Abstract
接触化学物质（包括如硫和氮芥子气烷化剂化学战剂）会导致过多的临床症状，包括伤口愈合障碍。伤口愈合的生理过程是非常复杂的。肉芽组织的形成是在这个过程中产生了初步伤口闭合和提供的新的毛细血管的网络中的关键步骤 - 无论是通过血管（新形成）或血管生成（出芽现有船只）。无论vasculo-和血管生成需要内皮细胞的功能，定向迁移。因此，早期内皮细胞（EEC）迁移的调查是重要的，了解化学诱导伤口愈合障碍的病理生理学和潜在确定新的战略治疗干预。
我们评估伤口愈合不良烷化剂暴露后测试潜在的候选化合物TReatment。我们使用了一组在此协议中概述的技术。一个改良的Boyden室定量调查EEC的化学激活描述。此外，使用伤口愈合实验，结合轨道分析，以定性评估迁移的说明。最后，我们证明了使用的荧光染料TMRM对于线粒体膜电位的调查，以确定潜在的干扰细胞迁移的机制。下面介绍的协议已被改编为EEC的调查基本技术。
Introduction
细胞迁移是许多生理和病理过程，包括发展，各种疾病及皮肤受伤后伤口愈合很重要的。
以下皮肤损伤，炎症消除受损或坏死组织及肉芽驱动器初步伤口缝合，并允许通过血管形成新的毛细血管网络的（小说形成）或血管生成（已有的囊泡萌芽）1-3。既vasculo-和血管生成需要内皮细胞的迁移。越来越多的血管网络是必不可少的运输氧和营养物质的角质形成细胞增殖，最终发生角化，形成新的上皮细胞，并提供伤口缝合。
内皮细胞受损迁移是伤口愈合紊乱4,5的一个根本原因。早期的内皮细胞。因此，方法来评估迁移需要探索病理生理的细胞迁移紊乱术，并确定新的策略的治疗干预。
皮肤暴露于烷化剂（ 例如，硫和氮芥子气）导致伤口愈合紊乱6。这种化合物被用作化学战剂的一些冲突，在20世纪，并保持之所以强烈关注，由于在政治上不稳定的地区和相对简单的合成现有库存。虽然硫芥在1822年首次合成，SM暴露的分子和临床病理学不被了解的细节，也没有解药SM曝光已经确定。
几项研究已经进行了解和伤口愈合不良SM曝光后模拟和测试能够保留该效果的潜在候选化合物。 Schmidt 等人（2009）测试了苯丁酸氮芥的效果，与在谋类似的SM性质的烷基化化合物本身胚体模型，发现了戏剧性，有时在血管形成7减少99％以上。这种不利影响是最有发展的哪个，在生理条件下，通过增殖和血管内皮前体细胞的迁移支配阶段明显。因此，这些细胞被鉴定为特别敏感烷化剂。 Steinritz 等人（2010）测试了活性氧簇（ROS），特别是N-乙酰半胱氨酸（NAC）和阿尔法亚麻酸（ALA）清除剂其减少的SM毒性在小鼠胚体模型和具体地，涉及能力恢复血管形成8。观察临时保护作用，表明过度ROS形成是可能有助于SM的对伤口愈合的不利影响。这些影响是不是永久性的，这两个候选化合物可能不能够恢复在长期8血管形成和伤口愈合的。 HoweveR，这些实验在一个复杂的三维模型，确实让细胞迁移的调查进行的。因此，我们随后被测试的NAC和ALA对于具有在血管形成9的过程中起关键作用的欧洲经济共同体的细胞迁移的有益效果。
此外，有证据表明，细胞极性所需的细胞迁移。线粒体功能障碍导致ROS形成被证明损害细胞极性和可因此细胞迁移有负面影响。因此，活细胞成像对于线粒体功能被执行，并且进行了检查的ROS清除剂的作用。以下协议描述为EEC，Boyden小室法，伤口愈合实验，包括细胞跟踪分析和使用TMRM的详细线粒体功能评估的培养一般要求。对于EEC种植和移植实验方案的重要方面突出。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
以下协议描述为早期内皮细胞迁移的调查技术。合适的培养的血管内皮细胞的需要的细胞培养瓶中用明胶预涂布，以确保内皮表型的适当扩散和维护。
细胞培养烧瓶的1.预涂层
- 溶解明胶的0.1M PBS中的0.1％的最终浓度。
- 高压釜中的液体灭菌参数解决方案（详见具体的高压釜的说明）。
- 添加蒸压明胶溶液具有足够的体积，以无菌细胞培养瓶（ 例如，至少5毫升一T25细胞培养烧瓶）中。
- 转移烧瓶成培养箱中（37℃，不需要的5％的CO 2，但不干扰）至少30分钟。
- 除去剩余的明胶溶液。使用预涂层烧瓶随后（参见细胞培养）或s无菌条件，直至使用下撕毁。
早期内皮细胞2.细胞培养
注：来自胚胎干细胞的早期内皮细胞（EEC）从分化的鼠胚体如前面10,11描述得到由PECAM-1阳性细胞级分的磁性活化细胞分选。
- 培养EEC在明胶包被的细胞培养皿中的DMEM补充有15％FCS，50U / ml青霉素，50U / ml链霉素，200μM的L-谷氨酰胺，100μM的β-巯基乙醇和1％非必需氨基酸。处理在无菌条件下的细胞。培养的细胞，用5％的CO 2在37℃和95％的湿度，直至亚融合（最大80％）。
