Abstract
La exposición a sustancias químicas (incluyendo alquilantes agentes de guerra química, como mostazas de azufre y nitrógeno) causa una gran cantidad de síntomas clínicos incluyendo trastorno de cicatrización de heridas. El proceso fisiológico de la cicatrización de la herida es muy compleja. La formación de tejido de granulación es un paso clave en este proceso resulta en un cierre de la herida preliminar y proporcionar una red de nuevos vasos sanguíneos capilares - ya sea a través de la vasculogénesis (formación de novela) o la angiogénesis (crecimiento de vasos existentes). Tanto vasculopatía y la angiogénesis requieren funcional, la migración dirigida de células endoteliales. Por lo tanto, la investigación de la migración temprana de células endoteliales (CEE) es importante para comprender la fisiopatología de los trastornos inducidos química herida curativa y potencialmente identificar nuevas estrategias para la intervención terapéutica.
Se evaluó la alteración de la cicatrización de la herida después de la exposición alquilantes agente y probado compuestos candidatos potenciales para el tratamiento. Se utilizó un conjunto de técnicas descritas en este protocolo. Una cámara de Boyden modificada para investigar cuantitativamente chemokinesis del CEE se describe. Además, se ilustra el uso de la cicatrización de la herida ensayo en combinación con el análisis de pista para evaluar cualitativamente la migración. Finalmente, se demuestra el uso de la TMRM colorante fluorescente para la investigación del potencial de membrana mitocondrial para identificar los mecanismos subyacentes de la migración celular perturbada. El siguiente protocolo describe las técnicas básicas que han sido adaptados para la investigación de la CEE.
Introduction
La migración celular es importante en muchos procesos fisiológicos y fisiopatológicos, incluyendo el desarrollo, diversas enfermedades, y curación de heridas después de una lesión de la piel.
Después de una lesión de la piel, la inflamación elimina unidades de tejido de granulación y dañadas o necróticas cierre de la herida preliminar y permite la formación de una red de nuevos capilares a través de la vasculogénesis (formación de novela) o la angiogénesis (surgimiento de vesículas existentes) 1-3. Tanto vasculopatía y la angiogénesis requieren migración de las células endoteliales. La creciente red de vasos sanguíneos es esencial para el transporte de oxígeno y nutrientes a la proliferación de los queratinocitos que sufren en última instancia, la queratinización, formar un nuevo epitelio y proporcionar cierre de la herida.
Deterioro de la migración de las células endoteliales es una causa subyacente de la cicatrización de heridas trastorno 4,5. Por lo tanto, los métodos para evaluar la migración de las células endoteliales primeros están obligados a explorar la pathophysiolgía de trastornos de la migración celular y para identificar nuevas estrategias para la intervención terapéutica.
La exposición dérmica a los agentes alquilantes (por ejemplo, azufre y mostazas de nitrógeno) provoca la cicatrización de heridas trastorno 6. Estos compuestos se utilizan como agentes de guerra química en varios conflictos en el siglo 20 y se mantienen razón de gran preocupación debido a las reservas existentes en regiones políticamente inestables y la relativamente simple síntesis. Aunque la mostaza de azufre se sintetizó por primera vez en 1822, la patología molecular y clínica de la exposición SM no se entiende en detalle y no antídoto para la exposición SM ha sido identificado.
