Abstract
(सल्फर और नाइट्रोजन सरसों की तरह क्षारीकरण रासायनिक युद्ध एजेंटों सहित) रासायनिक पदार्थों के संपर्क में घाव भरने के विकार सहित नैदानिक लक्षणों में से एक बहुतायत के कारण। घाव भरने की शारीरिक प्रक्रिया बेहद जटिल है। या तो vasculogenesis के माध्यम से (उपन्यास संरचना) या एंजियोजिनेसिस (मौजूदा जहाजों की अंकुरण) - दानेदार बनाने का कार्य ऊतक के गठन के लिए एक प्रारंभिक घाव बंद में जिसके परिणामस्वरूप और एक नया केशिका रक्त वाहिकाओं के नेटवर्क उपलब्ध कराने के लिए इस प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कदम है। दोनों vasculo- और angiogenesis endothelial कोशिकाओं के कार्यात्मक, निर्देशित प्रवास की आवश्यकता होती है। इस प्रकार, जल्दी endothelial सेल (ईईसी) प्रवास की जांच संभावित चिकित्सीय हस्तक्षेप के लिए उपन्यास रणनीतियों की पहचान विकारों के उपचार रासायनिक प्रेरित घाव के pathophysiology को समझने और करने के लिए महत्वपूर्ण है।
हम एजेंट जोखिम क्षारीकरण के बाद बिगड़ा घाव भरने का मूल्यांकन और tr के लिए संभावित उम्मीदवार के यौगिकों का परीक्षण कियाeatment। हम इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित तकनीकों का एक सेट का इस्तेमाल किया। एक संशोधित Boyden कक्ष मात्रात्मक ईईसी की chemokinesis वर्णन किया गया है जांच करने के लिए। इसके अलावा, गुणात्मक प्रवास का आकलन करने के लिए ट्रैक विश्लेषण के साथ संयोजन में परख घाव भरने के उपयोग सचित्र है। अंत में, हम परेशान सेल प्रवास के अंतर्निहित तंत्र की पहचान करने के लिए mitochondrial झिल्ली क्षमता की जांच के लिए फ्लोरोसेंट डाई TMRM के उपयोग के प्रदर्शन। निम्नलिखित प्रोटोकॉल ईईसी की जांच के लिए अनुकूलित किया गया है कि बुनियादी तकनीकों का वर्णन है।
Introduction
सेल प्रवास त्वचा की चोट के बाद विकास, विभिन्न रोगों, और घाव भरने सहित कई शारीरिक और pathophysiological प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण है।
त्वचा की चोट के बाद, सूजन क्षतिग्रस्त या परिगलित ऊतक और दानेदार बनाने का कार्य ड्राइव प्रारंभिक घाव बंद निकालता है और vasculogenesis के माध्यम से नए केशिकाओं के एक नेटवर्क के गठन (उपन्यास संरचना) या एंजियोजिनेसिस (मौजूदा vesicles के अंकुरण) 1-3 की अनुमति देता है। दोनों vasculo- और angiogenesis endothelial कोशिकाओं के पलायन की आवश्यकता होती है। रक्त वाहिकाओं के बढ़ते नेटवर्क अंततः keratinization गुजरना जो केरेटिनकोशिकाओं proliferating को ऑक्सीजन और पोषक तत्वों के परिवहन के लिए आवश्यक है, एक नया उपकला फार्म और घाव बंद प्रदान करते हैं।
Endothelial कोशिकाओं का बिगड़ा प्रवास विकार 4,5 घाव भरने का एक मुख्य कारण है। जल्दी endothelial कोशिकाओं के प्रकार, विधियों का आकलन करने के लिए प्रवास pathophysiol का पता लगाने के लिए आवश्यक हैंसेल प्रवास विकारों के ogy और चिकित्सकीय हस्तक्षेप के लिए उपन्यास रणनीतियों की पहचान करने के लिए।
क्षारीकरण एजेंट (जैसे, सल्फर और नाइट्रोजन सरसों) के लिए चमड़े का जोखिम विकार 6 घाव भरने का कारण बनता है। ऐसे यौगिकों के कारण राजनीतिक रूप से अस्थिर क्षेत्रों और अपेक्षाकृत सरल संश्लेषण में मौजूदा जरिए मजबूत करने के लिए चिंता का कारण यह है कि 20 वीं सदी में कई संघर्षों में रासायनिक युद्ध एजेंट के रूप में इस्तेमाल किया और रहना गया। सल्फर सरसों पहले 1822 में संश्लेषित किया गया था हालांकि, एसएम जोखिम के आणविक और क्लीनिकल पैथोलॉजी में विस्तार से समझा नहीं गया है और एस.एम. लोगों तक पहुंचाने के लिए कोई मारक पहचान की गई है।
