Abstract
L'exposition à des substances chimiques (y compris les agents alkylants de guerre chimiques tels que les moutardes à l'azote et soufre) provoque une grande variété de symptômes cliniques, y compris le trouble de guérison de la plaie. Le processus physiologique de cicatrisation de la plaie est très complexe. La formation de tissu de granulation est une étape clé dans ce processus résultant dans un avant fermeture de la plaie et de fournir un réseau de nouveaux vaisseaux sanguins capillaires - soit par vasculogenèse (formation de roman) ou angiogenèse (la germination des navires existants). Les deux vasculo- et nécessitent une angiogenèse fonctionnel, la migration dirigée des cellules endothéliales. Ainsi, l'enquête du début de cellules endothéliales (CEE) la migration est important de comprendre la physiopathologie de la plaie chimique induite par les troubles de guérison et de potentiellement identifier de nouvelles stratégies d'intervention thérapeutique.
Nous avons évalué la guérison des plaies après alkylation exposition de l'agent et testé des composés candidats potentiels pour traitement. Nous avons utilisé un ensemble de techniques décrites dans ce protocole. Une chambre de Boyden modifiée pour enquêter quantitativement chimiokinèse des CEE est décrite. En outre, l'utilisation de la cicatrisation dosage en combinaison avec l'analyse de piste afin d'évaluer qualitativement la migration est illustré. Enfin, nous démontrons l'utilisation de la TMRM de colorant fluorescent pour l'enquête du potentiel de membrane mitochondriale pour identifier les mécanismes sous-jacents de la migration cellulaire perturbé. Le protocole suivant décrit les techniques de base qui ont été adaptés pour l'étude des CEE.
Introduction
La migration cellulaire est important dans de nombreux processus physiologiques et physiopathologiques y compris le développement, diverses maladies, et la cicatrisation après une blessure de la peau.
Après une lésion de la peau, une inflammation des tissus durs supprime granulation et endommagées ou nécrotiques préliminaire fermeture de plaie et permet la formation d'un réseau de nouveaux capillaires à travers la vasculogenèse (formation novel) ou l'angiogenèse (bourgeonnement de vésicules existants) 3.1. Les deux vasculo- et nécessitent une angiogenèse migration des cellules endothéliales. Le réseau croissant de vaisseaux sanguins est essentielle pour le transport de l'oxygène et des nutriments à la prolifération des kératinocytes qui subissent finalement kératinisation, former un nouvel épithélium et de fournir fermeture de la plaie.
La migration des cellules endothéliales avec facultés affaiblies est une cause sous-jacente de cicatrisation 4,5 trouble. Ainsi, les méthodes pour évaluer la migration des cellules endothéliales premiers sont nécessaires pour explorer le pathophysiolgie des troubles de la migration cellulaire et d'identifier de nouvelles stratégies d'intervention thérapeutique.
L'exposition cutanée aux agents alkylants (par exemple, de soufre et d'azote moutardes) provoque la cicatrisation trouble 6. Ces composés ont été utilisés comme agents de guerre chimique dans plusieurs conflits dans le 20ème siècle et restent raison de vives préoccupations en raison de stocks existants dans des régions politiquement instables et la synthèse relativement simple. Bien que le gaz moutarde a été synthétisé pour la première en 1822, la pathologie moléculaire et clinique de l'exposition SM ne soit pas compris dans le détail et aucun antidote pour l'exposition SM a été identifié.
Plusieurs études ont été menées afin de comprendre et de modéliser la guérison des plaies après une exposition de SM et de tester des composés candidats potentiels capables de réserver cet effet. Schmidt et al. (2009) ont testé l'effet de chlorambucil, un composé alkylant avec des propriétés similaires à SM dans mousoi modèles de corps embryoïdes et trouvé une dramatique, réduction parfois plus de 99% dans la formation de vaisseaux 7. Cet effet indésirable est le plus prononcé à un stade de développement qui, dans des conditions physiologiques, est dominé par la prolifération et la migration des cellules précurseurs endothéliales vasculaires. Ainsi, ces cellules ont été identifiés comme étant particulièrement sensible aux agents d'alkylation. Steinritz et al. (2010) ont testé piégeurs de formes réactives de l'oxygène (ROS), en particulier, la N-acétylcystéine (NAC) et de l'acide alpha-linolénique (ALA) pour leur capacité à réduire la toxicité SM dans les modèles de l'organisme de la souris embryoïdes et en particulier, à restaurer la formation de vaisseaux 8. Effets protecteurs temporaires ont été observés, ce qui indique que la formation excessive ROS était susceptible de contribuer aux effets néfastes de SM sur la cicatrisation. Ces effets ne sont pas permanentes et les deux composés candidats peuvent ne pas être capable de restaurer la formation des vaisseaux et la cicatrisation dans le long terme 8. However, ces expériences ont été menées dans un modèle 3D complexe qui a fait de permettre une enquête de la migration cellulaire. Ainsi, nous avons ensuite testé CNA et de l'ALA pour les effets bénéfiques sur la migration des cellules de la CEE qui ont un rôle clé dans le processus de la formation de vaisseaux 9.