Se han realizado varios estudios para entender y modelar problemas de cicatrización de la herida después de la exposición SM y para detectar si existen compuestos candidatos potenciales capaces de reservar ese efecto. Schmidt et al. (2009) probó el efecto de clorambucilo, un compuesto alquilante con propiedades similares a SM en mouSE modelos de cuerpo embrioide y encontrado una, a veces dramática reducción de más del 99% en la formación de vasos 7. Este efecto adverso fue más pronunciado en una etapa de desarrollo que, en condiciones fisiológicas, está dominada por la proliferación y migración de las células precursoras endoteliales vasculares. Por lo tanto, se identificaron estas células para ser particularmente sensibles a los agentes alquilantes. Steinritz et al. (2010) probó eliminadores de especies reactivas de oxígeno (ROS), en particular, N-acetilcisteína (NAC) y el ácido alfa linolénico (ALA) por su capacidad para reducir la toxicidad SM en modelos de ratón del cuerpo embrioide y, en particular, a restaurar la formación de vasos 8. Se observaron efectos protectores temporales, lo que indica que la formación excesiva de ROS era probable que contribuya a los efectos adversos de SM en la cicatrización de heridas. Estos efectos no eran permanentes y los dos compuestos candidatos pueden no ser capaz de restaurar la formación de vasos y la cicatrización de heridas en el largo plazo 8. However, esos experimentos se realizaron en un modelo 3D complejo que hizo permitir la investigación de la migración celular. Por lo tanto, posteriormente probado NAC y ALA para los efectos beneficiosos sobre la migración de células de CEE que tienen un papel clave en el proceso de formación de vasos 9.
Además, hay evidencia de que se requiere la polaridad celular para la migración celular. La disfunción mitocondrial que conduce a la formación de ROS se demostró que deteriorar la polaridad celular y por lo tanto puede afectar adversamente la migración celular. Por lo tanto, se realizó imágenes de células vivas con respecto a la función mitocondrial y se examinaron los efectos de los basureros ROS. El siguiente protocolo describe los requisitos generales para el cultivo de la CEE, el ensayo de cámara de Boyden, la cicatrización de heridas ensayo incluyendo el análisis de rastreo celular y el uso de TMRM para la evaluación de la función mitocondrial en detalle. Se destacan aspectos importantes de protocolos experimentales para el cultivo CEE y la migración.
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Protocol
El siguiente protocolo describe técnicas para la investigación de los principios de la migración celular endotelial. El cultivo apropiado de las células endoteliales vasculares requiere pre-revestimiento de frascos de cultivo celular con gelatina para asegurar la proliferación y el mantenimiento de un fenotipo endotelial.
1. Pre-recubrimiento de frascos de cultivo celular
- Disolver la gelatina en PBS 0,1 M a una concentración final de 0,1%.
- Autoclave la solución con parámetros para autoclave líquido (para más detalles ver las instrucciones del autoclave específico).
- Añadir un volumen suficiente de la solución de gelatina en autoclave a un matraz de cultivo celular estéril (por ejemplo, al menos 5 ml para un matraz de cultivo celular T25).
- Transferencia de los matraces en una incubadora (37 ° C, 5% de CO 2 no es necesaria, pero no interfiere) durante al menos 30 min.
- Retire la solución de gelatina restante. Utilice los frascos previamente recubierto posteriormente (véase el cultivo celular) o srasgó en condiciones estériles hasta su uso.
2. El cultivo celular de las células endoteliales primeros
Nota: células madre embrionarias derivadas de células endoteliales primeros (CEE) se obtuvieron a partir de cuerpos embrioides murinos diferenciados por clasificación de células magnético activado de la fracción de células PECAM-1 positivo como se describe anteriormente 10,11.
- Cultura CEE sobre placas de cultivo celular recubiertas con gelatina en DMEM suplementado con 15% de FCS, 50 U / ml de penicilina, 50 U / ml de estreptomicina, 200 mM L-glutamina, 100 mM ß-mercaptoetanol y 1% de aminoácidos no esenciales. Manipular células en condiciones estériles. Cultivar las células con 5% de CO 2 a 37 ° C y 95% de humedad hasta sub-confluencia (máx. 80%).
- En sub-confluencia, dividir las células a una proporción de 1: 5. Nota: El desprendimiento de las células endoteliales es un paso crítico.