कई अध्ययनों से समझने के लिए और एस.एम. प्रदर्शन के बाद बिगड़ा घाव भरने के लिए मॉडल और प्रभाव है कि आरक्षण के लिए सक्षम संभावित उम्मीदवार यौगिकों के लिए परीक्षण करने के लिए आयोजित किया गया है। श्मिट एट अल। (2009) क्लोरैम्बुसिल का असर, समझौता ज्ञापन में एसएम करने के लिए इसी तरह की संपत्ति के साथ एक क्षारीकरण यौगिक का परीक्षण कियाएसई embryoid शरीर मॉडल और पोत गठन 7 में एक नाटकीय, कभी कभी अधिक से अधिक 99% की कमी पाया। इस प्रतिकूल प्रभाव सबसे अधिक है, शारीरिक शर्तों के तहत, प्रसार और संवहनी endothelial अग्रदूत कोशिकाओं के प्रवास का प्रभुत्व है जो विकास के चरण में घोषित किया गया था। इस प्रकार, इन कोशिकाओं एजेंटों क्षारीकरण करने के लिए विशेष रूप से संवेदनशील होने की पहचान की गई। Steinritz एट अल। (2010) के लिए, माउस embryoid शरीर मॉडल में और विशेष रूप से एस एम विषाक्तता को कम करने की क्षमता के लिए विशेष रूप से, एन एसिटाइलसिस्टीन (एनएसी) और अल्फा लिनोलेनिक एसिड (ALA) में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस), के मैला ढोने वालों का परीक्षण किया पोत गठन 8 बहाल। अस्थाई सुरक्षात्मक प्रभाव अत्यधिक आरओएस गठन के घाव भरने पर एस.एम. के प्रतिकूल प्रभाव के लिए योगदान करने की संभावना थी यह दर्शाता है कि मनाया गया। इन प्रभावों को स्थायी नहीं थे और दो उम्मीदवार यौगिकों दीर्घकालिक 8 में पोत गठन और घाव भरने को बहाल करने में सक्षम नहीं हो सकता है। Howeveआर, उन प्रयोगों सेल प्रवास के जांच की अनुमति देने के लिए किया था, जो एक जटिल 3 डी मॉडल में आयोजित की गई। इस प्रकार, हम बाद में पोत गठन 9 की प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण भूमिका है कि ईईसी की सेल प्रवास पर लाभकारी प्रभाव के लिए एनएसी और पक्षक का परीक्षण किया।
इसके अलावा, सेल polarity सेल प्रवास के लिए आवश्यक है कि सबूत नहीं है। आरओएस गठन के लिए अग्रणी mitochondrial रोग सेल polarity ख़राब करने के लिए दिखाया गया था और इस तरह प्रतिकूल सेल प्रवास को प्रभावित कर सकता है। इसलिए, mitochondrial समारोह के संबंध में रहते सेल इमेजिंग प्रदर्शन किया था और आरओएस मैला ढोने वालों के प्रभावों की जांच की गई। निम्नलिखित प्रोटोकॉल ईईसी, Boyden कक्ष परख, सेल ट्रैकिंग के विश्लेषण और विस्तार से mitochondrial समारोह के आकलन के लिए TMRM के उपयोग सहित परख घाव भरने की खेती के लिए सामान्य आवश्यकताओं का वर्णन है। ईईसी खेती और प्रवास के लिए प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण पहलुओं को उजागर कर रहे हैं।
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Protocol
निम्नलिखित प्रोटोकॉल जल्दी endothelial सेल प्रवास की जांच के लिए तकनीक का वर्णन है। संवहनी endothelial कोशिकाओं के समुचित खेती एक एन्दोथेलिअल phenotype की समुचित प्रसार और रखरखाव सुनिश्चित करने के लिए जिलेटिन के साथ सेल संस्कृति बोतल के पूर्व कोटिंग की आवश्यकता है।
सेल संस्कृति बोतल के 1. पूर्व कोटिंग
- 0.1% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए 0.1 एम पीबीएस में जिलेटिन भंग।