En outre, il est prouvé que la polarité cellulaire est nécessaire pour la migration des cellules. Dysfonction mitochondriale conduisant à la formation de ROS a été montré à porter atteinte à la polarité cellulaire et peut donc nuire à la migration cellulaire. Par conséquent, imagerie des cellules vivantes à l'égard de la fonction mitochondriale a été effectuée et les effets de charognards ROS ont été examinés. Le protocole suivant décrit les exigences générales pour la culture de la CEE, le dosage de la chambre de Boyden, la cicatrisation dosage y compris l'analyse de suivi de la cellule et l'utilisation de TMRM pour l'évaluation de la fonction mitochondriale en détail. Les aspects importants de protocoles expérimentaux pour la culture et la migration CEE sont mis en évidence.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Le protocole suivant décrit les techniques pour l'enquête de début de la migration des cellules endothéliales. La bonne culture des cellules endothéliales vasculaires nécessite pré-revêtement de flacons de culture cellulaire avec la gélatine pour assurer la prolifération et l'entretien d'un phénotype endothélial.
1. Pré-revêtement de flacons de culture cellulaire
- Dissoudre la gélatine dans du PBS 0,1 M à une concentration finale de 0,1%.
- Autoclave la solution avec des paramètres pour autoclavage liquide (pour plus de détails voir les instructions de l'autoclave spécifique).
- Ajouter un volume suffisant de la solution de gélatine à l'autoclave dans un ballon de culture cellulaire stérile (par exemple, au moins 5 ml pour un flacon de culture de cellules T25).
- Transférer les flacons dans un incubateur (37 ° C, 5% CO 2 ne soit pas requis, mais ne gêne pas) pendant au moins 30 min.
- Retirer la solution de gélatine restant. Utilisez les flacons pré-enduit ensuite (voir la culture de cellules) ou sdéchiré dans des conditions stériles jusqu'à utilisation.
2. Culture cellulaire des premières cellules endothéliales
Note: cellule souche embryonnaire dérivée des cellules endothéliales début (CEE) ont été obtenues à partir des corps embryoïdes murins différenciées par tri magnétique de cellules activées de la fraction de cellules positives PECAM-1 comme décrit précédemment 10,11.
- Culture CEE sur des boîtes de culture de cellules revêtues de gélatine dans du DMEM supplémenté avec 15% de FCS, 50 U / ml de pénicilline, 50 U / ml de streptomycine, 200 uM de L-glutamine, 100 pM de ß-mercaptoéthanol et 1% d'acides aminés non essentiels. Poignée cellules dans des conditions stériles. Cultiver les cellules avec 5% de CO2 à 37 ° C et 95% d'humidité jusqu'à ce que la sous-confluence (max. 80%).
- Au sous-confluence, les cellules à séparer un rapport de 1: 5. Remarque: Le détachement des cellules endothéliales est une étape critique.
- Récolter les cellules avec RT Accutase. Retirez les médias, rincer avec du PBS et ajouter 1 ml de Accutase par 25 cm
- Incuber le flacon à température ambiante pendant 2-10 min jusqu'à ce que les cellules ont détaché. Disperser les cellules et de les transférer à l'application souhaitée. Remarque: Une neutralisation chimique de l'Accutase est pas nécessaire, car il a lieu lorsque les cellules ensemencées sont stockés dans l'incubateur à 37 ° C. Cependant, Accutase activité peut également être diminuée par l'addition du milieu DMEM contenant du FCS.
- Récolter les cellules avec RT Accutase. Retirez les médias, rincer avec du PBS et ajouter 1 ml de Accutase par 25 cm
3. Boyden Chambre
Remarque: Les dosages de la chambre de Boyden sont effectuées en utilisant des systèmes d'insertion de polyéthylène téréphtalate opaque à la lumière 8 um de taille de pore.