- Recoger las células con RT accutase. Retire los medios de comunicación, enjuagar con PBS y añadir 1 ml de accutase por 25 cm
- Incubar el matraz a temperatura ambiente durante 2-10 min hasta que las células se han desprendido. Dispersar las células y transferirlos a la aplicación deseada. Nota: Un neutralización química de la accutase no se requiere, ya que tiene lugar cuando las células sembradas se almacenan en la incubadora a 37 ° C. Sin embargo, accutase actividad también se puede disminuir mediante la adición de DMEM que contiene FCS.
- Recoger las células con RT accutase. Retire los medios de comunicación, enjuagar con PBS y añadir 1 ml de accutase por 25 cm
3. Cámara Boyden
Nota: Los ensayos de cámara de Boyden se llevan a cabo mediante el uso de sistemas de inserción de tereftalato de polietileno de luz opaca con 8 micras de tamaño de poro.
- Pre-coat los insertos de filtro (que caben dentro de pocillos de cultivo celular, creando así una cámara de Boyden) mediante la adición de 500 l de 0,1% de gelatina disueltos en 0,1 M PBS durante al menos 30 min.
- Si las células son de estar expuestos a productos químicos tóxicos, exponer de acuerdo con el diseño experimental específico antes de la recolección de células. Nota: Las células fueron expuestas a 12,5 g clorambucil / ml DMEMdurante 24 horas. Con respecto al diseño experimental específica, las instrucciones pueden variar.
- Cosecha CEE y determinar el número de células mediante el uso de una cámara de celular contando. Nota: Los dispositivos automáticos de conteo pueden utilizarse, pero deben usarse con precaución: el recuento de células manual es más precisa y es muy recomendable.
- Añadir 500 l medio de cultivo celular en el compartimiento de la cámara inferior de la cámara de Boyden.
- Agregar exactamente 10 4 500 CEE en medio de cultivo celular l por elemento filtrante en el compartimiento de la cámara superior. Eliminar las burbujas.
- Incubar los insertos de filtro en la incubadora durante exactamente 8 horas.
- Enjuagar con PBS una vez y reemplazar el medio con 0,5 ml 4% de paraformaldehído en ambos compartimientos durante 25 min para la fijación celular. Lavar el filtro ampliamente pero por lo menos 3 veces con 0,1 M PBS.
- Extirpar las membranas con un bisturí.
- Monte la membrana entre dos cubreobjetos de vidrio con medio de montaje que contiene DAPI para stainin nuclearg. Preste atención a la orientación. Asegúrese de que sólo las células que han migrado hacia el lateral del compartimento inferior de la membrana se cuentan.
- Recuento de células que han migrado hacia el lateral del compartimento inferior de la membrana con un microscopio de fluorescencia a una ampliación de 400X. No confunda poros de la membrana con células migraron (Figura 1A, 1B). Investigar un número razonable de réplicas biológicas (al menos 3 repeticiones biológica por condición).
4. Curación de Heridas Ensayo
- Dependiendo del equipo disponible, elegir con cuidado las placas de cultivo celular o placas: Cuando se utiliza la microscopía DIC, evitar la superficie de plástico placas de cultivo basados o placas bien pero utilizar dispositivos basados vidrio en su lugar.
Nota: Si se utiliza la microscopía de contraste de fase, basada en platos de plástico también se pueden utilizar. - Cultivar CEE en un dispositivo de cultivo celular adecuado (por ejemplo, 4 cm con fondo de cristal placa de Petri adecuado para imágenes de células vivas) Hasta 80% de confluencia. Importante: no cultivar las células para completar confluencia.
- Raspe las monocapas con 10 puntas de pipeta estériles l. Empuje la punta suavemente sin demasiada presión sobre la superficie del plato y moverlo en línea recta suavemente de un lado a other.Wash las células dos veces con 0,1 M PBS para eliminar las células desprendidas.
- Añadir un volumen suficiente de medio a la placa de cultivo. En su caso, añadir compuestos que deben ser investigados.
Nota: 1,5 ml de medio que contiene 15 ng / ml alfa se añadió ácido linolénico. - Monte la placa de cultivo con un microscopio capaz de imágenes de células vivas. Asegúrese de 5% de CO2, 37 ° C y una atmósfera húmeda.