- (विवरण के विशिष्ट आटोक्लेव के निर्देशों को देखने के लिए) तरल वाष्पदावी के लिए मानकों के साथ समाधान आटोक्लेव।
- एक बाँझ सेल संस्कृति कुप्पी (एक T25 के सेल संस्कृति कुप्पी के लिए उदाहरण के लिए, कम से कम 5 मिलीलीटर) को autoclaved जिलेटिन समाधान के लिए पर्याप्त मात्रा में शामिल करें।
- एक मशीन में बोतल हस्तांतरण (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 की आवश्यकता नहीं है लेकिन हस्तक्षेप नहीं करता है) कम से कम 30 मिनट के लिए।
- शेष जिलेटिन समाधान निकालें। बाद में पूर्व लेपित बोतल का प्रयोग करें (देखें सेल खेती) या एसउपयोग करें जब तक बाँझ शर्तों के तहत फाड़ दिया।
प्रारंभिक endothelial कोशिकाओं की 2. सेल खेती
नोट: इससे पहले 10,11 वर्णित के रूप में भ्रूण स्टेम सेल व्युत्पन्न जल्दी endothelial कोशिकाओं (ईईसी) PECAM-1 सकारात्मक सेल अंश का चुंबकीय सक्रिय सेल छँटाई द्वारा विभेदित murine embryoid निकायों से प्राप्त किया गया।
- DMEM में जिलेटिन लेपित सेल संस्कृति व्यंजन पर संस्कृति ईईसी 15% एफसीएस, 50 यू / एमएल पेनिसिलिन, 50 यू के साथ पूरक / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन, 200 माइक्रोन एल glutamine, 100 माइक्रोन SS-mercaptoethanol और 1% गैर आवश्यक अमीनो एसिड होता है। बाँझ शर्तों के तहत कोशिकाओं को संभाल लेना। 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 के साथ कोशिकाओं को खेती और 95% आर्द्रता उप संगम (अधिकतम। 80%) तक।
- 5 अनुपात: उप-संगम पर एक 1 पर कोशिकाओं को विभाजित। नोट: endothelial कोशिकाओं की टुकड़ी एक महत्वपूर्ण कदम है।
- आर टी Accutase साथ कोशिकाओं फसल। , मीडिया निकालें पीबीएस के साथ कुल्ला और 25 सेमी प्रति Accutase के 1 मिलीलीटर जोड़ें
- कोशिकाओं को अलग कर दिया है जब तक 2-10 मिनट के लिए आरटी पर फ्लास्क सेते हैं। कोशिकाओं को फैलाने और इच्छित आवेदन को हस्तांतरण। नोट: Accutase के एक रासायनिक निराकरण वरीयता प्राप्त कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में जमा हो जाती है जब यह जगह लेता है के रूप में की आवश्यकता नहीं है। हालांकि, Accutase गतिविधि भी DMEM युक्त एफसीएस जोड़कर कम किया जा सकता है।
- आर टी Accutase साथ कोशिकाओं फसल। , मीडिया निकालें पीबीएस के साथ कुल्ला और 25 सेमी प्रति Accutase के 1 मिलीलीटर जोड़ें
3. Boyden चैंबर
नोट: Boyden कक्ष assays के 8 माइक्रोन रोमकूप आकार के साथ प्रकाश अपारदर्शी पॉलीथीन terephthalate डालने सिस्टम का उपयोग करके प्रदर्शन कर रहे हैं।
- प्री-कोट में कम से कम 30 मिनट के लिए 0.1 एम पीबीएस में भंग 0.1% जिलेटिन की 500 μl जोड़कर फिल्टर सम्मिलित करता है (इस प्रकार एक Boyden कक्ष बनाने सेल संस्कृति कुओं के अंदर है कि फिट)।
- कोशिकाओं जहरीले रसायनों के संपर्क में जा रहे हैं, तो सेल कटाई से पहले विशिष्ट प्रयोगात्मक डिजाइन के अनुसार बेनकाब। नोट: कोशिकाओं / मिलीलीटर DMEM 12.5 माइक्रोग्राम क्लोरैम्बुसिल से अवगत कराया गया24 घंटा के लिए। विशिष्ट प्रयोगात्मक डिजाइन के संबंध में निर्देश भिन्न हो सकते हैं।
- हार्वेस्ट ईईसी एक गिनती सेल कक्ष का उपयोग करके सेल नंबर निर्धारित करने और। नोट: स्वचालित गिनती उपकरणों का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन सावधानी के साथ प्रयोग किया जाना चाहिए: मैनुअल सेल गिनती ज्यादा सटीक है और अत्यधिक की सिफारिश की है।