- Pré-enduire les inserts de filtre (qui coupe à l'intérieur des puits de culture de cellules, créant ainsi une chambre de Boyden) en ajoutant 500 ul de 0,1% de gélatine dissous dans 0,1 M de PBS pendant au moins 30 min.
- Si les cellules doivent être exposées à des produits chimiques toxiques, selon exposer à la conception expérimentale spécifique avant la récolte des cellules. Note: Les cellules ont été exposées à 12,5 ug chlorambucil / ml de DMEMpendant 24 heures. En ce qui concerne la conception expérimentale spécifique, des instructions peuvent varier.
- Récolte CEE et déterminer le nombre de cellules en utilisant une chambre de comptage de cellules. Remarque: Les appareils de comptage automatiques peuvent être utilisés, mais doivent être utilisés avec prudence: le comptage manuel des cellules est plus précise et est fortement recommandé.
- Ajouter 500 pi de milieu de culture de cellules dans le compartiment de la chambre inférieure de la chambre de Boyden.
- Ajouter exactement 10 4 500 ul CEE dans un milieu de culture de cellules par insert de filtre dans le compartiment de la chambre supérieure. Éliminer les bulles.
- Incuber les inserts de filtre dans l'incubateur pendant exactement 8 h.
- Rincer une fois avec du PBS et remplacer le milieu par 0,5 ml de paraformaldehyde à 4% dans les deux compartiments pendant 25 minutes pour la fixation des cellules. Laver le filtre largement mais au moins trois fois avec du PBS 0,1 M.
- Exciser les membranes avec un scalpel.
- Monter la membrane entre deux lamelles de verre avec un milieu de montage contenant DAPI pour stainin nucléaireg. Faites attention à l'orientation. Assurez-vous que seules les cellules qui ont migré vers le côté du compartiment inférieur de la membrane sont comptées.
- Compter les cellules qui ont migré vers le côté du compartiment inférieur de la membrane avec un microscope à fluorescence à un grossissement de 400X. Ne confondez pas les pores de la membrane avec des cellules migrées (Figure 1A, 1B). Enquêter sur un nombre raisonnable de répétitions biologiques (au moins 3 répétitions biologiques par condition).
4. Wound Healing Assay
- Selon l'équipement disponible, choisissez avec soin les plats ou des plaques de culture cellulaire: Lorsque vous utilisez microscopie DIC, éviter des boîtes de culture à base de surface en plastique ou des plaques ainsi, mais utiliser des dispositifs à base de verre à la place.
Remarque: Si en utilisant la microscopie à contraste de phase, plats de plastique à base peuvent également être utilisés. - Cultiver CEE dans un dispositif de culture de cellules approprié (par exemple, 4 cm à fond de verre boîte de Pétri approprié pour l'imagerie des cellules vivantes) Jusqu'à 80% de confluence. Important: ne pas cultiver les cellules pour compléter confluence.
- Grattez les monocouches avec stériles 10 conseils ul de pipettes. Poussez la pointe doucement sans trop de pression sur la surface de la boîte et de le déplacer en ligne droite en douceur d'un côté à l'other.Wash les cellules deux fois avec 0,1 M de PBS pour éliminer les cellules individuelles.
- Ajouter un volume suffisant de milieu de la boîte de culture. Le cas échéant, ajouter des composés qui devraient être étudiés.
Note: 1,5 ml de milieu contenant 15 ng / ml alpha a été ajouté de l'acide linolénique. - Monter la boîte de culture sous un microscope capable d'imagerie des cellules vivantes. Veiller à 5% de CO 2, 37 ° C et une atmosphère humidifiée.
Remarque: L'humidification est particulièrement important pour éviter l'évaporation moyenne. - Acquérir les images de time-lapse de plus de 24 heures à intervalles de 10 minutes. Plan pour les grandes tailles de fichiers. Remarque: Une résolution de 512 x 512 pixels est généralement suffisant; Toutefois, nous vous recommandons d'utiliser des images d'au moins 1024 x 1,024.
- Mesurer la largeur de la fente à t = 0 h et à t = 24 h en utilisant l'outil de longueur du logiciel fourni avec le microscope ou utiliser des logiciels open-source (par exemple, ImageJ). Remarque: Dans le logiciel générale d'acquisition et d'analyse d'image spécifique est fourni par le fabricant. Par conséquent, pour les détails techniques concernant l'utilisation du logiciel, reportez-vous au manuel.