Nota: La humidificación es especialmente importante para evitar la evaporación medio. - Adquirir imágenes con lapso de tiempo de más de 24 horas a intervalos de 10 min. Plan de archivos de gran tamaño. Nota: Una resolución de 512 x 512 píxeles suele ser suficiente; Sin embargo, se recomienda el uso de imágenes de al menos 1024 x 1,024.
- Mida la anchura del hueco en t = 0 horas y en t = 24 h utilizando la herramienta de longitud del software suministrado con el microscopio o el uso de software de código abierto (por ejemplo, ImageJ). Nota: En general, el software específico de adquisición y análisis de imagen es proporcionada por el fabricante. Por lo tanto, para los detalles técnicos relacionados con el uso del software, consulte el manual.
Seguimiento 5. celular
- Dependiendo del equipo disponible, elegir con cuidado las placas de cultivo celular o placas: Cuando se utiliza la microscopía DIC, evitar la superficie de plástico placas de cultivo basados o placas bien pero utilizar dispositivos basados vidrio en su lugar.
Nota: Si se utiliza la microscopía de contraste de fase, basada en platos de plástico también se pueden utilizar. - Semilla de 5 x 10 4 CEE en DMEM complementado en un dispositivo de cultivo celular adecuado (por ejemplo, placa de 24 pocillos múltiples) y cultivar las células con 5% de CO 2 a 37 ° C y 95% de humedad durante 1-2 días.
- Cuando las células han crecido hasta un 80% De confluencia, retire los medios y la cultura de las células con los nuevos medios de comunicación en la presencia de las sustancias de ensayo respectivos (por ejemplo, 12,5 g clorambucil / ml de DMEM). Siempre incluir células de control (tratados con el disolvente, por ejemplo, etanol) a 37 ° C durante un cierto período de tiempo (24 hr, dependiendo del sistema de ensayo individual).
- Montar la placa de cultivo bajo un microscopio capaz de formación de imágenes en vivo de células (37 ° C, 5% de CO 2 y 95% de humedad). Adquirir imágenes con lapso de tiempo de más de 24 horas a intervalos predefinidos. Adquirir imágenes a intervalos de 10 min.
- Realizar seguimiento manual del CEE, por el uso del plugin de ImageJ MTrackJ. Elija 10 células al azar desde el campo de visión y un seguimiento de sus movimientos mediante la adición de un punto de datos por cada punto en el tiempo con el "Añadir" mando de MTrackJ.
Nota: MTrackJ está disponible de forma gratuita en y ImageJ es availab [Meijering, Mtrackj "http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/".]le a [Rasband, ImageJ. "http://rsbweb.nih.gov/ij/"]. Un manual detallado sobre el plugin MTrackJ está disponible en "http://www.imagescience.org".
6. Imágenes de células vivas / Evaluación de la membrana mitocondrial Potencial
- Cultivar CEE en un dispositivo de cultivo celular adecuado (por ejemplo, 4 cm de vidrio placa de Petri fondo adecuado para imágenes de células vivas) hasta una confluencia del 80%.
Importante: No cultivar las células para completar confluencia. - En su caso, exponer las células a los productos químicos. Nota: Las células fueron expuestas a 12,5 mg / ml clorambucil durante 24 horas. Con respecto al diseño experimental específica, las instrucciones pueden variar.
- Preparar una solución madre 10 mM de tetrametilrodamina (TMRM) en DMSO. Proteger de la luz. Nota: La solución madre se puede almacenar a -20 ° C.
- Diluir la solución madre en medio de cultivo celular a una solución de trabajo con una concentración de 10 micras (1: 1000 dilución). Proteger de la luzy utilizar tan pronto como sea posible. Nota: La solución de trabajo se puede mantener a temperatura ambiente durante algún tiempo (> 1 hr), sin embargo, es muy recomendable preparación de una solución de trabajo fresco.