- Boyden चैंबर के निचले सदन डिब्बे में 500 μl सेल संस्कृति के माध्यम जोड़ें।
- ऊपरी सदन के डिब्बे में फिल्टर डालने के प्रति 500 μl सेल संस्कृति माध्यम में ठीक 10 4 ईईसी जोड़ें। बुलबुले को खत्म।
- वास्तव में 8 घंटे के लिए इनक्यूबेटर में फिल्टर आवेषण सेते हैं।
- पीबीएस के साथ एक बार कुल्ला और सेल निर्धारण के लिए 25 मिनट के लिए दोनों डिब्बों में 0.5 मिलीलीटर 4% paraformaldehyde के साथ मध्यम बदलें। बड़े पैमाने पर फिल्टर धो लें लेकिन 0.1 एम पीबीएस के साथ कम से कम 3 बार।
- एक स्केलपेल के साथ झिल्ली आबकारी।
- परमाणु stainin लिए DAPI युक्त बढ़ते मध्यम के साथ दो गिलास को कवर फिसल जाता है के बीच झिल्ली माउंटजी। उन्मुखीकरण पर ध्यान दे। झिल्ली के निचले कम्पार्टमेंट पक्ष की ओर चले गए हैं कि केवल कोशिकाओं में गिने जाते हैं कि सुनिश्चित करें।
- 400X बढ़ाई पर एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी साथ झिल्ली के निचले कम्पार्टमेंट पक्ष की ओर चले गए हैं कि कोशिकाओं की गणना। माइग्रेट कोशिकाओं (चित्रा 1 ए, 1 बी) के साथ झिल्ली है pores भ्रमित मत करो। जैविक प्रतिकृति का एक उचित संख्या (हालत प्रति कम से कम 3 जैविक प्रतिकृति) की जाँच।
4. घाव भरने परख
- डीआईसी माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हैं, प्लास्टिक की सतह आधारित संस्कृति बर्तन या अच्छी तरह प्लेटें से बचने लेकिन इसके बजाय कांच आधारित उपकरणों का उपयोग करें: उपलब्ध उपकरणों पर निर्भर करता है, ध्यान से सेल संस्कृति व्यंजन या प्लेटों का चयन करें।
नोट: चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हैं, प्लास्टिक आधारित व्यंजन भी इस्तेमाल किया जा सकता है। - लाइव सेल इमेजिंग के लिए एक उपयुक्त सेल संस्कृति डिवाइस में ईईसी खेती (उदाहरण के लिए, 4 सेमी गिलास नीचे पेट्री डिश उपयुक्त) 80% संगम तक। महत्वपूर्ण: संगम पूरा करने के लिए कोशिकाओं पर खेती नहीं करते।
- बाँझ 10 μl पिपेट सुझावों के साथ monolayers के स्क्रैच। पकवान की सतह पर बहुत अधिक दबाव के बिना धीरे टिप पुश और अलग कोशिकाओं को दूर करने के लिए 0.1 एम पीबीएस के साथ कोशिकाओं को दो बार other.Wash करने के लिए एक तरफ से सुचारू रूप से एक सीधी रेखा में चलते हैं।
- संस्कृति डिश के लिए माध्यम की एक पर्याप्त मात्रा में शामिल करें। यदि लागू हो, जांच की जानी चाहिए कि यौगिकों जोड़ें।
नोट: युक्त 1.5 मिलीलीटर मध्यम 15 एनजी / एमएल अल्फा लिनोलेनिक एसिड जोड़ा गया है। - लाइव सेल इमेजिंग में सक्षम एक खुर्दबीन के नीचे संस्कृति डिश माउंट। सीओ 2 से 5%, 37 डिग्री सेल्सियस और एक humidified वातावरण सुनिश्चित करें।
नोट: Humidification मध्यम वाष्पीकरण से बचने के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। - 10 मिनट के अंतराल पर 24 घंटे से अधिक समय व्यतीत हो छवियों मोल। बड़ी फ़ाइल आकार के लिए योजना। नोट: 512 X 512 पिक्सल के एक संकल्प आमतौर पर पर्याप्त है; हालांकि, हम कम से कम 1,024 एक्स 1,0 की छवियों का उपयोग करने की सलाह देते हैं24।
- खुला स्रोत सॉफ्टवेयर (जैसे, ImageJ) माइक्रोस्कोप के साथ प्रदान की सॉफ्टवेयर की लंबाई उपकरण का उपयोग कर = 24 घंटा = 0 टी घंटा में और टी में खाई चौड़ाई को मापने या का उपयोग करें। नोट: सामान्य विशिष्ट छवि अधिग्रहण और विश्लेषण सॉफ्टवेयर में निर्माता द्वारा प्रदान की जाती है। इसलिए, सॉफ्टवेयर के उपयोग के बारे में तकनीकी जानकारी के लिए, मैनुअल को देखें।