Suivi 5. cellulaire
- Selon l'équipement disponible, choisissez avec soin les plats ou des plaques de culture cellulaire: Lorsque vous utilisez microscopie DIC, éviter des boîtes de culture à base de surface en plastique ou des plaques ainsi, mais utiliser des dispositifs à base de verre à la place.
Remarque: Si en utilisant la microscopie à contraste de phase, plats de plastique à base peuvent également être utilisés. - Seed 5 x 10 4 CEE complétée DMEM dans un dispositif de culture de cellules approprié (par exemple, plaque de 24 puits multiples) et de cultiver les cellules avec 5% de CO 2 à 37 ° C et 95% d'humidité pendant 1-2 jours.
- Lorsque les cellules ont grandi à un 80% De confluence, retirez les médias et la culture des cellules avec les nouveaux médias dans la présence de substances d'essai respectifs (par exemple, 12,5 pg chlorambucil / ml DMEM). Toujours inclure les cellules de contrôle (traitées avec le solvant, par exemple l'éthanol) à 37 ° C pendant une certaine période de temps (24 heures, selon le système de test individuel).
- Monter la boîte de culture sous un microscope capable de l'imagerie des cellules vivantes (37 ° C, 5% de CO 2 et 95% d'humidité). Acquérir les images de time-lapse de plus de 24 heures à des intervalles prédéfinis. Acquérir des images à intervalles de 10 min.
- Effectuer le suivi manuellement des CEE par l'utilisation du plugin ImageJ MTrackJ. Choisissez 10 cellules au hasard dans le champ de vision et de suivre leurs mouvements en ajoutant un point de données par point dans le temps en utilisant le "Ajouter" commandement de MTrackJ.
Remarque: MTrackJ est disponible gratuitement à et ImageJ est disp [Meijering, Mtrackj "http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/".]le à [Rasband, imagej. "http://rsbweb.nih.gov/ij/"]. Un manuel détaillé sur le plugin MTrackJ est disponible au "http://www.imagescience.org".
6. imagerie de cellules vivantes / évaluation du potentiel de membrane mitochondriale
- Cultiver CEE dans un dispositif de culture de cellules approprié (par exemple, 4 cm bas boîte de Pétri en verre approprié pour l'imagerie de cellules vivantes) jusqu'à une confluence de 80%.
Important: Ne pas cultiver les cellules pour compléter confluence. - Le cas échéant, exposer les cellules à des produits chimiques. Note: Les cellules ont été exposées à 12,5 pg / ml pendant 24 heures chlorambucil. En ce qui concerne la conception expérimentale spécifique, des instructions peuvent varier.
- Préparer une solution à 10 mM du stock de tétraméthylrhodamine (TMRM) dans le DMSO. Protéger de la lumière. Remarque: La solution stock peut être conservé à -20 ° C.
- Diluer la solution mère dans un milieu de culture de cellules à une solution de travail avec une concentration de 10 uM (1: 1000 dilution). Protéger de la lumièreet d'utiliser dès que possible. Remarque: La solution de travail peut être conservé à température ambiante pendant un certain temps (> 1 h), cependant, la préparation d'une solution de travail frais est fortement recommandée.
- Ajouter 2 ul de la solution de travail à 1 ml de milieu (solution de charge) de culture cellulaire frais.
- Charger les cellules en remplaçant le milieu de culture de cellules avec la solution de charge. Incuber pendant 15 min à 37 ° C, 5% CO 2 et une atmosphère humidifiée (incubateur). Attention: Presque tous les indicateurs de fluorescence sont exportés par les cellules plus de temps à vivre; donc éviter de chargement prolongée ou retardée analyse.
- Sans lavage, placez le plat sous un microscope convenant pour l'imagerie de cellules vivantes. Important: indicateurs de fluorescence sont très sensibles à la lumière, par conséquent, éviter l'exposition inutile de lumière.
- Acquérir des images sans modifier les paramètres d'acquisition pour assurer la comparabilité entre les différentes images.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
L'exposition cutanée à des agents d'alkylation provoque l'érythème, la formation de cloques et une ulcération cutanée qui est associé à un trouble de la cicatrisation des plaies. La cicatrisation des plaies nécessite vasculogénèse angiogenèse et qui sont basées sur la migration des cellules endothéliales. Quantitative migration peut être évaluée en utilisant le dosage de la chambre de Boyden. Comme le montre la figure 1C de l'exposition de la CEE au chlorambucil agent alkylant entraîné une diminution significative de la migration des cellules 9. L'addition de l'acide linolénique ROS-piégeur alpha (ALA) directement après l'exposition au chlorambucil pendant 24 heures de façon significative sauvé ce phénotype, presque aux niveaux de contrôle.
