研究早期内皮细胞（EEC）迁移对于理解某些疾病的病理生理机制以及潜在发现新的治疗干预策略具有重要意义。以下方案描述了已针对EEC研究进行优化的细胞迁移评估技术。
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摘要
摘要
接触化学物质（包括烷基化化学战剂，如硫芥和氮芥）会导致多种临床症状，包括伤口愈合障碍。伤口愈合的生理过程极为复杂。在此过程中，肉芽组织的形成是关键步骤，可实现初步伤口闭合，并提供由新生毛细血管组成的新血管网络——这一过程通过血管发生（新血管形成）或血管生成（现有血管出芽）实现。血管发生和血管生成均依赖于内皮细胞的功能性定向迁移。因此，研究早期内皮细胞（EEC）的迁移对于理解化学物质诱发的伤口愈合障碍的病理生理机制，并可能发现新的治疗干预策略具有重要意义。
我们评估了烷化剂暴露后伤口愈合受损的情况，并测试了潜在候选化合物的治疗效果。本研究采用了一套在此方案中概述的技术。文中描述了一种改良的Boyden小室法，用于定量研究子宫内膜上皮细胞（EEC）的趋化运动。此外，还展示了将伤口愈合实验与轨迹分析相结合，用于定性评估细胞迁移的方法。最后，我们演示了使用荧光染料TMRM检测线粒体膜电位，以揭示细胞迁移障碍的潜在机制。以下方案描述了为研究EEC而改进的一系列基本技术。
引言
细胞迁移在多种生理和病理生理过程中具有重要作用，包括发育、多种疾病以及皮肤损伤后的伤口愈合。
皮肤损伤后，炎症反应可清除受损或坏死的组织，而肉芽组织形成则促进伤口的初步闭合，并通过血管发生（新血管形成）或血管生成（已有血管出芽）形成新的毛细血管网络1-3。血管发生和血管生成均依赖于内皮细胞的迁移。不断生长的血管网络对于向增殖的角质形成细胞输送氧气和营养物质至关重要，这些角质形成细胞最终经历角化，形成新的上皮层，实现伤口闭合。
内皮细胞迁移功能受损是伤口愈合障碍的根本原因之一4,5。因此，有必要建立评估早期内皮细胞迁移的方法，以探究细胞迁移障碍的病理生理机制，并寻找新的治疗干预策略。
皮肤接触烷化剂（例如，硫芥和氮芥）可导致伤口愈合障碍6。这类化合物曾在20世纪的多次冲突中被用作化学战剂，且由于在政治不稳定的地区仍存有大量库存，加之其合成相对简单，至今仍令人高度担忧。尽管硫芥最早于1822年被合成，但硫芥暴露的分子机制和临床病理尚未被充分阐明，目前也尚未发现针对硫芥暴露的有效解毒剂。
已有若干研究致力于理解并建立芥子气（SM）暴露后伤口愈合受损的模型，并筛选可能逆转该效应的候选化合物。Schmidt et al.（2009）在小鼠类胚体模型中测试了苯丁酸氮芥（chlorambucil）的作用，该化合物为一种烷化剂，性质与SM相似，结果发现其可导致血管形成显著减少，有时降幅甚至超过99%7。这种不良效应在发育的某一阶段最为显著，该阶段在生理条件下主要由血管内皮前体细胞的增殖与迁移所主导。因此，这些细胞被确认对烷化剂尤为敏感。Steinritz et al.（2010）测试了活性氧（ROS）清除剂，特别是N-乙酰半胱氨酸（NAC）和α-亚麻酸（ALA），在小鼠类胚体模型中减轻SM毒性的能力，尤其是恢复血管形成的能力8。研究观察到短暂的保护作用，表明ROS的过度生成可能参与了SM对伤口愈合的不利影响。然而，这些保护作用并非持久，两种候选化合物可能无法长期恢复血管形成及伤口愈合过程8。但这些实验是在一个复杂的三维模型中进行的，虽允许研究细胞迁移，但受限较多。因此，我们随后进一步测试了NAC和ALA对内皮前体细胞（EEC）迁移的有益作用，因为EEC在血管形成过程中起关键作用9。
此外，有证据表明细胞极性对于细胞迁移是必需的。线粒体功能障碍可导致活性氧（ROS）的形成，进而损害细胞极性，因此可能对细胞迁移产生不利影响。因此，本研究进行了与线粒体功能相关的活细胞成像，并检测了ROS清除剂的作用。以下方案详细描述了子宫内膜上皮细胞（EEC）培养的一般要求、Boyden小室实验、包括细胞轨迹分析的伤口愈合实验，以及使用四甲基罗丹明甲酯（TMRM）评估线粒体功能的方法。文中还强调了EEC培养与迁移实验方案中的关键要点。