5. सेल ट्रैकिंग
- डीआईसी माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हैं, प्लास्टिक की सतह आधारित संस्कृति बर्तन या अच्छी तरह प्लेटें से बचने लेकिन इसके बजाय कांच आधारित उपकरणों का उपयोग करें: उपलब्ध उपकरणों पर निर्भर करता है, ध्यान से सेल संस्कृति व्यंजन या प्लेटों का चयन करें।
नोट: चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हैं, प्लास्टिक आधारित व्यंजन भी इस्तेमाल किया जा सकता है। - एक उपयुक्त सेल संस्कृति डिवाइस में पूरक DMEM में 5 एक्स 10 4 ईईसी बीज (जैसे, 24 multiwell प्लेट) और 37 डिग्री सेल्सियस और 1-2 दिनों के लिए 95% आर्द्रता पर 5% सीओ 2 के साथ कोशिकाओं खेती।
- कोशिकाओं को एक से 80 हो गए हैं जब% संगम, संबंधित परीक्षण पदार्थों की मौजूदगी में मीडिया और संस्कृति नए मीडिया के साथ कोशिकाओं को हटाने (उदाहरण के लिए, 12.5 माइक्रोग्राम क्लोरैम्बुसिल / मिलीलीटर DMEM)। हमेशा (व्यक्तिगत परख सिस्टम के आधार पर 24 घंटा,) समय की एक निश्चित अवधि के लिए 37 डिग्री सेल्सियस (विलायक, जैसे, इथेनॉल के साथ इलाज) नियंत्रण कक्षों में शामिल हैं।
- लाइव सेल इमेजिंग (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 और 95% आर्द्रता) में सक्षम एक खुर्दबीन के नीचे संस्कृति डिश माउंट। पूर्वनिर्धारित अंतराल पर 24 घंटे से अधिक समय व्यतीत हो छवियों मोल। 10 मिनट के अंतराल पर छवियों मोल।
- ImageJ प्लगइन MTrackJ का उपयोग करके मैन्युअल ईईसी के प्रदर्शन पर नज़र रखने। देखने के क्षेत्र से बेतरतीब ढंग से 10 कोशिकाओं को चुनें और MTrackJ की कमान "जोड़ें" का उपयोग करते हुए समय में बिंदु प्रति एक डेटा बिंदु जोड़कर उनकी गतिविधियों पर नज़र रखने।
[। Meijering, Mtrackj "http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/"] MTrackJ पर मुक्त करने के लिए उपलब्ध है और ImageJ availab है: नोट[Rasband, ImageJ। "http://rsbweb.nih.gov/ij/"] पर Le। MTrackJ प्लगइन के बारे में एक विस्तृत मार्गदर्शन "http://www.imagescience.org" पर उपलब्ध है।
6. लाइव सेल इमेजिंग / mitochondrial झिल्ली का आकलन संभावित
- एक उपयुक्त सेल संस्कृति डिवाइस में ईईसी खेती (उदाहरण के लिए, जीना सेल इमेजिंग के लिए उपयुक्त 4 सेमी गिलास नीचे पेट्री डिश) एक 80% संगम तक।
महत्वपूर्ण: संगम पूरा करने के लिए कोशिकाओं पर खेती न करें। - यदि लागू हो, रसायन कोशिकाओं को बेनकाब। नोट: प्रकोष्ठों 24 घंटा के लिए 12.5 माइक्रोग्राम / एमएल क्लोरैम्बुसिल से अवगत कराया गया। विशिष्ट प्रयोगात्मक डिजाइन के संबंध में निर्देश भिन्न हो सकते हैं।
- Tetramethylrhodamine DMSO में (TMRM) के एक 10 मिमी स्टॉक समाधान तैयार है। लाइट से बचाएँ। नोट: शेयर समाधान -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है।
- (: 1,000 कमजोर पड़ने 1) 10 माइक्रोन की एक एकाग्रता के साथ काम कर रहे एक समाधान करने के लिए सेल संस्कृति माध्यम में शेयर समाधान पतला। लाइट से बचाएँऔर जितनी जल्दी हो सके उपयोग करें। नोट: काम कर समाधान के लिए कुछ समय के लिए (> 1 घंटा) के लिए आरटी पर रखा जा सकता है, हालांकि, एक ताजा काम कर समाधान की तैयारी अत्यधिक की सिफारिश की है।
