Abstract
(황 및 질소 겨자 등의 알킬화 화학 전쟁 에이전트 포함) 화학 물질에 노출되면 상처 치유 장애를 포함하여 임상 증상의 과다 발생합니다. 상처 치유의 생리 학적 과정은 매우 복잡하다. 어느 혈관 생성을 통한 (신규 형성) 또는 혈관 생성 (기존 용기의 돋) - 육아 조직의 형성은 예비 상처 봉합의 결과 및 새로운 모세 혈관의 네트워크가 제공하는이 과정에서 중요한 단계이다. 모두 vasculo- 및 혈관 내피 세포의 기능, 지시 마이그레이션을 필요로한다. 따라서, 초기 내피 세포 (EEC) 이전의 조사는 잠재적으로 치료 개입을위한 새로운 전략을 확인 장애를 치유 화학 물질에 의한 상처의 병태 생리를 이해하고하는 것이 중요하다.
우리는 에이전트 노출을 알킬화 후 손상된 상처 치유를 평가하고, TR에 대한 잠재적 인 후보 화합물을 테스트eatment. 우리는이 프로토콜에 설명 된 기법들을 사용 하였다. 수정 된 보이든 챔버는 정량적 EEC의 chemokinesis 설명한다보고자 하였다. 더욱이, 정 성적으로 마이그레이션을 평가하기 위해 트랙 분석과 조합하여 분석 상처 치유의 사용이 예시된다. 마지막으로, 우리는 교란 된 세포 이동의 기본 메커니즘을 식별하는 미토콘드리아 막전위의 조사 TMRM 형광 염료의 사용을 입증한다. 다음 프로토콜은 EEC의 조사를 위해 적응 된 기본 기술에 대해 설명합니다.
Introduction
세포 이동은 피부 손상 후 개발, 각종 질병 및 상처 치유 등 많은 생리 및 병리 생리 학적 과정에 중요하다.
피부 손상에 따라, 염증은 손상 또는 괴사 조직과 육아 드라이브를 예비 상처 봉합을 제거하고 혈관 생성을 통해 새로운 모세 혈관의 네트워크 형성 (소설 형성) 또는 혈관 신생 (기존 소포의 발아) 1-3 수 있습니다. 모두 vasculo- 및 혈관 내피 세포의 이동을 필요로한다. 혈관의 네트워크가 증가하는 궁극적 각질화를 받아야 각질 세포 증식에 산소와 영양분을 운반하는 것이 필수적이며, 새로운 상피를 형성하고 상처 봉합을 제공한다.
내피 세포의 손상 마이그레이션 장애 4,5 상처 치유의 근본 원인이다. 초기 내피 세포의 따라서, 방법을 평가하기 위해 마이그레이션 pathophysiol을 탐구하는 데 필요한세포 이동이 ogy 질환 및 치료 개입을위한 새로운 전략을 확인한다.
알킬화제 (예를 들면, 황 및 질소 머스타드)에 피부 노출 장애 (6) 상처 치유됩니다. 이러한 화합물로 인해 정치적으로 불안정한 지역과 비교적 간단한 합성의 기존 비축에 강한 우려에 대한 이유를 20 세기에 여러 갈등 화학 전쟁 에이전트로 사용 남아 있었다. 황 머스타드 먼저 1822 년 합성되었지만, SM 노출의 분자량과 임상 병리학 상세히 이해되지 않고 SM 노광용 해독제가 확인되지 않았다.