- Añadir 2 l de la solución de trabajo de 1 ml de medio (solución) de carga fresca de cultivo celular.
- Cargar las células mediante la sustitución del medio de cultivo celular con la solución de carga. Incubar durante 15 minutos a 37 ° C, 5% de CO 2 y el ambiente humidificado (incubadora). Precaución: Casi todos los indicadores de fluorescencia son exportados por las células a través del tiempo de vida; por lo tanto, evitar la carga prolongada o retardada análisis.
- Sin lavado, colocar el plato con un microscopio adecuado para imágenes de células vivas. Importante: los indicadores de fluorescencia son muy sensibles a la luz, por lo tanto, evitar la exposición a la luz innecesaria.
- Adquirir imágenes sin cambiar los parámetros de adquisición para asegurar la comparabilidad entre las diferentes imágenes.
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Representative Results
La exposición dérmica a los agentes alquilantes provoca eritema, formación de ampollas y la ulceración dérmica que está asociada con un trastorno de cicatrización de la herida. La cicatrización de heridas requiere vasculogénesis y angiogénesis, que se basa en la migración de las células endoteliales. Migración cuantitativa se puede evaluar mediante el uso del ensayo de cámara de Boyden. Como se muestra en la Figura 1C de la exposición a la CEE clorambucil agente alquilante dado lugar a una disminución significativa en la migración celular 9. La adición del ácido linolénico ROS scavenger-alfa (ALA) directamente después de la exposición al clorambucil para 24 hr rescató significativamente este fenotipo, casi a los niveles de control.
El ensayo de cámara de Boyden es una herramienta adecuada para evaluar el número (cantidad) de las células migradas. Sin embargo, el ensayo no proporciona información sobre el comportamiento de la migración de las células. Figura 2 demuestra que no expuesta CEE son capaces de cerrar la brecha en la herida y la curación de culoay dentro de 24 horas 9. Por el contrario, CEE expuesto al clorambucil agente de alquilación no fueron capaces de cerrar la brecha en la cicatrización de heridas ensayo 9. Por otra parte, el seguimiento de celda de un solo CEE reveló que bajo la influencia de clorambucilo movimiento dirigido no se observó 9. El tratamiento de la CEE con Ros-carroñeros fue capaz de restablecer la migración celular dirigida 9.
La formación de ROS mitocondrial se ha asociado con el deterioro de la migración celular 12. Como se muestra en la Figura 3 de la exposición CEE al clorambucil dado lugar a la ruptura de potencial de membrana mitocondrial 9. El tratamiento de la CEE con ROS-scavenger evita el daño mitocondrial y se mantiene el potencial de membrana mitocondrial.
En resumen, todos los métodos descritos en la sección de protocolo son herramientas adecuadas para evaluar la migración de células. Los hallazgos en la pérdida o la preservación del potencial de membrana mitocondrial puede proporcionar vconsejos aluable sobre los mecanismos moleculares subyacentes de la migración celular alterada.