- 1 मिलीलीटर ताजा सेल संस्कृति के माध्यम से (लोड हो रहा समाधान) के लिए काम कर समाधान के 2 μl जोड़ें।
- लोड हो रहा है समाधान के साथ सेल संस्कृति के माध्यम से जगह से कोशिकाओं को लोड करें। 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 और humidified माहौल (इनक्यूबेटर) पर 15 मिनट के लिए सेते हैं। सावधानी: लगभग सभी प्रतिदीप्ति संकेतक समय के साथ जीवित कोशिकाओं द्वारा निर्यात कर रहे हैं; इसलिए लंबे समय तक लोड हो रहा है या देरी विश्लेषण से बचें।
- धोने के बिना, जीना सेल इमेजिंग के लिए उपयुक्त एक खुर्दबीन के नीचे पकवान जगह है। महत्वपूर्ण: प्रतिदीप्ति संकेतक इसलिए, अनावश्यक प्रकाश जोखिम से बचने के लिए, रोशनी करने के लिए अत्यधिक संवेदनशील होते हैं।
- विभिन्न छवियों के बीच तुलनात्मकता सुनिश्चित करने के लिए अधिग्रहण के मानकों को बदलने के बिना छवियों मोल।
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Representative Results
क्षारीकरण एजेंटों के लिए चमड़े का जोखिम पर्विल, छाला गठन और एक घाव भरने के विकार के साथ जुड़ा हुआ है कि चमड़े का छालों भड़काती। घाव भरने endothelial कोशिकाओं के प्रवास पर आधारित होते हैं जो angio- और vasculogenesis की आवश्यकता है। मात्रात्मक प्रवास Boyden कक्ष परख के उपयोग के द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है। क्षारीकरण एजेंट क्लोरैम्बुसिल को ईईसी की चित्रा 1C जोखिम में दिखाया गया है सेल प्रवास 9 में एक महत्वपूर्ण कमी के परिणामस्वरूप। सीधे 24 घंटे के लिए क्लोरैम्बुसिल से संपर्क के बाद आरओएस-मेहतर अल्फा लिनोलेनिक एसिड (ALA) के अलावा काफी लगभग नियंत्रण के स्तर के लिए, इस phenotype बचाया।
Boyden कक्ष परख माइग्रेट कोशिकाओं की संख्या (मात्रा) का आकलन करने के लिए एक उपयुक्त उपकरण है। हालांकि, परख कोशिकाओं के प्रवास व्यवहार के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करता है। चित्रा 2 unexposed ईईसी घाव और चिकित्सा पिछवाड़े में अंतर को बंद करने में सक्षम हैं कि यह दर्शाता है24 घंटा 9 भीतर प्र। इसके विपरीत, क्षारीकरण एजेंट क्लोरैम्बुसिल से अवगत कराया ईईसी परख 9 घाव भरने में अंतर को बंद करने में असमर्थ थे। इसके अलावा, एकल ईईसी की सेल पर नज़र रखने क्लोरैम्बुसिल निर्देशित आंदोलन के प्रभाव में 9 नहीं मनाया गया था कि पता चला। आरओएस-मैला ढोने वालों के साथ ईईसी के उपचार निर्देशित सेल प्रवास 9 बहाल करने में सक्षम था।
Mitochondrial आरओएस गठन सेल प्रवास 12 की हानि के साथ संबद्ध किया गया है। क्लोरैम्बुसिल को ईईसी की चित्रा 3 लोगों तक पहुंचाने में दिखाया गया के रूप में 9 संभावित mitochondrial झिल्ली का टूटना में हुई। आरओएस-मेहतर के साथ ईईसी के उपचार माइटोकॉन्ड्रियल क्षति को रोका और mitochondrial झिल्ली क्षमता को बनाए रखा।
सारांश में, प्रोटोकॉल खंड में वर्णित सभी तरीकों सेल प्रवास का आकलन करने के लिए उपयुक्त उपकरण हैं। वी प्रदान कर सकता है mitochondrial झिल्ली क्षमता के नुकसान या संरक्षण पर निष्कर्षबिगड़ा सेल प्रवास के अंतर्निहित आणविक तंत्र के बारे में aluable संकेत दिए।