몇몇 연구는 이해하고 SM 노광 후에 손상된 상처 치유를 모델링하고 그 효과를 확보 할 수있는 잠재적 후보 화합물을 시험하기 위해 수행되었다. 슈미트 외. (2009) 클로 람 부실의 영향, 양해 각서 (MOU)에 SM과 유사한 특성을 가진 알킬화 화합물을 테스트SE 배아 체 모델 및 혈관 형성 7 극적인, 때때로 99 % 이상의 감소를 알았다. 이 부작용은 대부분, 생리 학적 조건 하에서, 증식 및 혈관 내피 전구 세포의 이동에 의해 지배된다 개발 단계에서 두드러졌다. 따라서, 이들 세포는 알킬화제에 특히 민감한 것으로 확인되었다. Steinritz 외. (2010)에, 마우스 배아 체 모델에서 특히 SM 독성을 감소시키는 그들의 능력에 대하여 특히, N- 아세틸 시스테인 (NAC)과 알파 리놀렌산 (ALA)에서 반응성 산소 종 (ROS)의 청소부 테스트 혈관 형성 (8)를 복원합니다. 임시 보호 효과는 과도한 활성 산소의 형성은 상처 치유에 SM의 부작용에 기여할 가능성이되었음을 나타내는, 관찰되었다. 이러한 효과는 영구 없었고 두 후보 화합물은 장기 8에서 혈관 형성 및 상처 치유를 복원 할 수 없을 수도있다. HoweveR, 그 실험은 세포 이동의 조사를 허용했다 복잡한 3D 모델에서 실시 하였다. 따라서, 우리는 이후 용기 (9)의 형성 과정에서 중요한 역할을 EEC의 세포 이동에 대한 유익한 효과에 대한 ALA NAC 및 시험.
또한, 셀 극성 세포 이동을 위해 필요하다는 증거가있다. ROS의 형성으로 이어지는 미토콘드리아 기능 장애 세포 극성을 저해하는 것으로하고, 따라서 악영향 세포 이동에 영향을 미칠 수있다. 따라서, 미토콘드리아 기능에 관한 라이브 세포 이미징을 수행하고, ROS 제거제의 효과를 조사 하였다. 다음 프로토콜은 EEC, 보이든 챔버 분석, 세포 추적 분석 및 세부에서 미토콘드리아 기능의 평가 TMRM의 사용을 포함하여 분석 상처 치유의 재배에 대한 일반 요구 사항에 대해 설명합니다. EEC 재배 및 마이그레이션을위한 실험 프로토콜의 중요한 측면이 강조된다.
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Protocol
다음 프로토콜은 초기 내피 세포 이동의 조사 방법을 설명합니다. 혈관 내피 세포의 적절한 재배 내피 표현형의 적절한 증식과 유지 보수를 보장하기 위해 젤라틴과 세포 배양 플라스크의 사전 코팅이 필요합니다.
세포 배양 플라스크 1. 사전 코팅
- 0.1 %의 최종 농도 0.1 M PBS에 젤라틴을 녹인다.
- (자세한 내용은 특정 오토 클레이브의 지침을 참조하십시오) 액체 고압 증기 멸균에 대한 매개 변수를 사용하여 솔루션을 압력솥.
- 무균 세포 배양 플라스크 (T25 세포 배양 용 플라스크 예, 적어도 5 ㎖)을 오토 클레이브 젤라틴 용액의 충분한 양을 추가한다.
- 인큐베이터로 플라스크로 이동 (37 ℃, 5 % CO 2는 필요하지 않지만 방해하지 않는) 적어도 30 분 동안.
- 나머지 젤라틴 용액을 제거합니다. 이후 사전 코팅 된 플라스크를 사용하십시오 (세포 배양) 또는 S사용할 때까지 무균 상태에서 찢었다.
초기 내피 세포의 2. 세포 배양
주 : 앞서 설명 된 바와 같이 10, 11, 배아 줄기 세포 유래의 초기 내피 세포 (EEC)를 PECAM-1 양성 세포 분획의 자기 활성화 세포 정렬하여 차별화 뮤린 배양체로부터 수득 하였다.
- DMEM에서 젤라틴 코팅 된 세포 배양 접시에 배양 EEC 15 % FCS, 50 U / ㎖ 페니실린, 50 U로 보충 / ㎖ 스트렙토 마이신, 200 μM L- 글루타민, 100 μM의 ß 머 캅토 에탄올, 1 % 비 필수 아미노산. 멸균 조건에서 세포를 처리합니다. 37 ° C에서 5 % CO 2 세포를 배양하고, 95 % 습도의 합류 부 (최대. 80 %)까지.
- 5 비율 : 하위 합류, 1에서 세포를 분리. 참고 : 내피 세포의 박리가 중요한 단계입니다.