Figura 1. ensayo de cámara de Boyden. (A) CEE se sembraron en Boyden elementos filtrantes de cámara, se incubaron durante 8 horas, se fijaron y tiñeron con DAPI. Los asteriscos indican emigraron CEE. En la imagen que se presenta un total de 19 células puede ser contado (Figura 1B). Puntas de flechas rojas indican las células que no han migrado a través de la inserción completa o que no son por completo en el campo de visión y por lo tanto fueron excluidos del recuento celular. (B) Los poros (8 micras) en la membrana se hacen visibles al utilizar tiempos de exposición largos para la adquisición de imágenes. No se debe confundir con células migraron. (C) Bajo controlcondiciones de un promedio de 212 células migradas a través de la membrana. Exposición clorambucil dio lugar a sólo 128 células migraron. El tratamiento de la CEE clorambucil expuestos con el ácido linolénico ROS-carroñero alfa (ALA) la migración celular rescatado significativamente. Los símbolos representan los resultados individuales de un elemento filtrante. Barras horizontales negras indican medios (n = 4), barras de error indican SD y asteriscos indican diferencias significativas. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Herida curativa ensayo de seguimiento / célula. CEE-farsa fueron tratados (cambio de medio) o expuesto a 12,5 mg / ml clorambucil. Después de rascarse, células were investigó durante 24 horas. (A) CEE fueron capaces de cerrar la brecha en el ensayo de la curación de la herida dentro de las 24 horas, mientras que el clorambucil expuesta CEE no fueron capaces de cerrar la brecha. El tratamiento con ALA resultó en una mejora significativa de la migración celular. (B) Los valores medios de 3 experimentos independientes, cada uno con 5 repeticiones técnica por grupo (n = 15 por grupo) se muestran. Las barras de error representan las desviaciones estándar y asteriscos indican diferencias estadísticas significativas (ANOVA de una vía, p <0,05). Modificado de Steinritz et al. (2014) 9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Evaluación de la membrana mitocondrial potencial. CEE eran-farsa tratado, expuesto a clorambucil (12,5 g / ml) o chlorambUCIL expuesta y ALA (15 ng / ml) tratados. 24 hr después de la exposición, las células se cargaron con TMRM durante 15 min e inmediatamente fotografiado. (A) no expuesta CEE reveló una señal distinta después del marcaje TMRM que indica un potencial de membrana mitocondrial intacta. Exposición (B) El clorambucilo resultó en una disminución significativa de la señal de TMRM. (C) El tratamiento de clorambucil expuestas CEE con el ácido alfa linolénico ROS-carroñero restauró el potencial de membrana mitocondrial. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La exposición dérmica a productos químicos tóxicos a menudo resulta en el trastorno de la cicatrización de heridas graves. Los mecanismos subyacentes son en gran parte desconocido. La cicatrización de heridas es un proceso complejo que consta de diferentes fases (hemostasia, inflamación, proliferación y remodelación). La migración celular está involucrado en cada fase, sin embargo, es de suma importancia para la formación del tejido de granulación. Aquí, los nuevos vasos sanguíneos se forman ya sea por angio- o vasculogénesis.
Ambos procesos requieren la migración no afectado de precursores y células endoteliales temprana. Evaluación de la migración celular y la aclaración de los mecanismos subyacentes de la migración celular alterada es de gran relevancia para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas contra trastornos de cicatrización de la herida inducida tóxico.
La migración celular se puede evaluar mediante diferentes enfoques. Una técnica muy utilizada es el ensayo de cámara de Boyden que se introdujo originalmente para analizar anticuerpos antigen causó la quimiotaxis en los leucocitos 13. Este ensayo es un ensayo de punto final cuantitativo que refleja la capacidad de invasión de las células del compartimiento superior de un inserto de transwell para el compartimiento inferior en respuesta a un quimioatrayente. En la técnica descrita en este documento, no se añadió quimioatrayente a la cámara inferior. Por lo tanto chemokinesis (migración aleatoria sin un quimioatrayente específico) de CEE bajo condición de control o en respuesta a clorambucil se investigó.
El inserto se compone de una membrana porosa que permite la migración de células de tres dimensiones a través de los poros de la membrana. El tamaño de poro de la membrana tiene que ser elegido en relación con el tamaño de celda: los poros que son demasiado pequeños impedirá la migración de células completamente, los poros que son demasiado grandes permitirá pasar sin obstáculos de todas las células. Para las células endoteliales primeros, se recomienda un tamaño de poro de 8 micras. El uso de un tamaño de poro apropiado dará lugar a resultados irreproducibles. En order para adaptar el protocolo a las células con diferentes propiedades como CEE, se recomienda comenzar con un tamaño de poro más grande que los núcleos y aumentar el tamaño de los poros paso a paso si es necesario. Por ejemplo, para las pequeñas células, como los leucocitos se recomienda un tamaño de poro de 3 micras.
