنة التي تمنع انتقال الضوء مما يتيح تمايز الخلايا غير ترحيلها (الخلايا على رأس الغشاء) والخلايا هاجر (على الجزء السفلي من الغشاء). بعد مضان تلطيخ (الأصباغ الخلوي لا يمكن استخدام) يتم حساب الخلايا على الجانب السفلي باستخدام مجهر مضان. فمن المهم أن لا جonfound التوجه الغشاء. باستخدام غشاء معتم يغني عن الحاجة لإزالة الخلايا غير ترحيلها. تحولت استخدام الأغشية مبهمة، وتلطيخ الفلورسنت واليدوي عد الخلايا خارج متفوقة على مناهج أخرى.
بشكل عام، وغرفة فحص بويدن هو الفحص الذي من السهل التعامل معها وبالتالي فمن مقايسة كثيرا ما تستخدم لتقييم الهجرة الخلية. ومع ذلك، هناك نوعان من عيوب رئيسية هي: (1) وغرفة فحص بويدن هو فحص نقطة النهاية. وهذا يعني، إذا كانت نقطة وقت تحليل غير صحيحة، قد تكون النتيجة مضللة. (2) في مقايسة ليست سهلة لأتمتة. ومع ذلك، هذا الاختبار هي واحدة من الأدوات الأكثر قيمة لتقييم الهجرة الخلية.
وعلى النقيض من ثابت بويدن غرفة الفحص، والتئام الجروح فحص (كما يشار إلى فحص إغلاق الفجوة أو خدش فحص) هو فحص ديناميكية في الوقت الحقيقي. وهو فحص الهجرة الأبعاد دون ثلاث حركات غزو الخلايا الأبعاد. بعد "جرح" من طبقات الخلايا مع طرف ماصة، تهاجر الخلايا في هذه الفجوة. فحص بسيط لأداء ويتجنب المشاكل من نقطة نهاية فحص ثابت. ومع ذلك، فإن فحص لديه بعض التحديات: (1) نظام المجهري تصوير الخلايا الحية (37 ° C، 5٪ CO 2 مع جو مرطب) هو مطلوب. تأكد من أن أطباق زراعة الخلايا لا تجف. (2) الحصول على الصور الوقت الفاصل بين سيؤدي إلى ملفات البيانات الكبيرة اعتمادا على المعلمات (القرار الفاصل) المستخدمة. (3) الخدش طبقة الخلايا مع طرف ماصة ليست سهلة كما قد يبدو في البداية. الكثير من الضغط سوف يؤدي إلى تلف سطح الطبق الذي قد يؤدي إلى القطع الأثرية. وعلاوة على ذلك، قد يختلف عرض الفجوة داخل الصفر، ويمكن أن تختلف بين المحققين مختلفة. يوصى محقق من ذوي الخبرة. (4) هو عدد العينات التي يمكن تشغيلها في نفس الوقت يحد من المعدات. ومع ذلك، فإن التئام الجروح الاختبار هو أداة قيمة لالكمي والتأهيليةتقييم itative الهجرة الخلية. معلومات حول سرعة الهجرة، بعد الهجرة، يمكن جمعها الهجرة الموجهة في الإعداد التجريبية واحد. تتبع الخلية في نظام ثنائي الأبعاد ليست صعبة للغاية ويمكن أن يؤديها مع البرمجيات مفتوحة المصدر (على سبيل المثال، يماغيج وMTrackJ).
طلاء من أطباق زراعة الخلايا ليست مهمة فقط لمرفق الخلية، ولكن لديه تأثير كبير على وظيفة الخلوية فيما يتعلق بالهجرة. يتم استزراع الخلايا البطانية بشكل روتيني على 0.1٪ الجيلاتين المغلفة السطوح. أدى استخدام السطح غير المغلفة للزراعة الخلايا البطانية في انخفاض انتشار 14. ومع ذلك، أظهرت الطلاء الجيلاتين الطلاء الأخرى (على سبيل المثال، فبرونيكتين) تم العثور أيضا مناسبة للزراعة على المدى القصير الأداء المتفوق في تجارب زراعة على المدى الطويل 15.