- RT의 accutase와 세포를 수확. 용지를 제거 PBS로 씻어 25cm 당 accutase 1 ㎖를 추가
- 세포가 분리 될 때까지 2 내지 10 분 동안 실온에서 플라스크를 인큐베이션. 세포를 분산하고 원하는 응용 프로그램으로 전송합니다. 참고 : accutase의 화학적 중화가 시드 세포는 37 ° C에서 인큐베이터에 저장됩니다 때 발생으로 필요하지 않습니다. 그러나 accutase 활동도 FCS 함유 DMEM을 첨가함으로써 감소 될 수있다.
- RT의 accutase와 세포를 수확. 용지를 제거 PBS로 씻어 25cm 당 accutase 1 ㎖를 추가
3. 보이든 상공 회의소
주 : 보이든 챔버 분석은 8 ㎛의 공경을 갖는 광 불 투과 폴리에틸렌 테레 프탈레이트 삽입 시스템을 사용하여 수행된다.
- 프리 코트를 적어도 30 분 동안 0.1 M PBS에 용해시킨 0.1 % 젤라틴의 500 μl를 첨가하여 필터 인서트 (따라서 보이 덴 챔버를 생성하는 세포 배양 웰 내부 그 착용감).
- 세포 독성 화학 물질에 노출 될 경우, 세포를 수확하기 전에 특정 실험 디자인에 따라 노출. 주 : 세포 / ㎖ DMEM 12.5 μg의 클로 노출시켰다24 시간 동안. 특정 실험 설계에 관해서는, 지침이 다를 수 있습니다.
- 수확 EEC는 카운팅 셀 챔버를 이용하여 세포 수를 확인하고. 참고 : 자동 계산 장치를 사용할 수 있지만,주의하여 사용되어야한다 : 수동 세포 계수가 더 정확하며 강력히 추천된다.
- 보이든 챔버의 하부 챔버 구획에 500 μL 세포 배양 배지를 추가합니다.
- 상부 챔버 구획에 필터를 삽입 당 500 μL 세포 배양 배지에서 정확히 10 4 EEC를 추가합니다. 거품을 제거합니다.
- 정확히 8 시간 동안 인큐베이터에서 필터 삽입을 품어.
- PBS로 한번 씻어 세포 고정 용 25 분 동안 두 구획에 0.5 ml의 4 % 파라 포름 알데히드와 매체를 교체합니다. 광범위하게 필터를 세척하지만 0.1 M PBS로 3 회 이상.
- 메스와 점막을 절제.
- 핵 stainin에 대한 DAPI를 포함하는 설치 매체와 함께 두 개의 유리 커버 전표 사이의 막 마운트G. 방향에주의를 기울이십시오. 멤브레인의 낮은 구획쪽으로 마이그레이션 만 세포가 계산되어 있는지 확인합니다.
- 400X 배율 형광 현미경으로 막의 하부 구획실쪽으로 이주 셀 개수. 마이그레이션 세포 (그림 1A, 1B)와 막 모공을 혼동하지 마십시오. 생물 복제의 적절한 수 (조건 당 적어도 3 생물 복제)을 조사합니다.
4. 상처 치유 분석
- DIC 현미경을 사용하면, 플라스틱 표면을 기초 디쉬 또는 웰 플레이트를 피하는 대신 유리 기반의 장치를 사용 가능한 장비에 따라 신중 세포 배양 접시 나 판을 선택한다.
주 : 위상차 현미경을 사용하는 경우, 비닐 계 요리를 사용할 수도있다. - 라이브 세포 이미징에 적합한 세포 배양 장치에 EEC 육성 (예를 들어, 4cm의 유리 바닥 배양 접시에 적합) 80 %의 합류까지. 중요 : 합류를 완료하기 위해 세포를 배양하지 않습니다.
- 멸균 10 μL 피펫 팁 단일 층을 긁어. 접시 표면에 너무 많은 압력없이 부드럽게 끝을 누르고 분리 된 세포를 제거하기 위해 0.1 M PBS로 세포를 두 번 other.Wash 한 측에서 원활하게 직선으로 이동합니다.
- 배양 접시에 매체의 충분한 볼륨을 추가합니다. 해당되는 경우, 조사해야 화합물을 추가합니다.
주 : 1.5 mL를 함유하는 배지 15 NG / ㎖ 알파 리놀렌산을 첨가 하였다. - 라이브 세포 이미징 할 수있는 현미경으로 배양 접시를 탑재합니다. 이산화탄소 5 %, 37 ° C와 가습 분위기를 확인합니다.