Le dosage de la chambre de Boyden est un outil approprié pour évaluer le nombre (quantité) de cellules ayant migré. Cependant, le test ne fournit pas d'informations sur le comportement de migration des cellules. La figure 2 montre que non exposée CEE sont en mesure de combler l'écart dans la plaie et le cul de guérisonay dans les 24 heures 9. En revanche, CEE exposée au chlorambucil agent alkylant ont été incapables de combler l'écart dans la cicatrisation dosage 9. En outre, le suivi de la cellule de simple CEE a révélé que sous l'influence de chlorambucil mouvement dirigé n'a pas été observé 9. Traitement de la CEE avec Ros-charognards était en mesure de restaurer la migration cellulaire dirigée 9.
Formation mitochondriale ROS a été associée à une déficience de la migration cellulaire 12. Comme le montre la figure 3 exposition du CEE au chlorambucil entraîné la rupture de la membrane mitochondriale potentiel 9. Traitement de la CEE avec ROS-piégeur empêché dommages mitochondriaux et maintenu le potentiel de la membrane mitochondriale.
En résumé, toutes les méthodes décrites dans la section de protocole sont des outils adéquats pour évaluer la migration cellulaire. Conclusions sur la perte ou le maintien du potentiel de la membrane mitochondriale peut fournir vconseils ressources précieuses concernant les mécanismes moléculaires sous-jacents de la migration cellulaire altérée.
Figure 1. Boyden chambre dosage. (A) CEE ont été ensemencées sur Boyden cartouches filtrantes de chambre, incubé pendant 8 heures, fixées et colorées avec du DAPI. Astérisques indiquent migré CEE. Dans l'image présenté un total de 19 cellules peut être compté (figure 1B). Des pointes de flèches rouges indiquent les cellules qui ne sont pas migré à travers l'insert complètement ou qui ne sont pas complètement dans le champ de vision et donc ont été exclus de comptage cellulaire. (B) Les pores (8 pm) dans la membrane deviennent visibles lors de l'utilisation longs temps d'exposition pour l'acquisition d'image. Ne pas les confondre avec des cellules ayant migré. (C) sous le contrôleconditions une moyenne de 212 cellules ayant migré à travers la membrane. exposition au chlorambucil abouti à seulement 128 cellules ayant migré. Traitement de la CEE chlorambucil-exposée avec de l'acide linolénique ROS-piégeur alpha (ALA) la migration des cellules de manière significative sauvé. Symboles représentent les résultats individuels de un insert de filtre. Barres horizontales noires indiquent moyens (n = 4), barres d'erreur indiquent SD et les astérisques indiquent des différences significatives. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Cicatrisation analyse / suivi de la cellule. CEE était traité fictivement (échange de milieu) ou exposés à 12,5 pg / ml chlorambucil. Après avoir gratté, cellules were étudié pendant 24 h. (A) CEE ont été en mesure de combler l'écart dans le dosage de cicatrisation dans les 24 heures, alors que le chlorambucil exposée CEE ont été incapables de combler l'écart. Le traitement par ALA a abouti à une amélioration significative de la migration cellulaire. (B) Les valeurs moyennes de 3 expériences indépendantes, chacune avec 5 répétitions techniques par groupe (n = 15 par groupe) sont présentés. Les barres d'erreur représentent les écarts et les astérisques indiquent standards différences statistiquement significatives (One-way ANOVA, p <0,05). Modifié à partir de Steinritz et al. (2014) 9. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Évaluation de la membrane mitochondriale potentiel. CEE était traité fictivement, exposée au chlorambucil (12,5 pg / ml) ou chlorambUCIL exposé et ALA (15 ng / ml) traité. 24 h après l'exposition, les cellules ont été chargées avec TMRM pendant 15 minutes et immédiatement imager. (A) non exposée CEE a révélé un signal distinct après marquage TMRM indiquant un potentiel intact de la membrane mitochondriale. Exposition (B) de Chlorambucil a entraîné une diminution significative du signal TMRM. (C) Traitement des chlorambucil exposés CEE avec l'acide alpha linolénique ROS-trésor restauré le potentiel de la membrane mitochondriale. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
L'exposition cutanée à des produits chimiques toxiques se traduit souvent par des troubles de cicatrisation sévère. Les mécanismes sous-jacents sont largement inconnues. La cicatrisation des plaies est un processus complexe qui se compose de différentes phases (hémostase, inflammation, prolifération et remodelage). La migration cellulaire est impliquée dans toutes les étapes, cependant, il est de la plus haute importance pour la formation du tissu de granulation. Ici, de nouveaux vaisseaux sanguins sont formés soit par la vasculogenèse ou angiogenèse.