هناك العديد من الأصباغ مضان في السوق لتصوير الخلايا الحية. لقد تشوصن TMRM للتحقيق في احتمال غشاء الميتوكوندريا. العديد من الأصباغ الأخرى (على سبيل المثال، JC-1، TMRE) يحمل الأداء مقارنة. وعلى النقيض من تحقيقات أحادية اللون (TMRM، TMRE)، JC-1 التحولات مضان من الأخضر إلى الأحمر بعد تراكم في الميتوكوندريا. هذا يسمح للتحليل شبه كمي ratiometric الدولة الاستقطاب الميتوكوندريا ولكن يعوق التجارب تلطيخ مزدوجة (على سبيل المثال، وذلك باستخدام الأصباغ تعقب لتحديد الميتوكوندريا) 16. في تجربتنا صبغ نفسه هو أقل انتقادا للتجربة في حين أن التصميم التجريبي، والتعامل مع الخلايا والاستحواذ يمثل تحديا ويتطلب المزيد من الاهتمام. تقريبا كل الأصباغ الفلورية خفيفة حساسة. ولذلك، ينبغي أن يتم تحميل خلية في الظلام. تحميل خلية يتطلب 15-30 دقيقة. لفترة طويلة وقت التحميل لا يؤدي إلى زيادة الإشارات وغير مستحسن. على الرغم من إشارات محددة يمكن أن يتم الكشف بعد فترات التحميل الطويلة، الصبغة قد تتراكم في COMPART التحت خلويةبل قد يكون تفريغها الإدلاء بالبيانات أو من الخلية. ونتيجة لذلك، يجب أن يتم تحميل خلايا قبيل التحليل وليس بالضرورة في بداية التجربة. تركيز التحميل الصبغة هي عادة في نطاق من 10 ميكرومتر. ومع ذلك، مع TMRM تم العثور على تركيزات أقل بكثير (20 نانومتر) كافية لوضع العلامات وأعطى نتائج معقولة حتى الآن. كما هو مبين في الشكل نتج 3 وسم 24 ساعة بعد التعرض الكلوراميوسيل في خسارة متميزة من إمكانات غشاء الميتوكوندريا. علاج الكلوراميوسيل كشفت EEC مع كانت ROS-الزبالين قادرة على الحفاظ على إمكانات غشاء الميتوكوندريا في 24 ساعة بعد التعرض لها.
باختصار، بويدن غرفة الفحص، والتئام الجروح فحص في تركيبة مع واحد تحليل المسار الخلية هي أدوات قيمة لتقييم سلوك الهجرة فيما يتعلق النوعية والجوانب الكمية. وضع العلامات من إمكانات الميتوكوندريا مع TMRM يمكن أن تساعد على تحديد الآليات الكامنة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Boyden Chamber | |||
| Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 3 µm | Corning Incorporated | #351151 | |
| Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 8 µm | Life Sciences | #351152 | |
| (for use with Falcon Insert 24 well Companion Plate (353504) | |||
| Wound healing assay | |||
| Glass bottom dishes | Word Precision Instruments, Inc. | #FD35-100 | |
| Assessment of mitochondrial potential | |||
| TMRM (tetramethylrhodamine methyl ester) | Life Technologies | #T669 | |
| Cell culture | |||
| Accutase | PAA, Pasching, Austria | # L11-007 | |
| α-Linolenic acid | Fluka (Sigma), Steinheim, Germany | # L2376 | |
| Chlorambucil | Fluka (Sigma), Steinheim, Germany | # 23125 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany | # G2500-100G |
References
- Bauer, S. M., Bauer, R. J., Velazquez, O. C. Angiogenesis, vasculogenesis, and induction of healing in chronic wounds. Vascular and Endovascular Surgery. 39, 293-306 (2005).
- Reinke, J. M., Sorg, H.
- Hart, J. Inflammation. 1: Its role in the healing of acute wounds. Journal of Wound Care. 11, 205-209 (2002).
- Liu, Z. J., Hyperoxia Velazquez, O. C. endothelial progenitor cell mobilization, and diabetic wound healing. Antioxidants & Redox Signaling. 10, 1869-1882 (2008).
- Gallagher, K. A., Goldstein, L. J., Thom, S. R., Velazquez, O. C. Hyperbaric oxygen and bone marrow-derived endothelial progenitor cells in diabetic wound healing. Vascular. 14, 328-337 (2006).
- Kehe, K., Balszuweit, F., Steinritz, D., Thiermann, H. Molecular toxicology of sulfur mustard-induced cutaneous inflammation and blistering. Toxicology. 263, 12-19 (2009).
- Schmidt, A., et al. Nitrogen mustard (Chlorambucil) has a negative influence on early vascular development. Toxicology. 263, 32-40 (2009).
- Steinritz, D., et al. Effect of N-acetyl cysteine and alpha-linolenic acid on sulfur mustard caused impairment of in vitro endothelial tube formation. Toxicological Sciences. 118, 521-529 (2010).
- Steinritz, D., et al. Chlorambucil (nitrogen mustard) induced impairment of early vascular endothelial cell migration - Effects of alpha-linolenic acid and N-acetylcysteine. Chemico-biological Interactions. 219C, 143-150 (2014).
- Schmidt, A., et al. Influence of endostatin on embryonic vasculo- and angiogenesis. Developmental Dynamics : an Official Publication of the American Association of Anatomists. 230, 468-480 (2004).
- Dainiak, M. B., Kumar, A., Galaev, I. Y., Mattiasson, B.
- Wang, Y., et al. Regulation of VEGF-induced endothelial cell migration by mitochondrial reactive oxygen species. American Journal of Physiology. Cell physiology. 301, C695-C704 (2011).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
- Relou, I. A., Damen, C. A., van der Schaft, D. W., Groenewegen, G., Griffioen, A. W. Effect of culture conditions on endothelial cell growth and responsiveness. Tissue & Cell. 30, 525-530 (1998).
- Smeets, E. F., von Asmuth, E. J., vander Linden, C. J., Leeuwenberg, J. F., Buurman, W. A. A comparison of substrates for human umbilical vein endothelial cell culture. Biotechnic & Histochemistry : Official Publication of the Biological Stain Commission. 67, 241-250 (1992).
- Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. BioTechniques. 50, 98-115 (2011).