주 : 가습 매체 증발을 방지하는 것이 특히 중요하다. - 10 분 간격으로 24 시간 동안 시간 경과 이미지를 획득. 큰 파일 크기에 대한 계획. 주 : 512 X 512 픽셀의 해상도가 충분합니다; 그러나, 우리는 적어도 1,024 X 1,0의 이미지를 사용하는 것이 좋습니다(24).
- 오픈 소스 소프트웨어 (예를 ImageJ에) 현미경 구비 길이 소프트웨어 도구를 사용 = 24 시간 t = 0에서 시간 t와의 갭 폭을 측정하거나 사용한다. 참고 : 일반적으로 특정 이미지 수집 및 분석 소프트웨어의 제조업체에서 제공합니다. 따라서, 소프트웨어의 사용에 대한 기술적 인 세부 사항은 설명서를 참조하십시오.
5. 셀 추적
- DIC 현미경을 사용하면, 플라스틱 표면을 기초 디쉬 또는 웰 플레이트를 피하는 대신 유리 기반의 장치를 사용 가능한 장비에 따라 신중 세포 배양 접시 나 판을 선택한다.
주 : 위상차 현미경을 사용하는 경우, 비닐 계 요리를 사용할 수도있다. - 적합한 세포 배양 장치에 보충 DMEM에 5 × 104 EEC 시드 (예, 24 멀티 웰 플레이트), 37 ° C, 1-2 일 동안 95 %의 습도에서 5 % CO 2 세포를 배양.
- 세포는 80까지 성장하는 경우%의 합류는, 각각의 시험 물질의 존재의 미디어와 문화를 새로운 매체를 사용하여 세포를 제거 (예를 들어, 12.5 μg의 클로 람 부실 / ㎖ DMEM). 항상 (개별 분석 시스템에 따라 24 시간)에서 일정 시간 동안 37 ° C에서 (용매, 예를 들면, 에탄올로 처리) 대조군 세포를 포함한다.
- 라이브 세포 이미징 (37 ° C, 5 % CO 2, 95 % 습도) 가능한 현미경 배양 접시를 탑재. 미리 정의 된 간격으로 24 시간 동안 시간 경과 이미지를 획득. 10 분 간격으로 화상을 취득.
- ImageJ에 플러그인 MTrackJ를 사용하여 수동으로 EEC의 추적을 수행합니다. 시야에서 무작위로 10 셀을 선택하고이 MTrackJ의 명령을 "추가"를 사용하여 시간에 포인트 당 데이터 포인트를 추가하여 그들의 움직임을 추적 할 수 있습니다.
[. Meijering, Mtrackj "http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/"] MTrackJ가에서 무료로 사용할 수 있습니다 및 ImageJ에는 availab입니다 참고 :[Rasband, ImageJ에. "http://rsbweb.nih.gov/ij/"]에서 제작 :. MTrackJ 플러그인에 대한 상세한 매뉴얼은 "http://www.imagescience.org"에서 확인할 수있다.
6. 라이브 세포 이미징 / 미토콘드리아 막의 평가 가능성
- 적절한 세포 배양 장치에 EEC 육성 (예를 들어, 라이브 세포 이미징에 적합한 4cm의 유리 바닥 페트리 접시) 80 %의 합류까지.
중요 : 합류를 완료하기 위해 세포를 배양하지 마십시오. - 해당되는 경우, 화학 물질로 세포를 노출. 참고 : 세포는 24 시간 동안 12.5 μg의 / ㎖의 클로 람 부실에 노출되었다. 특정 실험 설계에 관해서는, 지침이 다를 수 있습니다.
- 테트라 메틸에 DMSO (TMRM)의 10 mM 스톡 용액을 준비한다. 빛으로부터 보호합니다. 주 : 원액 -20 ℃에서 저장 될 수있다.
- (: 1000 희석 1) 10 μM의 농도로 작동 용액 세포 배양 배지에 원액을 희석. 빛으로부터 보호가능한 한 빨리 사용한다. 주 : 작업 용액은 몇 시간 (> 1 시간) 동안 실온에서 유지 될 수 있지만, 새로운 작동 용액의 조제 추천된다.