चित्रा 1. Boyden कक्ष परख। (ए) ईईसी, 8 घंटे के लिए incubated, Boyden कक्ष फिल्टर सम्मिलित करता है पर वरीयता प्राप्त तय की और DAPI के साथ दाग रहे थे। तारों ईईसी माइग्रेट संकेत मिलता है। प्रस्तुत छवि में 19 कोशिकाओं के एक कुल (चित्रा 1 बी) में गिना जा सकता है। लाल तीर सिर पूरी तरह से डालने भर में माइग्रेट नहीं या कि देखने के क्षेत्र में पूरी तरह से नहीं कर रहे हैं और इस तरह सेल गिनती से बाहर रखा गया है कि कोशिकाओं से संकेत मिलता है। (बी) के छवि अधिग्रहण के लिए लंबे समय जोखिम बार का उपयोग करते समय दिखाई देने लगते हैं झिल्ली में pores (8 माइक्रोन)। माइग्रेट कोशिकाओं के साथ उन्हें भ्रमित मत करो। नियंत्रण के तहत (सी)शर्तों झिल्ली के माध्यम से माइग्रेट 212 कोशिकाओं के एक औसत। क्लोरैम्बुसिल जोखिम केवल 128 माइग्रेट कोशिकाओं में हुई। आरओएस-मेहतर अल्फा लिनोलेनिक एसिड (ALA) काफी बचाया सेल प्रवास साथ क्लोरैम्बुसिल उजागर ईईसी के उपचार। प्रतीक एक फिल्टर डालने से अलग-अलग परिणामों का प्रतिनिधित्व करते हैं। काले क्षैतिज सलाखों (एन = 4), त्रुटि सलाखों SD और तारक महत्वपूर्ण मतभेद का संकेत संकेत मिलता साधन संकेत मिलता है। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2. घाव भरने परख / सेल ट्रैकिंग। ईईसी (मध्यम के आदान-प्रदान) का इलाज-नकली या 12.5 माइक्रोग्राम / एमएल क्लोरैम्बुसिल से अवगत कराया गया। , कोशिकाओं डब्ल्यू scratching के बादपहले 24 घंटे के लिए जांच की। (ए) ईईसी ईईसी उजागर क्लोरैम्बुसिल जबकि 24 घंटे के भीतर घाव भरने परख में अंतर को बंद करने में सक्षम अंतर को बंद करने में असमर्थ रहे थे। पक्षक के साथ उपचार सेल प्रवास का एक महत्वपूर्ण सुधार में हुई। समूह के अनुसार 5 तकनीकी प्रतिकृति के साथ 3 स्वतंत्र प्रयोगों से प्रत्येक से (बी) मतलब मूल्यों (एन = समूह प्रति 15) दिखाए जाते हैं। त्रुटि सलाखों के मानक विचलन और तारक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण मतभेद (एक तरह से एनोवा, पी <0.05) से संकेत मिलता है प्रतिनिधित्व करते हैं। Steinritz एट अल। (2014) 9 से संशोधित। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Mitochondrial झिल्ली संभावित। ईईसी की चित्रा 3. आकलन क्लोरैम्बुसिल (12.5 माइक्रोग्राम / एमएल) या chloramb से अवगत कराया, नकली इलाज किया गयायूसीआईएल अवगत कराया और पक्षक (15 एनजी / एमएल) का इलाज किया। 24 घंटा प्रदर्शन के बाद, कोशिकाओं imaged तुरंत 15 मिनट के लिए TMRM साथ भरी हुई है और कर रहे थे। (ए) unexposed ईईसी एक अछूता mitochondrial झिल्ली क्षमता का संकेत TMRM लेबलिंग के बाद एक अलग संकेत का पता चला। (बी) क्लोरैम्बुसिल जोखिम TMRM संकेत के एक महत्वपूर्ण कमी के परिणामस्वरूप। आरओएस-मेहतर अल्फा लिनोलेनिक एसिड के साथ क्लोरैम्बुसिल उजागर ईईसी (सी) उपचार mitochondrial झिल्ली क्षमता बहाल। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
जहरीले रसायनों के लिए चमड़े का जोखिम अक्सर गंभीर घाव भरने विकार में यह परिणाम है। अंतर्निहित तंत्र काफी हद तक अनजान हैं। घाव भरने के विभिन्न चरणों (रक्तस्तम्भन, सूजन, प्रसार और remodeling) के होते हैं कि एक जटिल प्रक्रिया है। सेल प्रवास हालांकि, यह दानेदार बनाने का कार्य ऊतक के गठन के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण है, हर चरण में शामिल है। इधर, नए रक्त वाहिकाओं angio- या vasculogenesis द्वारा या तो बनते हैं।