Les deux procédés nécessitent pas affecté la migration des précurseurs et les cellules endothéliales début. Évaluation de la migration cellulaire et de clarifier les mécanismes sous-jacents de la migration cellulaire perturbée est très pertinente dans le but de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques contre les troubles de la cicatrisation de la plaie toxique induit.
La migration cellulaire peut être évaluée par des approches différentes. Une technique couramment utilisée est la chambre de Boyden dosage qui a été initialement introduit pour analyser anticorps Antigen provoqué la chimiotaxie des leucocytes sur 13. Cet essai est un essai de point final quantitative qui reflète la capacité d'invasion des cellules du compartiment supérieur d'un insert Transwell au compartiment inférieur en réponse à un chimioattractant. Dans la technique décrite ici, aucun chimiotactique a été ajouté à la chambre inférieure. Ainsi chimiokinèse (migration aléatoire sans chimioattractive spécifique) du CEE, sous condition de contrôle ou en réponse à chlorambucil a été étudiée.
L'insert est constitué d'une membrane poreuse qui permet à trois dimensions migration cellulaire à travers les pores de la membrane. La taille des pores de la membrane doit être choisi en fonction de la taille des cellules: des pores qui sont trop petits empêche la migration des cellules complètement, les pores qui sont trop grands permettant le passage sans entrave de toutes les cellules. Pour les cellules endotheliales début, une taille de pores de 8 um est recommandée. L'utilisation d'une taille de pores inapproprié donnera lieu à des résultats non reproductibles. Dans order d'adapter le protocole aux cellules avec des propriétés différentes comme CEE, nous recommandons de commencer avec une taille de pores plus grande que les noyaux et d'augmenter la taille des pores, étape par étape, si nécessaire. Par exemple, pour de petites cellules telles que les leucocytes une taille de pores de 3 um est recommandée.
Un problème critique est la détermination du temps d'incubation jusqu'à l'analyse. Au fil du temps, la prolifération cellulaire (au moins dans les groupes témoins) aura lieu. Cela aura pour amplifier le nombre de cellules qui peuvent pénétrer à travers la membrane, réduisant potentiellement la sensibilité de la méthode: même avec des capacités migratoires légèrement déficients, les cellules peuvent être en mesure de migrer sur de longues périodes de temps. Par conséquent, de longues périodes (par exemple 24 h) ne sont pas recommandés pour les cellules endothéliales. D'autre part, si l'incubation est trop court après l'ensemencement des cellules, seules des quantités mineures de cellules se sont écoulées de la membrane. Une incubation de 8 heures a été trouvé optimale. Après le temps d'incubation défini de 8 heures, les cellules d'unre fixées, colorées et comptées manuellement.
Il ya trois approches possibles pour l'analyse: (1) des cellules sur le dessus de la membrane (qui ne sont pas migré) sont enlevés par un écouvillon. Ensuite, les cellules sur le côté inférieur de la membrane (cellules ayant migré) sont colorées soit avec un cytologiques (par exemple, l'hématoxyline) ou d'un colorant fluorescent (par exemple, DAPI) et sont comptées. (2) En variante, les cellules sur la face inférieure peuvent être colorés avec un colorant fluorescent premier et se détachent par la suite (par exemple, par l'utilisation de trypsine). La fluorescence est ensuite quantifié par l'utilisation d'un lecteur de fluorescence. (3) Nous recommandons l'utilisation de membranes poreuses de couleur sombre qui bloquent la transmission de la lumière ce qui permet la différenciation des cellules non-migrés (cellules au-dessus de la membrane) et les cellules ont migré (sur le fond de la membrane). Après coloration par fluorescence (colorants cytologiques ne peuvent pas être utilisés) cellules sur le côté inférieur sont comptées en utilisant un microscope à fluorescence. Il est important de ne pas confound l'orientation de la membrane. Utilisant une membrane opaque évite la nécessité d'éliminer les cellules non-migrés. L'utilisation de membranes opaques, coloration fluorescente et le comptage manuel des cellules est révélée supérieure aux autres méthodes.