- 1ml의 신선한 세포 배양 배지 (로딩 용액)로 작동 용액 2 μl를 추가.
- 로딩 용액으로 세포 배양 배지로 대체하여 세포를로드. 37 ° C, 5 % CO 2 및 가습 분위기 (배양기)에서 15 분 동안 인큐베이션. 주의 : 거의 모든 형광 지표는 시간이 지남에 살아있는 세포 내 보낸; 따라서 오랜 로딩 또는 지연 분석을 피하십시오.
- 세척하지 않고, 살아있는 세포 이미징에 적합한 현미경으로 접시를 놓습니다. 중요 : 형광 지표 따라서, 불필요한 빛 노출을 방지, 빛에 매우 민감하다.
- 다른 이미지 사이의 비교를 위해 획득 파라미터를 변경하지 않고 이미지를 획득.
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Representative Results
알킬화제에 대한 피부 노출은 홍반, 수포 형성 및 상처 치유 장애와 관련된 피부 궤양을 유발. 상처 치유는 내피 세포의 이동을 기반으로 angio- 및 혈관 생성을 필요로한다. 정량적 마이그레이션 된 Boyden 챔버 에세이를 사용하여 평가 될 수있다. 알킬화제 클로 람에 EEC의도 1c에 도시 한 바와 같이 노광시에 세포 이동 (9)에 상당한 감소 결과. 직접 24 시간 동안 클로 람 부실에 노출 된 후 활성 산소 폐품 알파 리놀렌산 (ALA)의 추가는 상당히 거의 제어 수준으로,이 표현형을 구출.
보이든 챔버 분석 마이그레이션 셀의 수 (양)를 평가하기에 적합한 도구이다. 그러나, 분석은 세포의 이동 동작에 대한 정보를 제공하지 않습니다.이 그림은 노출되지 않은 EEC 상처와 치유 엉덩이에 격차를 할 수 있는지 보여줍니다24 시간 9 내 님. 대조적으로, 알킬화제의 클로 람 부실에 노출 EEC는 분석 (9) 상처 치유의 격차를 할 수 없습니다. 또한, 하나의 EEC의 세포 추적 클로 람 부실 감독 운동의 영향을 받아 9 관찰되지 않았다 것으로 나타났습니다. ROS-제거제와 EEC의 치료는 직접 세포 이동 (9)을 복원 할 수 있었다.
미토콘드리아 활성 산소의 형성은 세포 이동 (12)의 손상과 관련이있다. 클로 람 부실에 EEC의 그림 3 노출에 나타낸 바와 같이 9 잠재적 인 미토콘드리아 막의 분석 결과. 활성 산소 폐품과 EEC의 치료는 미토콘드리아의 손상을 방지하고, 미토콘드리아 막 잠재력을 유지했다.
요약하면, 프로토콜 절에 설명 된 모든 방법은 세포 이동을 평가하기에 적합한 도구이다. V를 제공 할 수있다 미토콘드리아 막 전위의 손실 또는 보존에 대한 연구 결과손상된 세포 이동의 기본 분자 메커니즘에 관한 aluable 힌트.