Una cuestión crítica es la determinación del tiempo de incubación hasta el análisis. Con el tiempo, la proliferación celular (al menos en los grupos de control) se llevará a cabo. Esto a su vez amplificar el número de células que pueden penetrar a través de la membrana, reduciendo potencialmente la sensibilidad del método: incluso con capacidades migratorias ligeramente con discapacidad, las células pueden ser capaces de migrar durante largos períodos de tiempo. Por lo tanto, no se recomiendan largos períodos (por ejemplo, 24 h) para las células endoteliales. Por otro lado, si la incubación es demasiado corto después de la siembra de células, sólo cantidades menores de células habrán pasado la membrana. Una incubación de 8 horas se encontró óptima. Después del tiempo de incubación definido de 8 horas, las células de unre fija, tiñeron y se contaron manualmente.
Hay tres posibles enfoques para el análisis: (1) Células en la parte superior de la membrana (que no han emigrado) se eliminan mediante un hisopo. A continuación, se tiñen las células en el lado inferior de la membrana (células migradas) ya sea con un citológico (por ejemplo, hematoxilina) o un colorante fluorescente (por ejemplo, DAPI) y se cuentan. (2) Alternativamente, las células en el lado inferior se pueden teñir con un colorante fluorescente primero y después se separan (por ejemplo, por el uso de tripsina). La fluorescencia se cuantifica luego por el uso de un lector de fluorescencia. (3) Se recomienda el uso de membranas porosas de color oscuro que bloquean la transmisión de la luz lo que permite la diferenciación de las células no migradas (células en la parte superior de la membrana) y células migraron (en la parte inferior de la membrana). Después de la tinción de fluorescencia (colorantes citológicos no pueden utilizarse) las células en el lado inferior se contaron usando un microscopio de fluorescencia. No es importante para confound la orientación de la membrana. El uso de una membrana opaca obvia la necesidad de eliminar las células no migradas. El uso de membranas opacas, tinción fluorescente y el conteo de células manual ha resultado superior a los otros enfoques.
En general, el ensayo de cámara de Boyden es un ensayo que es fácil de manejar y por lo tanto es un ensayo utilizado con frecuencia para la evaluación de la migración celular. Sin embargo, hay dos desventajas principales: (1) El ensayo de cámara de Boyden es un ensayo de punto final. Eso significa que, si el punto de análisis de tiempo no es correcta, el resultado puede ser engañoso. (2) El ensayo no es fácil de automatizar. Sin embargo, este ensayo es una de las herramientas más valiosas para la evaluación de la migración celular.
En contraste con el ensayo de cámara de Boyden estática, la cicatrización de heridas de ensayo (también referido como ensayo de reducción de distancias o ensayo de cero) es un ensayo dinámico en tiempo real. Es un ensayo de dos dimensiones migración sin tres movimientos de invasión celular dimensionales. Después de "herir" de capas de células con una punta de pipeta, las células migran hacia la brecha. El ensayo es fácil de realizar y evita los problemas de un ensayo de punto final estático. Sin embargo, el ensayo tiene algunos problemas: (1) un sistema microscópico imágenes de células vivas (37 ° C, 5% de CO 2 con atmósfera húmeda) es necesaria. Asegúrese de que las placas de cultivo celular no se sequen. (2) la adquisición de imágenes Time-lapse se traducirá en grandes archivos de datos en función de los parámetros (resolución, intervalo) utilizados. (3) El rascarse la capa de células con una punta de pipeta no es tan fácil como puede parecer inicialmente. Demasiada presión puede dañar la superficie del plato que puede resultar en artefactos. Por otra parte, la anchura del espacio puede ser diferente en el cero y puede diferir entre los distintos investigadores. Se recomienda un investigador experimentado. (4) El número de muestras que se pueden ejecutar en paralelo está limitada por el equipo. Sin embargo, la cicatrización de heridas ensayo es otra herramienta valiosa para el cuantitativo y qualevaluación itative de la migración celular. Información sobre la velocidad de la migración, la distancia de migración, la migración dirigida puede ser recogida en una configuración experimental. Seguimiento de la célula en un sistema de dos dimensiones no es muy difícil y se puede realizar con el software de código abierto (por ejemplo, ImageJ y MTrackJ).