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方案
以下方案描述了早期内皮细胞迁移研究的技术。血管内皮细胞的正确培养需要预先用明胶包被细胞培养瓶，以确保细胞正常增殖并维持内皮表型。
1. 细胞培养瓶的预包被
- 将明胶溶于0.1 M PBS中，终浓度为0.1%。
- 使用液体灭菌参数对溶液进行高压灭菌（具体参数详见所用高压灭菌器的操作说明）。
- 加入足量的已灭菌明胶溶液至无菌细胞培养瓶中例如， 至少5 ml用于T25细胞培养瓶。
- 将培养瓶转移至培养箱中（37°C，5% CO₂）2 不需要，但即使存在也不会产生干扰）至少 30 分钟。
- 移除剩余的明胶溶液。随后使用预先包被的培养瓶（参见细胞培养）或在无菌条件下保存至使用。
2. 早期内皮细胞的细胞培养
注意：如先前所述10,11，通过磁激活细胞分选法从分化的小鼠拟胚体中分离出胚胎干细胞来源的早期内皮细胞（EEC），即PECAM-1阳性细胞组分。
- 将 EEC 在明胶包被的细胞培养皿中培养于添加了 15% 胎牛血清（FCS）、50 U/ml 青霉素、50 U/ml 链霉素、200 µM L-谷氨酰胺、100 µM ß-巯基乙醇和 1% 非必需氨基酸的 DMEM 培养基中。操作过程需在无菌条件下进行。将细胞置于 37 °C、5% CO2 及 95% 湿度条件下培养，直至达到亚汇合状态（最多 80%）。
- 当细胞达到亚汇合状态时，按 1:5 的比例传代。注意：内皮细胞的解离是一个关键步骤。
- 使用室温的 accutase 消化液收集细胞。吸除培养基，用 PBS 洗涤一次，然后每 25 cm2 培养面积加入 1 ml accutase。
- 在室温下孵育 2–10 分钟，直至细胞完全脱落。轻柔吹打使细胞分散，随后转移至所需实验应用中。注意：accutase 无需化学中和，因为当接种后的细胞在 37 °C 培养箱中培养时，其活性会自然降低。然而，也可通过加入含胎牛血清的 DMEM 来抑制 accutase 活性。
3. Boyden 小室
注意：Boyden 小室实验采用不透光的聚对苯二甲酸乙二醇酯插入系统，孔径为 8 µm。
- 通过在细胞培养小室内的滤膜插件中加入500 µl溶于0.1 M PBS中的0.1%明胶，孵育至少30分钟，以预先包被滤膜插件（该插件置于细胞培养孔内，形成Boyden小室）。
- 若需使细胞暴露于有毒化学物质，请根据具体实验设计在细胞收获前进行处理。注意：本实验中细胞暴露于含12.5 µg氯苯丁酸/ml DMEM的培养基中24小时。不同实验设计的操作步骤可能有所不同。
- 收获EEC，并使用细胞计数板确定细胞数量。注意：可使用自动计数设备，但应谨慎使用；手动细胞计数更为准确，强烈推荐使用。
- 向Boyden小室的下室中加入500 µl细胞培养基。
- 在上室的每个滤膜插件中，精确加入含104个EEC的500 µl细胞培养基，避免产生气泡。
- 将滤膜插件置于培养箱中，准确孵育8小时。
- 用PBS冲洗一次，然后在上下室中均加入0.5 ml含4%多聚甲醛的溶液，固定细胞25分钟。用0.1 M PBS充分清洗滤膜，至少清洗3次。
- 用手术刀将滤膜切下。
- 将滤膜置于两片玻璃盖玻片之间，使用含DAPI的封片剂进行封片以实现细胞核染色。注意滤膜的方向，确保仅计数迁移到滤膜下室侧的细胞。
- 使用荧光显微镜在400倍放大倍数下计数迁移到滤膜下室侧的细胞。注意不要将滤膜孔误认为迁移细胞（图1A、图1B）。应检测合理数量的生物学重复样本（每种条件至少3个生物学重复）。
4. 伤口愈合实验
- 根据可用设备，仔细选择细胞培养皿或培养板：使用微分干涉差（DIC）显微镜时，应避免使用塑料表面的培养皿或孔板，而改用玻璃底材质的器皿。
注意：若使用相差显微镜，也可使用塑料材质的培养皿。 - 将 EEC 在合适的细胞培养装置中（例如，适用于活细胞成像的 4 cm 玻璃底培养皿）培养至 80% 汇合度。重要提示：切勿将细胞培养至完全汇合。