- 在亚融合，分裂细胞以1：5的比例。注意：内皮细胞的脱离是关键的一步。
- 收获细胞，用RT的Accutase。取出介质，冲洗用PBS和每25厘米加入1 ml的Accutase的
- 孵育烧瓶在RT 2-10分钟，直到细胞脱离。分散细胞，并将它们传送到所期望的应用。注意：因为它发生时，接种的细胞在37℃下保存在培养箱不需要的Accutase的化学中和。但是，的Accutase活性也可以通过添加的DMEM含有FCS的降低。
- 收获细胞，用RT的Accutase。取出介质，冲洗用PBS和每25厘米加入1 ml的Accutase的
3. Boyden小室
注意：Boyden小室测定法是通过使用光的不透明聚对苯二甲酸乙酯刀片系统具有8微米的孔径进行。
- 预涂层的过滤器插入件（即适合细胞培养孔因此形成了boyden小室的内部）通过添加500μl的0.1％明胶的溶解在0.1M PBS中至少30分钟。
- 如果细胞暴露于有毒化学品，根据具体的实验设计之前收获细胞暴露。注意：将细胞暴露于12.5微克丁酸氮芥/ ml的DMEM中24小时。关于具体的实验设计，指令可能会发生变化。
- 收获EEC和通过使用计数池室确定的细胞数。注意：自动计数装置都可以使用，但应谨慎使用：手动细胞计数是更准确，强烈建议。
- 加入500微升的细胞培养基进入Boyden小室的下腔室隔室。
- 加准确的10 4欧洲经济共同体在每滤芯500微升的细胞培养基中的上腔室中。消除泡沫。
- 孵化在孵化器的滤芯整整8小时。
- 用PBS冲洗一次，并更换用0.5ml 4％多聚甲醛的介质在两个室25分钟，进行细胞固定。广泛冲洗过滤器，但至少3次用0.1M PBS中。
- 消费用手术刀膜。
- 将两片玻璃盖玻片之间的膜含有DAPI核stainin安装介质G。注意方向。确保只有已迁移朝向膜的下室侧的细胞进行计数。
- 算已迁移朝向膜的下室侧与在放大400倍荧光显微镜的细胞。不要混淆膜孔与迁移细胞（ 图1A，1B）。研究生物复制合理数量（每状态至少3个生物学重复）。
4.伤口愈合实验
- 根据可用的设备，精心选择了细胞培养皿或板：当使用DIC的显微镜，避免塑料表面基于培养皿或孔板而是用玻璃基础上的，而不是设备。
注意：如果使用相差显微镜，是根据塑料盘也可使用。 - 在合适的细胞培养装置，培养欧洲经济共同体（ 例如，4厘米玻璃底培养皿适于活细胞成像），直到80％汇合。重要提示：不要培养细胞来完成汇合。
- 从头无菌10微升枪头的单层。轻轻推动尖端没有太大的压力到所述餐具表面和用0.1M PBS中移动它在一条直线上平稳地从一侧到other.Wash细胞两次以除去分离的细胞。
- 添加介质的足够体积到培养皿。如果适用，添加要追究化合物。
注意：含有1.5毫升培养基15纳克/毫升的α-亚麻酸的溶液。 - 安装能够活细胞成像显微镜下培养皿。确保5％CO 2，37℃和潮湿气氛。
注意：加湿是特别重要的，以避免介质的蒸发。 - 超过24小时采集时间推移图像以10分钟的间隔。规划大文件大小。注：512×512像素的分辨率通常是足够的;然而，我们建议使用至少1024×1,0图片24。
- 使用该软件的设置有显微镜的长度工具测量间隙宽度在t = 0小时和在t = 24小时，或者使用开放源码软件（ 例如，ImageJ的）。注意：通常特定图像采集和分析软件是由制造商提供。因此，对于使用该软件的技术细节，请参考手册。
5.细胞跟踪
- 根据可用的设备，精心选择了细胞培养皿或板：当使用DIC的显微镜，避免塑料表面基于培养皿或孔板而是用玻璃基础上的，而不是设备。
注意：如果使用相差显微镜，是根据塑料盘也可使用。 - 种子5×10 4欧洲经济共同体在补充的DMEM在合适的细胞培养装置（ 例如，24多孔板），并培养所述细胞，用5％的CO 2在37℃和95％湿度下1-2天。
- 当细胞已经长大到80％汇合，除去介质和培养细胞与新媒体的相应测试物质的存在（例如，12.5微克苯丁酸氮芥/ ml的DMEM）。始终包括对照细胞（用溶剂， 例如，乙醇处理）在37℃下在一段时间内的时间（24小时，这取决于各个测定系统上）。
- 安装能够活细胞成像（37℃，5％CO 2和95％湿度），在显微镜下的培养皿。收购时间推移图像超过24小时，在预定的时间间隔。获得以10分钟的间隔图像。
- 执行手动跟踪EEC中所使用的插件的ImageJ的MTrackJ。从视场中选择10个细胞，随机，通过加入每点一个数据点在时间上使用“添加”MTrackJ的命令跟踪他们的运动。