도 1 보이든 챔버 분석. (A) EEC는, 8 시간 동안 배양 된 Boyden 챔버 필터 인서트에 고정 시드 및 DAPI 염색 하였다. 별표는 EEC를 마이그레이션 나타냅니다. 표시 화상의 19 개의 셀들의 총 (도 1b) 계산 될 수있다. 빨간색 화살표 머리가 완전히 삽입을 통해 마이그레이션되지 또는 그 시야에서 완전히하지 않으며, 따라서 세포 계산에서 제외 된 한 세포를 나타냅니다. (B) 이미지 획득을위한 긴 노출 시간을 사용할 때 볼 수있게 막의 공극 (8 μm의). 마이그레이션 세포를 혼동하지 마십시오. 제어하에 (C)조건 막을 통해 이주 된 세포 (212)의 평균. 클로 람 부실 노출은 128 마이그레이션 세포의 결과. ROS 폐품 알파 리놀렌산 (ALA) 크게 구출 세포의 이동과 클로 람 부실에 노출 된 EEC의 치료. 기호는 하나의 필터 삽입에서 개별 결과를 나타냅니다. 검은 가로 바 (N = 4), 오차 막대는 SD 및 별표가 유의 한 차이를 나타내는 표시 수단을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 상처 치유 분석 / 셀 추적. EEC는 (매체 교환) 처리 - 가짜 또는 12.5 μg의 / ㎖ 클로 람 부실에 노출했다. 세포 W를 긁적 후감수는 24 시간 동안 조사 하였다. () EEC는 EEC 노출 클로 람 부실 반면 24 시간 이내에 상처 치유 분석에서 격차를 할 수 격차를 할 수 없었다이었다. ALA와 치료는 세포 이동의 상당한 개선 결과. 그룹 당 5 기술 복제와 3 독립적 인 실험에서 각각 (B)의 평균 값은 (그룹 당 n = 15)이 표시됩니다. 오차 막대는 표준 편차 및 별표는 통계적으로 유의 한 차이 (일원 분산 분석, P <0.05)를 나타냅니다. Steinritz 외. (2014) 9에서 수정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
미토콘드리아 막 전위. EEC 그림 3. 평가 클로 람 부실 (12.5 μg의 / ㎖) 또는 chloramb에 노출, 가짜 처리했다UCIL 노광 및 ALA (15 NG / ml)로 처리 하였다. 24 시간 노출 후, 세포를 이미지화 바로 15 분 동안 TMRM 탑재 하였다. () 비노출 EEC는 손상되지 않은 미토콘드리아 막 잠재력을 나타내는 TMRM 라벨링 후 별개의 신호를 한 것으로 밝혀졌습니다. (B) 클로 노출 TMRM 신호의 상당한 감소 결과. ROS 폐품 알파 리놀렌산과 클로 람 부실 노출 EEC의 (C) 치료가 미토콘드리아 막 잠재력을 복원. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
독성 화학 물질에 대한 피부 노출은 종종 심한 상처 치유에 장애를 초래한다. 기본 메커니즘은 크게 알려져 있지 않다. 상처 치유는 서로 다른 단계 (지혈, 염증, 증식 및 리모델링)로 구성된 복잡한 과정이다. 세포 이동은 그러나, 육아 조직의 형성에 가장 중요하고, 모든 단계에 관여한다. 여기서, 새로운 혈관은 혈관 형성 또는 angio- 의해 하나 형성된다.
두 과정은 전구체 및 초기 내피 세포의 영향을받지 이동이 필요합니다. 세포 이동 및 방해 세포의 이동에 대한 기본 메커니즘을 명확히의 평가는 독성 물질에 의한 상처 치유 질환에 대한 새로운 치료 전략을 개발하기 위해 매우 관련이있다.
세포 이동은 다른 방법에 의해 평가 될 수있다. 일반적으로 사용되는 기술은 원래 항체 antig를 분석 도입 된 Boyden 챔버 에세이 인EN은 백혈구 (13)에 화성을 일으키는 원인이되었다. 이 분석은 화학 유인 물질에 응답하여 상기 하부 구획 트랜스 웰 인서트의 상부 구획으로부터 세포의 침윤 능력을 반영 정량 종점 분석법이다. 본 명세서에 기재된 기술에서, 어떠한 화학 유인 물질은 하부 챔버에 첨가하지 않았다. 제어 조건 하에서 또는 클로 람 부실에 응답 EEC에 따라서 chemokinesis (특정 화학 유인 물질없이 임의 마이그레이션)을 조사 하였다.
인서트는 멤브레인의 기공을 통해 삼차원 세포 이동을 허용 다공성 막으로 구성. 모든 세포의 척추 브레이스 통과를 허용한다 너무 큰 기공 완전히 세포의 이동을 방지 할 너무 작은 기공 : 막의 기공 크기는 셀 크기에 관하여 선택되어야한다. 초기 내피 세포의 경우, 8 ㎛의 공극 크기를 권장합니다. 부적절한 기공 크기의 사용은 재생 불가능한 결과를 초래할 것이다. 순으로 하였다R, 우리는 핵보다 큰 기공 크기로 시작 권장 EEC 같은 상이한 특성을 갖는 세포 프로토콜을 적용하고, 필요한 경우 세공 직경을 단계별로 증가한다. 예를 들어, 백혈구 같은 작은 세포 3 ㎛의 기공 크기를 권장합니다.