- 用无菌的 10 µl 移液器吸头划伤单层细胞。将吸头轻轻接触培养皿表面，施加适度压力，并沿直线平稳地从一侧移动到另一侧。用 0.1 M PBS 洗涤细胞两次，以去除脱落的细胞。
- 向培养皿中加入足量的培养基。如需检测特定化合物，可在此时加入。
注意：本实验中加入了含 15 ng/ml α-亚麻酸的 1.5 ml 培养基。 - 将培养皿置于具备活细胞成像功能的显微镜下，确保环境条件为 5% CO2、37 °C 并保持湿润。
注意：保持湿润尤其重要，以防止培养基蒸发。 - 以 10 分钟为间隔，连续采集 24 小时的延时图像。需预先规划足够的存储空间。注意：通常 512 × 512 像素的分辨率已足够；但我们建议使用至少 1,024 × 1,024 像素的图像。
- 使用显微镜配套软件中的长度测量工具，或使用开源软件（例如，ImageJ），在 t = 0 小时和 t = 24 小时时测量划痕间隙的宽度。注意：通常显微镜制造商提供专用的图像采集与分析软件，有关软件使用的具体技术细节，请参考其使用手册。
5. 细胞追踪
- 根据可用设备，仔细选择细胞培养皿或培养板：使用微分干涉差（DIC）显微镜时，应避免使用塑料表面的培养皿或孔板，而应使用玻璃基质的培养装置。
注意：若使用相差显微镜，也可使用塑料基质的培养皿。 - 在补充型DMEM培养基中接种5 × 104个EEC细胞至合适的细胞培养装置（例如，24孔板），于37 °C、5% CO2及95%湿度条件下培养1–2天。
- 当细胞生长至约80%汇合度时，吸除培养基，并更换为含相应测试物质的新鲜培养基（例如，12.5 µg氯苯丁酸/ml DMEM），同时设置对照组细胞（仅加入溶剂，例如乙醇），于37 °C培养一定时间（24小时，具体时间依不同实验体系而定）。
- 将培养皿置于具备活细胞成像功能的显微镜下（37 °C，5% CO2，95%湿度），以预设时间间隔连续采集24小时的时间序列图像，图像采集间隔设为10分钟。
- 使用ImageJ插件MTrackJ对EEC细胞进行手动轨迹追踪。从视野中随机选取10个细胞，利用MTrackJ的“Add”命令，在每个时间点添加数据点以追踪其运动轨迹。
注意：MTrackJ 可在 [Meijering, \Mtrackj." http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/ “] 免费获取，ImageJ 可在 [Rasband, \Imagej." http://rsbweb.nih.gov/ij/ “] 获取。MTrackJ 插件的详细使用手册可在 “http://www.imagescience.org” 查阅。
6. 活细胞成像/线粒体膜电位评估
- 将 EEC 培养于合适的细胞培养装置中（例如 适用于活细胞成像的 4 cm 玻璃底培养皿），直至细胞融合度达到 80%。
重要提示：切勿将细胞培养至完全融合。 - 如实验需要，可对细胞进行化学物质处理。注：本实验中细胞经 12.5 µg/ml 氯苯丁酸处理 24 小时。具体实验方案可能因设计不同而有所调整。
- 用 DMSO 配制 10 mM 的四甲基罗丹明甲酯（TMRM）储备液。避光保存。注：储备液可于 -20 °C 保存。
- 将储备液用细胞培养基稀释成工作液，终浓度为 10 µM（1:1,000 稀释）。避光并尽快使用。注：工作液可在室温下保存一段时间（>1 小时），但强烈建议现用现配。
- 在 1 ml 新鲜细胞培养基中加入 2 µl 工作液（染色液）。
- 用上述染色液替换原有培养基以对细胞进行染色。于 37 °C、5% CO2 及湿润环境中孵育 15 分钟（培养箱内）。注意：几乎所有荧光探针均会随着时间被活细胞主动外排；因此应避免过长染色时间或延迟检测。
- 无需洗涤，直接将培养皿置于适用于活细胞成像的显微镜下观察。重要提示：荧光探针对光极为敏感，应避免不必要的光照暴露。