注：MTrackJ是免费提供的ImageJ的和是availab [Meijering， Mtrackj“http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/”。]在乐[Rasband， ImageJ的。“http://rsbweb.nih.gov/ij/”。关于MTrackJ插件的详细手册可在“http://www.imagescience.org”。
6.活细胞成像/线粒体膜电位评估
- 在合适的细胞培养装置，培养欧洲经济共同体（ 例如，4厘米玻璃底培养皿适于活细胞成像）到80％汇合。
重要提示：不要培养细胞来完成汇合。 - 如果适用，揭露细胞的化学物质。注意：将细胞暴露于12.5微克/毫升苯丁酸氮芥24小时。关于具体的实验设计，指令可能会发生变化。
- 制备四甲（TMRM）在DMSO中的10mM储备溶液。避光。注意：原液可以储存在-20℃。
- 稀释原液在细胞培养基中，以具有10微米的浓度的工作溶液（1：1,000稀释度）。避光并使用尽快。注意：工作溶液可保持在室温下一段时间（> 1小时），但是，制备的新鲜工作溶液是强烈建议。
- 加2μl的工作溶液到1ml新鲜的细胞培养基中（装载溶液）。
- 通过与加载溶液更换细胞培养基加载细胞。孵育15分钟，在37℃，5％CO 2的加湿气氛（孵化）。注意：几乎所有的荧光指标是由活细胞随着时间的推移出口;因此，避免长时间加载或延迟分析。
- 无需水洗，将适用于活细胞成像显微镜下的菜。重要提示：荧光指标对光非常敏感，因此，避免不必要的曝光。
- 获取图像而无需改变采集参数，以确保不同的图像之间的可比性。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
皮肤暴露于烷化剂引发红斑，水疱形成和与伤口愈合病症相关皮肤溃疡。伤口愈合需要其基于内皮细胞迁移的血管造影和血管。定量迁移可以通过使用Boyden小室测定法进行评估。如图欧洲经济共同体的图1C暴露于烷化剂氮芥导致细胞迁移9一显著降低。除了接触苯丁酸氮芥24小时后直接活性氧清除剂的α-亚麻酸（ALA）的显著救出这种表型，几乎控制水平。
的Boyden小室测定法是一种合适的工具，以评估迁移细胞的数量（数量）。然而，该测定不能提供有关细胞的迁移行为的信息。 图2表明，未曝光欧洲经济共同体能够缩小差距，在伤口愈合和屁股在24小时内9好哦。与此相反，EEC暴露于烷化剂氮芥无法缩小差距，在伤口愈合测定9。此外，单欧洲经济共同体的细胞跟踪表明氮芥定向运动的影响下，没有观察到9。 EEC与活性氧清除剂治疗能够恢复定向细胞迁移9。
线粒体活性氧的形成已经与细胞迁移12减值有关。 如图3曝光欧洲经济共同体对苯丁酸氮芥导致线粒体膜电位9的破裂。 EEC及活性氧清除剂的治疗防止了线粒体损伤并维持线粒体膜电位。
总之，在协议部分中描述的所有方法都适合的工具来评估细胞迁移。在线粒体膜电位可以提供诉损失或保存结果aluable提示有关受损细胞迁移的分子机制。
图1. Boyden小室测定法（A）的 EEC接种在Boyden小室过滤器插入，孵育8小时，固定并用DAPI染色。星号表示迁移EEC。在所呈现的图像中的总19细胞进行计数（ 图1B）。红色箭头表示尚未跨越完全插入迁移或不完全在视场，因此被排除在细胞计数细胞。 （B）在膜中的孔（8微米），使用长曝光时间图像采集时变得可见。不要与迁移细胞混淆。 （三）控制下条件的平均212细胞通过膜迁移的。苯丁酸氮芥暴露后只有128迁移细胞。苯丁酸氮芥治疗暴露EEC与活性氧清除剂的α-亚麻酸（ALA）显著救出细胞迁移。符号代表从一个滤芯个人成绩。黑色横条表示方法（N = 4），误差棒表示SD和星号表示显著的区别。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.伤口愈合测定/小区跟踪。EEC是假治疗（交换介质），或暴露于12.5微克/毫升苯丁酸氮芥。刮伤，CELLS W后ERE调查24小时。 （ 一 ）EEC能够缩小差距，在伤口愈合测定24小时内，而苯丁酸氮芥暴露EEC无法缩小差距。治疗与ALA导致显著改善细胞迁移。 （每组15只）被示出（B）中从3个独立的各每组5技术重复实验的平均值。误差棒代表标准偏差和星号表示统计显著差异（单向ANOVA，P <0.05）。从Steinritz 等人 （2014）9修改。 请点击此处查看该图的放大版本。