중요한 문제가 분석 될 때까지 배양 시간의 판정이다. 시간이 지남에 따라, (적어도 제어 그룹) 세포 증식이 일어날 것이다. 차례로 이것은 잠재적 방법의 민감도를 감소 막을 통해 침투 할 셀의 수를 증폭한다 : 조금이라도 손상 이동성 능력을 가진 세포은 장시간 이주 할 수있다. 따라서, 오랜 기간 (예 : 24 시간)은 내피 세포하지 않는 것이 좋습니다. 배양 세포 파종 후 너무 짧으면 한편, 세포의 소량 만이 막을 통과한다. 8 시간 배양 최적의 발견되었다. 8 시간의 정의 배양 시간 후, 세포다시, 고정 스테인드 수동었다.
(마이그레이션하지 않은) 멤브레인의 상단에 (1) 세포를 면봉으로 제거됩니다 분석을위한 세 가지 접근 방법이있다. 이어서 막 (마이그레이션 세포)의 바닥면에 세포를 염색하거나 세포 학적 (예, 헤 마톡 실린), 또는 형광 색소 (예를 들어, DAPI)와 함께 계산된다. (2) 선택적으로, 하단 측의 셀은 제 형광 염료로 염색 될 수 있고 (예, 트립신을 이용하여) 이후에 분리된다. 이어서 형광 형광 판독기를 사용하여 정량화된다. (3) 우리는 이에 이주되지 않은 세포 (세포 막 위에) 및 마이그레이션 세포 (멤브레인의 바닥)의 분화를 허용하는 광 전송을 차단 어두운 색의 다공성 멤브레인을 사용하는 것이 좋습니다. 바닥면에 세포가 형광 현미경을 이용하여 카운트 형광 염색 후 (세포학 염료가 사용될 수 없음). 그것은 C에 중요하지 않다멤브레인 배향 onfound. 불투명 한 막을 사용하는 것은 이주되지 않은 세포를 제거 할 필요성을 제거한다. 불투명 막, 형광 염색 및 수동 세포 계수의 사용은 다른 방법보다 우수한 밝혀졌다.
일반적으로, 보이든 챔버 분석은 취급이 용이하며, 따라서 분석 또한 세포 이동의 평가를 위해 자주 사용되는 분석법이다. (1) 보이든 챔버 분석 엔드 포인트 분석이다 : 그러나, 두 가지 주요 단점이있다. 분석 시점이 정확하지 않으면 그 방법은, 결과는 잘못 될 수있다. (2) 분석은 자동화하는 것이 용이하지 않다. 그럼에도 불구하고,이 분석은 세포 이동의 평가를위한 가장 중요한 도구 중 하나입니다.
고정 된 Boyden 챔버 에세이 달리 분석 상처 치유 (라고도 갭 고정 분석법 또는 스크래치 시험이라고 함)을 실시간으로 동적 분석이다. 그것은 세 가지 차원 세포 침공의 움직임이없는 두 차원 마이그레이션 분석입니다. 피펫 팁 세포층 "상처"후에, 세포는 갭 내로 이동한다. 분석은 실시가 간단하고 엔드 정적 분석의 문제를 피할 수있다. (1) 라이브 세포 이미징 현미경 시스템 (37 ℃, 습한 분위기와 5 % CO 2)가 필요합니다 : 그러나, 분석은 몇 가지 문제가있다. 세포 배양 접시가 건조하지 않도록해야합니다. (2) 시간 경과 영상 획득이 사용되는 매개 변수 (해상도, 간격)에 따라 대용량 데이터 파일에 발생합니다. (3) 피펫 팁으로 전지 층을 긁는 것은 초기에 나타나는 것처럼 쉽지 않다. 유물이 발생할 수 있습니다 접시 표면이 손상 너무 많은 압력. 또한, 상기 갭 폭은 다를 수 내 스크래치 및 다른 연구자마다 다를 수있다. 경험이 풍부한 연구자를 권장합니다. (4) 병렬로 실행할 수있는 샘플의 수는 장치에 의해 제한된다. 그럼에도 불구하고, 분석을 치유 상처는 양적 QUAL 또 다른 유용한 도구입니다세포 이동의 itative 평가. 이동 속도, 이동 거리에 대한 정보는, 감독 마이그레이션은 하나의 실험 장치에서 수집 할 수 있습니다. 두 차원 시스템의 셀 추적은 매우 어려운 일이 아니다 오픈 소스 소프트웨어 (예를 들어, ImageJ에와 MTrackJ)을 수행 할 수 있습니다.