Recubrimiento de las placas de cultivo celular no sólo es importante para la unión celular, pero tiene una influencia significativa en la función celular con respecto a la migración. Las células endoteliales se cultivaron rutinariamente en 0,1% superficies revestidas de gelatina. El uso de no recubierto con superficie para el cultivo de células endoteliales resultó en disminución de la proliferación 14. Otros revestimientos (por ejemplo, fibronectina) se encontraron también es adecuado para el cultivo a corto plazo, sin embargo, los recubrimientos de gelatina mostraron un rendimiento superior en experimentos de cultivo a largo plazo 15.
Hay numerosos tintes de fluorescencia en el mercado de imágenes de células vivas. Hemos chosen TMRM para investigar el potencial de la membrana mitocondrial. Muchos otros colorantes (por ejemplo, JC-1, TMRE) exhiben un rendimiento comparable. En contraste con sondas monocromáticas (TMRM, TMRE), JC-1 de fluorescencia turnos de verde a rojo después de la acumulación en la mitocondria. Esto permite un análisis semi-cuantitativo radiométrica del estado de polarización mitocondrial pero dificulta experimentos de tinción doble (por ejemplo, el uso de tintes de seguimiento para identificar las mitocondrias) 16. En nuestra experiencia el propio colorante es menos crítica para el experimento, mientras que el diseño experimental, la manipulación de células y la adquisición es difícil y requiere mucha más atención. Casi todos los tintes fluorescentes son sensibles a la luz. Por lo tanto, la carga de células se debe hacer en la oscuridad. Carga de la célula requiere 15-30 min. Tiempo de carga prolongada no resulta en un aumento de las señales y no se recomienda. Aunque las señales específicas podrían ser detectados después de períodos largos de carga, el colorante podría acumularse en compartimiento subcelularmentos o incluso podrían ser dados de alta de la célula. Como consecuencia, las células deben cargarse justo antes de análisis y no necesariamente al comienzo del experimento. La concentración de carga de colorante generalmente está en el intervalo de 10 mM. Sin embargo, con TMRM se encontraron concentraciones mucho más bajas (20 nM) suficiente para el etiquetado y todavía dieron resultados razonables. Como se muestra en la Figura 3 etiquetado 24 hr después de la exposición clorambucil resultó en una pérdida distinto del potencial de membrana mitocondrial. El tratamiento de clorambucil expuesto CEE con Ros-carroñeros fue capaz de mantener el potencial de membrana mitocondrial a las 24 horas después de la exposición inicial.
En resumen, el ensayo de cámara de Boyden, cicatrización de heridas ensayo en combinación con el análisis sola pista celular son herramientas valiosas para evaluar el comportamiento de la migración en relación con los aspectos cualitativos y cuantitativos. Etiquetado del potencial mitocondrial con TMRM puede ayudar a identificar los mecanismos subyacentes.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Boyden Chamber | |||
| Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 3 µm | Corning Incorporated | #351151 | |
| Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 8 µm | Life Sciences | #351152 | |
| (for use with Falcon Insert 24 well Companion Plate (353504) | |||
| Wound healing assay | |||
| Glass bottom dishes | Word Precision Instruments, Inc. | #FD35-100 | |
| Assessment of mitochondrial potential | |||
| TMRM (tetramethylrhodamine methyl ester) | Life Technologies | #T669 | |
| Cell culture | |||
| Accutase | PAA, Pasching, Austria | # L11-007 | |
| α-Linolenic acid | Fluka (Sigma), Steinheim, Germany | # L2376 | |
| Chlorambucil | Fluka (Sigma), Steinheim, Germany | # 23125 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany | # G2500-100G |
References
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