线粒体膜电位。欧洲经济共同体图3.评估进行假治疗，暴露于苯丁酸氮芥（12.5微克/毫升）或chlorambucil暴露和ALA（15毫微克/毫升）处理。暴露后24小时，细胞加载TMRM进行15分钟，并立即成像。 （ 一 ）未曝光EEC透露TMRM标记后一个明显的信号，表明未损伤线粒体膜电位。 （B）的苯丁酸氮芥曝光导致显著减小TMRM信号。苯丁酸氮芥暴露EEC与活性氧清除剂的α-亚麻酸（C）治疗恢复了线粒体膜电位。 请点击此处查看该图的放大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
皮肤接触有毒化学品往往导致严重的伤口愈合障碍。基本的机制在很大程度上是未知。伤口愈合是一个复杂的过程，它由不同的阶段（止血，发炎，增殖和重塑）的。细胞迁移涉及每个阶段，然而，它是最重要的肉芽组织的形成。这里，新血管通过血管造影或血管生成要么形成。
这两个过程都需要前体和早期内皮细胞不受影响迁移。细胞迁移和明确的干扰细胞迁移的基本机制的评估，以便制定对毒物所致的伤口愈合疾病新的治疗策略高度相关。
细胞迁移可以通过不同的方法来评估。通常使用的技术是最初被引入到分析抗体 - antig的Boyden小室测定法恩趋引起白细胞13。该测定是反映细胞从Transwell小插入到下部隔室的上部隔室响应于趋化侵袭能力的定量的端点检测。在本文中所描述的技术中，没有趋化加入到下室。欧洲经济共同体下控制条件或响应于苯丁酸氮芥从而化学激活（无特定趋化无规迁移）进行了调查。
插入件包括一个多孔膜，它允许通过所述膜的孔的三维细胞迁移。该膜的孔径有相对于细胞的大小被选择：毛孔它们太小会防止细胞迁移完全，孔隙其中太大将允许所有细胞的不受阻碍的通过。对于早期的内皮细胞，建议的8微米的孔尺寸。使用了不合适的孔尺寸将导致复制的结果。在奥德R键适应的协议的细胞具有不同性质如欧洲经济共同体，我们建议从孔径比核更大并在必要时增加孔径一步一步。例如，对于小细胞如白细胞推荐的3微米的孔尺寸。
一个关键问题是孵化时间，直到分析测定。随着时间的推移，细胞增殖（至少在对照组）将发生。反过来，这将扩增的细胞可通过该膜渗透，潜在地降低了该方法的灵敏度的数目：即使有轻微受损洄游能力，细胞可以是能够迁移过长时间。因此，长时间（ 例如 24小时），不推荐使用内皮细胞。另一方面，如果该温育细胞接种后过短，细胞仅少量将已通过该膜。 8小时培养，发现最佳的。经过8小时的限定的培养时间，将细胞一重新固定，染色和手工计数。
有三种可能的方法进行分析：由拭子除去（1）在膜（即没有迁移）的顶部细胞。然后在膜（迁移细胞）的底侧上的细胞染色或者用细胞学（ 例如，苏木）或荧光染料（ 例如，DAPI）和计数。 （2）可选地，将细胞在底侧可以用荧光染料第一染和随后被分离（ 例如，通过使用胰蛋白酶）。荧光，然后通过使用荧光读取器的定量。 （3）我们建议使用阻断光透射，从而允许未迁移细胞（细胞在膜的顶部）和迁移的细胞（在膜的底部）的分化深色多孔膜。荧光染色后（细胞学染料不能使用）细胞在底侧使用荧光显微镜进行计数。重要的是不要到confound膜的方向。使用不透明的膜省却了除去未迁移的细胞。使用不透明的膜，荧光染色和手动细胞计数的已证明优于其他的方法。
在一般情况下，Boyden小室测定法是一种测定法，很容易处理，因此它是一种常用的测定法对细胞迁移的评估。然而，也有两个主要缺点：（1）Boyden小室测定法是端点检测。这意味着，如果分析的时间点不正确，结果可能会产生误导。 （2）的测定法，是不容易实现自动化。然而，该测定是为细胞迁移的评估的最有价值的工具之一。
与此相反的静态Boyden小室测定法中，在伤口愈合测定（也被称为间隙闭合测定或划痕测定）是一种动态分析的实时性。这是一个没有三维细胞侵袭运动二维迁移试验。后“伤人”的用移液管尖端的细胞层，细胞迁移到间隙。该法是简单执行，避免了静态端点检测的问题。但是，测定具有一定的挑战：（1）一个活细胞成像显微系统（37℃，5％的CO 2与湿润气氛）是必需的。确保细胞培养皿不干燥。 （2）时间推移图像采集将导致根据所使用的参数（分辨率，间隔）大的数据文件。 （3）与一个枪头划伤细胞层并不像开始时可能会容易。过大的压力会损坏餐具表面可能导致伪像。此外，间隙宽度可以不同划痕内和不同的研究人员之间可能有所不同。一个有经验的研究者建议。 （4），可并行运行的样品的数目由设备的限制。尽管如此，伤口愈合检测是定量和QUAL另一个有价值的工具细胞迁移的权威的评估。有关迁移的速度，迁移距离信息，定向迁移可以齐聚一堂实验装置。在二维系统细胞跟踪是不是很困难的，可以用开源软件（ 如 ImageJ的和MTrackJ）进行。
的细胞培养皿涂层不是细胞附着唯一重要的，但现在就迁移对细胞功能的显著影响。内皮细胞常规培养在0.1％明胶包被的表面。使用的非涂布浮出水面内皮细胞培养导致减少的增殖14。其它涂层（ 例如，纤连蛋白）被发现也适用于短期培养，但是，明胶涂层表现出优越的性能在长期培养实验15。