En général, le dosage de la chambre de Boyden est un dosage qui est facile à manipuler et il est donc un test fréquemment utilisé pour l'évaluation de la migration cellulaire. Cependant, il existe deux inconvénients majeurs: (1) Le dosage de la chambre de Boyden est un essai de point final. Cela signifie que, si le point de l'analyse en temps est incorrecte, le résultat peut être trompeur. (2) L'essai est difficile à automatiser. Cependant, cet essai est l'un des outils les plus précieux pour l'évaluation de la migration cellulaire.
A la différence de l'essai statique de chambre de Boyden, la cicatrisation des plaies essai (également dénommé test de réduction de l'écart ou de dosage à la rayure) est un essai dynamique en temps réel. Il est un essai en deux dimensions de migration sans trois dimensions les mouvements d'invasion cellulaire. Après "blessant" des couches de cellules avec une pointe de pipette, les cellules migrent dans le fossé. Le test est simple à réaliser et permet d'éviter les problèmes d'un point de terminaison de test statique. Cependant, l'essai a quelques défis: (1) un système microscopique d'imagerie des cellules vivantes (37 ° C, 5% de CO 2 avec l'atmosphère humidifiée) est requis. Assurez-vous que les boîtes de culture de cellules ne se dessèchent pas. (2) l'acquisition d'images Time-lapse se traduira dans les grands fichiers de données en fonction des paramètres (résolution, intervalle) utilisés. (3) Gratter la couche de cellule avec une pointe de pipette est pas aussi facile que cela puisse paraître initialement. Trop de pression peut endommager la surface de plat qui peut entraîner des artefacts. En outre, la largeur de la fente peut différer dans le scratch et peut différer entre les différents enquêteurs. Un enquêteur expérimenté est recommandé. (4) Le nombre d'échantillons qui peuvent être exécutées en parallèle est limitée par l'équipement. Néanmoins, la cicatrisation dosage est un autre outil précieux pour le quantitatif et quallitatifs évaluation de la migration cellulaire. Informations sur la vitesse de migration, la distance de migration, migration dirigée peut être rassemblés dans un dispositif expérimental. suivi de cellule dans un système à deux dimensions est pas très difficile et peut être réalisée avec le logiciel open source (par exemple, ImageJ et MTrackJ).
Revêtement des boîtes de culture de cellules est important non seulement pour la fixation des cellules, mais a une influence importante sur la fonction cellulaire en ce qui concerne la migration. Les cellules endothéliales sont cultivées en routine sur 0,1% des surfaces revêtues de gélatine. Utilisation d'à surface non revêtue pour la culture de cellules endotheliales conduit à une diminution de 14 prolifération. D'autres revêtements (par exemple, la fibronectine) ont été trouvés également adapté pour la culture à court terme, cependant, les revêtements de gélatine ont montré des performances supérieures dans des expériences de culture à long terme 15.
Il ya de nombreux colorants de fluorescence sur le marché pour l'imagerie de cellules vivantes. Nous avons chosen TMRM pour enquêter sur le potentiel de la membrane mitochondriale. Beaucoup d'autres colorants (par exemple, JC-1, TMRE) présentent des performances comparables. Contrairement aux sondes monochromatiques (TMRM, TMRE), JC-1 fluorescence quarts du vert au rouge après l'accumulation dans les mitochondries. Cela permet une analyse semi-quantitative ratiométrique de l'état de polarisation mitochondrial mais entrave expériences de coloration double (par exemple, en utilisant des colorants tracker pour identifier les mitochondries) 16. Dans notre expérience, le colorant lui-même est moins critique pour l'expérience tandis que la conception expérimentale, la manipulation de la cellule et de l'acquisition est difficile et nécessite beaucoup plus d'attention. Presque tous les colorants fluorescents sont sensibles à la lumière. Par conséquent, la cellule de chargement doit être fait dans l'obscurité. Chargement des cellules nécessite 15-30 min. Temps de chargement prolongée ne se traduise pas par une augmentation des signaux et est déconseillée. Bien que les signaux spécifiques pourraient être détectés après des périodes de chargement longs, le colorant peut accumuler dans compartiment subcellulairements ou pourraient même être évacués de la cellule. En conséquence, les cellules doivent être chargés juste avant l'analyse et pas nécessairement au début de l'expérience. La concentration de colorant de chargement est habituellement dans la plage de 10 uM. Cependant, avec TMRM concentrations beaucoup plus faibles (20 nM) ont été jugées suffisantes pour l'étiquetage et toujours donné des résultats raisonnables. Comme le montre la Figure 3 étiquetage 24 h après l'exposition de chlorambucil a entraîné une perte distinct du potentiel de membrane mitochondrial. Traitement de chlorambucil exposé CEE avec Ros-charognards a été en mesure de maintenir le potentiel de la membrane mitochondriale à 24 h après l'exposition initiale.