- 在保持成像参数不变的情况下采集图像，以确保不同图像之间的可比性。
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结果
皮肤接触烷化剂会引起红斑、水疱形成以及皮肤溃疡，这些症状与伤口愈合障碍相关。伤口愈合需要血管生成和血管形成过程，而这些过程依赖于内皮细胞的迁移。可通过Boyden小室实验对细胞迁移能力进行定量评估。如图1C所示，内皮细胞（EEC）暴露于烷化剂苯丁酸氮芥后，其细胞迁移能力显著下降9。在接触苯丁酸氮芥后立即加入活性氧清除剂α-亚麻酸（ALA）处理24小时，可显著恢复该表型，几乎达到对照组水平。
Boyden小室实验是评估迁移细胞数量的合适工具。然而，该实验无法提供有关细胞迁移行为的信息。图2表明，未暴露于药物的EEC在划痕愈合实验中能够在24小时内闭合伤口间隙9。相比之下，暴露于烷化剂苯丁酸氮芥的EEC则无法在划痕愈合实验中闭合伤口间隙9。此外，对单个EEC的轨迹追踪显示，在苯丁酸氮芥作用下未观察到定向移动9。使用活性氧清除剂处理EEC后，可恢复其定向迁移能力9。
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讨论
皮肤接触有毒化学物质常导致严重的伤口愈合障碍，其潜在机制在很大程度上尚不清楚。伤口愈合是一个复杂的过程，包含多个阶段（止血、炎症、增殖和重塑）。细胞迁移参与了各个阶段，但在肉芽组织形成过程中尤为重要。在此过程中，新血管通过血管发生或血管新生形成。
这两个过程均需要前体细胞和早期内皮细胞的正常迁移。评估细胞迁移能力并阐明细胞迁移受阻的潜在机制，对于开发针对毒性物质诱导的伤口愈合障碍的新治疗策略具有重要意义。
细胞迁移能力可通过多种方法进行评估。一种常用的技术是Boyden小室实验，该方法最初用于分析抗体-抗原介导的白细胞趋化作用13。该实验是一种定量终点检测方法，用于反映细胞在趋化因子刺激下从Transwell小室上层隔室迁移至下层隔室的侵袭能力。在本研究所描述的技术中，下层小室未添加任何趋化因子。因此，本实验旨在研究在对照条件下或氯苯丁酸处理下子宫内膜癌细胞（EEC）的趋化运动（即无特定趋化因子诱导的随机迁移）。
插入物包含一个多孔膜，可允许细胞通过...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由德国国防部资助（项目编号：M-SAB1-6-A009）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 博伊登小室 | |||
| Corning FluoroBlok 组织培养（TC）处理的嵌插培养板，24 孔 - 3 µm | 康宁公司 | #351151 | |
| Corning FluoroBlok 组织培养（TC）处理的24孔插入式培养小室，孔径8 μm µm | 生命科学 | #351152 | |
| （与Falcon Insert 24孔配套培养板（353504）配合使用） | |||
| 伤口 划痕愈合实验 | |||
| 玻璃底培养皿 | Word Precision Instruments, Inc. | #FD35-100 | |
| 线粒体膜电位评估 | |||
| TMRM（四甲基罗丹明甲酯） | Life Technologies | #T669 | |
| 细胞培养 | |||
| Accutase | PAA，奥地利帕兴 | # L11-007 | |
| α-亚麻酸 | Fluka (Sigma)，德国施泰因海姆 | L2376 | |
| 苯丁酸氮芥 | Fluka (Sigma)，德国施泰因海姆 | # 23125 | |
| 明胶 | Sigma-Aldrich，德国施泰因海姆 | # G2500-100G |
参考文献
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