目前市场上众多的荧光染料活细胞成像。我们已经町孙中山TMRM调查线粒体膜电位。许多其它染料（ 例如，JC-1，TMRE）表现出相当的性能。相较于单色探头（TMRM，TMRE），JC-1荧光的变化从绿色到红色堆积在线粒体后。这使得线粒体极化状态的比例的半定量分析，但阻碍了双染色实验（ 例如，使用跟踪器的染料，以确定线粒体）16。根据我们的经验，而实验设计，细胞处理和收购是具有挑战性的，需要更多的注意染料本身就是对实验那么重要。几乎所有的荧光染料的光敏感。因此，小区负载应在黑暗中进行。小区负载需要15-30分钟。长时间的加载时间不会导致增加的信号，不建议。虽然具体的信号后，可以装载长的时间进行检测，染料可能会积聚在细胞内舱室ments甚至有可能从细胞中排出。其结果是，细胞应刚好在分析前，不一定装载在实验的开始。在染料加载浓度通常为在10μM的范围内。然而，随着TMRM非常低的浓度（20纳米）被发现足够的标签和仍然给了合理的结果。 如图3标记后24小时氮芥曝光导致线粒体膜电位的不同的损失。苯丁酸氮芥治疗暴露EEC与活性氧清除剂能在初步接触后维持线粒体膜电位的24小时。
综上所述，Boyden小室法，伤口在单细胞分析跟踪相结合治疗法是有价值的工具，以评估有关定性和定量方面的迁移行为。线粒体膜电位与TMRM的标签可以帮助识别潜在的机制。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Boyden Chamber | |||
| Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 3 µm | Corning Incorporated | #351151 | |
| Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 8 µm | Life Sciences | #351152 | |
| (for use with Falcon Insert 24 well Companion Plate (353504) | |||
| Wound healing assay | |||
| Glass bottom dishes | Word Precision Instruments, Inc. | #FD35-100 | |
| Assessment of mitochondrial potential | |||
| TMRM (tetramethylrhodamine methyl ester) | Life Technologies | #T669 | |
| Cell culture | |||
| Accutase | PAA, Pasching, Austria | # L11-007 | |
| α-Linolenic acid | Fluka (Sigma), Steinheim, Germany | # L2376 | |
| Chlorambucil | Fluka (Sigma), Steinheim, Germany | # 23125 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany | # G2500-100G |
References
- Bauer, S. M., Bauer, R. J., Velazquez, O. C. Angiogenesis, vasculogenesis, and induction of healing in chronic wounds. Vascular and Endovascular Surgery. 39, 293-306 (2005).
- Reinke, J. M., Sorg, H.
- Hart, J. Inflammation. 1: Its role in the healing of acute wounds. Journal of Wound Care. 11, 205-209 (2002).
- Liu, Z. J., Hyperoxia Velazquez, O. C. endothelial progenitor cell mobilization, and diabetic wound healing. Antioxidants & Redox Signaling. 10, 1869-1882 (2008).