En résumé, Boyden dosage de chambre, de cicatrisation dosage en combinaison avec seule analyse de la piste de la cellule sont des outils précieux pour évaluer le comportement de migration en ce qui concerne qualitatifs et les aspects quantitatifs. Étiquetage du potentiel mitochondrial avec TMRM peut aider à identifier les mécanismes sous-jacents.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Boyden Chamber | |||
| Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 3 µm | Corning Incorporated | #351151 | |
| Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 8 µm | Life Sciences | #351152 | |
| (for use with Falcon Insert 24 well Companion Plate (353504) | |||
| Wound healing assay | |||
| Glass bottom dishes | Word Precision Instruments, Inc. | #FD35-100 | |
| Assessment of mitochondrial potential | |||
| TMRM (tetramethylrhodamine methyl ester) | Life Technologies | #T669 | |
| Cell culture | |||
| Accutase | PAA, Pasching, Austria | # L11-007 | |
| α-Linolenic acid | Fluka (Sigma), Steinheim, Germany | # L2376 | |
| Chlorambucil | Fluka (Sigma), Steinheim, Germany | # 23125 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany | # G2500-100G |
References
- Bauer, S. M., Bauer, R. J., Velazquez, O. C. Angiogenesis, vasculogenesis, and induction of healing in chronic wounds. Vascular and Endovascular Surgery. 39, 293-306 (2005).
- Reinke, J. M., Sorg, H.
- Hart, J. Inflammation. 1: Its role in the healing of acute wounds. Journal of Wound Care. 11, 205-209 (2002).
- Liu, Z. J., Hyperoxia Velazquez, O. C. endothelial progenitor cell mobilization, and diabetic wound healing. Antioxidants & Redox Signaling. 10, 1869-1882 (2008).
- Gallagher, K. A., Goldstein, L. J., Thom, S. R., Velazquez, O. C. Hyperbaric oxygen and bone marrow-derived endothelial progenitor cells in diabetic wound healing. Vascular. 14, 328-337 (2006).
- Kehe, K., Balszuweit, F., Steinritz, D., Thiermann, H. Molecular toxicology of sulfur mustard-induced cutaneous inflammation and blistering. Toxicology. 263, 12-19 (2009).
- Schmidt, A., et al. Nitrogen mustard (Chlorambucil) has a negative influence on early vascular development. Toxicology. 263, 32-40 (2009).
- Steinritz, D., et al. Effect of N-acetyl cysteine and alpha-linolenic acid on sulfur mustard caused impairment of in vitro endothelial tube formation. Toxicological Sciences. 118, 521-529 (2010).
- Steinritz, D., et al. Chlorambucil (nitrogen mustard) induced impairment of early vascular endothelial cell migration - Effects of alpha-linolenic acid and N-acetylcysteine. Chemico-biological Interactions. 219C, 143-150 (2014).
- Schmidt, A., et al. Influence of endostatin on embryonic vasculo- and angiogenesis. Developmental Dynamics : an Official Publication of the American Association of Anatomists. 230, 468-480 (2004).
- Dainiak, M. B., Kumar, A., Galaev, I. Y., Mattiasson, B.
- Wang, Y., et al. Regulation of VEGF-induced endothelial cell migration by mitochondrial reactive oxygen species. American Journal of Physiology. Cell physiology. 301, C695-C704 (2011).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
- Relou, I. A., Damen, C. A., van der Schaft, D. W., Groenewegen, G., Griffioen, A. W. Effect of culture conditions on endothelial cell growth and responsiveness. Tissue & Cell. 30, 525-530 (1998).
- Smeets, E. F., von Asmuth, E. J., vander Linden, C. J., Leeuwenberg, J. F., Buurman, W. A. A comparison of substrates for human umbilical vein endothelial cell culture. Biotechnic & Histochemistry : Official Publication of the Biological Stain Commission. 67, 241-250 (1992).
- Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. BioTechniques. 50, 98-115 (2011).