세포 배양 접시 코팅은 세포 부착에 대해서만 중요하지 않지만 이주에 대해서는 세포 기능에 중요한 영향을 끼친다. 내피 세포는 일상적으로 0.1 % 젤라틴 코팅 표면에 배양한다. 무 코팅 내피 세포 배양을위한 표면의 사용은 감소 된 증식 14 결과. 기타 코팅 (예, 피브로넥틴)는 단기 배양에도 적합 발견하지만, 젤라틴 코팅은 장기 배양 실험 15에서 우수한 성능을 나타내었다.
라이브 세포 이미징 시장에 다수의 형광 염료가있다. 우리는 마치 한센 TMRM는 미토콘드리아 막 잠재력을 조사합니다. 많은 다른 염료 (예, JC-1, TMRE)는 유사한 성능을 나타낸다. 단색 프로브 (TMRM, TMRE)와 대조적으로, 미토콘드리아 축적 후 녹색에서 적색 JC-1 형광 이행한다. 이 16 (예를 들어, 추적 염료를 이용하여 미토콘드리아를 식별하기 위해) 미토콘드리아 편광 상태의 비율 적 반 정량 분석이 가능하지만, 듀얼 염색 실험을 방해한다. 실험 설계, 세포 처리 및 인수 도전 훨씬 더 많은 관심을 필요로하는 반면 우리의 경험에서 염료 자체가 실험 덜 중요하다. 거의 모든 형광 염료는 민감한 빛입니다. 따라서, 셀 로딩은 어둠 속에서 수행해야합니다. 셀 로딩은 15 ~ 30 분을 필요로한다. 장기간 로딩 시간이 증가 신호가 발생하지 않으며, 사용하지 않는 것이 좋습니다. 특정 신호가 긴 로딩 기간 후에 검출 될 수 있지만, 색소 세포 내 축적 COMPART 수도사항 또는 심지어 세포에서 배출 될 수 있습니다. 결과적으로, 세포를 실험의 시작 전에 분석하고 반드시 바로 로딩되어야한다. 염료 로딩 농도는 통상 10 μM의 범위이다. 그러나, TMRM 훨씬 낮은 농도 (20 ㎚)는 라벨에 대한 충분한 발견하고 여전히 합리적인 결과를 제공 하였다. 그림에 나타낸 바와 같이 3 라벨 24 시간 후 클로 람 부실 노출은 미토콘드리아 막 전위의 별개의 손실의 결과. ROS-거제 초기 노출 후 24 시간에서의 미토콘드리아 막 전위를 유지할 수 있었다로 클로 람의 치료 EEC를 노출.
요약, 보이든 챔버 분석에서, 성적에 관한 정량적 측면 마이그레이션 동작을 평가하기 위해 단일 세포 트랙 분석과 함께 가치있는 도구를 분석을하고 있습니다 상처 치유. TMRM와 미토콘드리아 가능성의 레이블은 기본 메커니즘을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Boyden Chamber | |||
| Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 3 µm | Corning Incorporated | #351151 | |
| Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 8 µm | Life Sciences | #351152 | |
| (for use with Falcon Insert 24 well Companion Plate (353504) | |||
| Wound healing assay | |||
| Glass bottom dishes | Word Precision Instruments, Inc. | #FD35-100 | |
| Assessment of mitochondrial potential | |||
| TMRM (tetramethylrhodamine methyl ester) | Life Technologies | #T669 | |
| Cell culture | |||
| Accutase | PAA, Pasching, Austria | # L11-007 | |
| α-Linolenic acid | Fluka (Sigma), Steinheim, Germany | # L2376 | |
| Chlorambucil | Fluka (Sigma), Steinheim, Germany | # 23125 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany | # G2500-100G |
References
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