- Gallagher, K. A., Goldstein, L. J., Thom, S. R., Velazquez, O. C. Hyperbaric oxygen and bone marrow-derived endothelial progenitor cells in diabetic wound healing. Vascular. 14, 328-337 (2006).
- Kehe, K., Balszuweit, F., Steinritz, D., Thiermann, H. Molecular toxicology of sulfur mustard-induced cutaneous inflammation and blistering. Toxicology. 263, 12-19 (2009).
- Schmidt, A., et al. Nitrogen mustard (Chlorambucil) has a negative influence on early vascular development. Toxicology. 263, 32-40 (2009).
- Steinritz, D., et al. Effect of N-acetyl cysteine and alpha-linolenic acid on sulfur mustard caused impairment of in vitro endothelial tube formation. Toxicological Sciences. 118, 521-529 (2010).
- Steinritz, D., et al. Chlorambucil (nitrogen mustard) induced impairment of early vascular endothelial cell migration - Effects of alpha-linolenic acid and N-acetylcysteine. Chemico-biological Interactions. 219C, 143-150 (2014).
- Schmidt, A., et al. Influence of endostatin on embryonic vasculo- and angiogenesis. Developmental Dynamics : an Official Publication of the American Association of Anatomists. 230, 468-480 (2004).
- Dainiak, M. B., Kumar, A., Galaev, I. Y., Mattiasson, B.
- Wang, Y., et al. Regulation of VEGF-induced endothelial cell migration by mitochondrial reactive oxygen species. American Journal of Physiology. Cell physiology. 301, C695-C704 (2011).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
- Relou, I. A., Damen, C. A., van der Schaft, D. W., Groenewegen, G., Griffioen, A. W. Effect of culture conditions on endothelial cell growth and responsiveness. Tissue & Cell. 30, 525-530 (1998).
- Smeets, E. F., von Asmuth, E. J., vander Linden, C. J., Leeuwenberg, J. F., Buurman, W. A. A comparison of substrates for human umbilical vein endothelial cell culture. Biotechnic & Histochemistry : Official Publication of the Biological Stain Commission. 67, 241-250 (1992).
- Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. BioTechniques. 50, 98-115 (2011).