दोनों प्रक्रियाओं अग्रदूत और जल्दी endothelial कोशिकाओं की अप्रभावित प्रवास की आवश्यकता होती है। सेल प्रवास और परेशान सेल प्रवास के लिए अंतर्निहित तंत्र को स्पष्ट करने के आकलन विषैला प्रेरित घाव भरने के विकारों के खिलाफ नयी चिकित्सकीय रणनीति विकसित करने के लिए प्रासंगिक है।
सेल प्रवास अलग अलग दृष्टिकोण से मूल्यांकन किया जा सकता है। आमतौर पर इस्तेमाल किया तकनीक मूल रूप से एंटीबॉडी antig का विश्लेषण करने के लिए शुरू की गई थी जो Boyden कक्ष परख हैएन ल्यूकोसाइट्स 13 पर कीमोटैक्सिस का कारण बना। यह परख एक chemoattractant के जवाब में कम डिब्बे में एक transwell डालने के ऊपरी डिब्बे से कोशिकाओं के आक्रमण क्षमता को दर्शाता है कि एक मात्रात्मक समापन बिंदु परख है। इस के साथ साथ वर्णित तकनीक में, कोई chemoattractant निचले सदन को जोड़ा गया है। नियंत्रण शर्त के तहत या क्लोरैम्बुसिल के जवाब में ईईसी की इस प्रकार chemokinesis (एक विशिष्ट chemoattractant बिना यादृच्छिक माइग्रेशन) जांच की गई।
डालने झिल्ली के छिद्रों के माध्यम से तीन आयामी सेल प्रवास की अनुमति देता है कि एक झरझरा झिल्ली के होते हैं। सभी कोशिकाओं की unhampered गुजर अनुमति देगा बहुत बड़ी हैं pores जो पूरी तरह से सेल प्रवास को रोकने जाएगा बहुत छोटे हैं pores जो: झिल्ली के ध्यान में लीन होना आकार सेल आकार के संबंध में चुना जाना है। जल्दी endothelial कोशिकाओं के लिए, 8 माइक्रोन का एक छेद के आकार की सिफारिश की है। एक अनुचित छेद के आकार का उपयोग irreproducible परिणामों में परिणाम होगा। Orde मेंआर, हम नाभिक से बड़ा छेद के आकार के साथ शुरू करने की सिफारिश ईईसी के रूप में विभिन्न गुणों के साथ कोशिकाओं के लिए प्रोटोकॉल के अनुकूल है और यदि आवश्यक हो तो ध्यान में लीन होना आकार कदम-दर-कदम बढ़ाने के लिए। उदाहरण के लिए, ल्यूकोसाइट्स की तरह छोटे कोशिकाओं के लिए 3 माइक्रोन का एक छेद के आकार की सिफारिश की है।
एक महत्वपूर्ण मुद्दा विश्लेषण तक ऊष्मायन समय के दृढ़ संकल्प है। समय के साथ, (कम से कम नियंत्रण समूहों में) सेल प्रसार जगह ले जाएगा। यह बदले में संभावित रूप से विधि की संवेदनशीलता को कम करने, झिल्ली के माध्यम से प्रवेश कर सकते हैं कि कोशिकाओं की संख्या बढ़ाना होगा: यहां तक कि थोड़ा बिगड़ा प्रवासी क्षमताओं के साथ, कोशिकाओं समय की लंबी अवधि में विस्थापित करने में सक्षम हो सकता है। इसलिए, लंबी अवधि (जैसे 24 घंटा) endothelial कोशिकाओं के लिए सिफारिश नहीं कर रहे हैं। ऊष्मायन सेल बोने के बाद बहुत छोटा है अगर दूसरी ओर, केवल कोशिकाओं के मामूली मात्रा झिल्ली पारित किया जाएगा। एक 8 घंटे ऊष्मायन इष्टतम पाया गया था। 8 घण्टे की परिभाषित ऊष्मायन समय के बाद, कोशिकाओं को एकफिर से तय हो, दाग और मैन्युअल गिनी।
(माइग्रेट नहीं है कि) झिल्ली के शीर्ष पर (1) प्रकोष्ठों एक झाड़ू से हटा रहे हैं: विश्लेषण के लिए तीन संभावित दृष्टिकोण हैं। तब झिल्ली (माइग्रेट कोशिकाओं) के नीचे की ओर कोशिकाओं दाग रहे हैं या तो एक कोशिकाविज्ञान (जैसे, hematoxylin) या एक फ्लोरोसेंट रंजक (उदाहरण के लिए, DAPI) और साथ में गिने जाते हैं। (2) वैकल्पिक रूप से, नीचे की ओर कोशिकाओं पहले एक फ्लोरोसेंट डाई के साथ दाग जा सकता है और (उदाहरण के लिए, trypsin के उपयोग के द्वारा) बाद में अलग कर रहे हैं। प्रतिदीप्ति तो एक प्रतिदीप्ति पाठक के उपयोग के द्वारा मात्रा निर्धारित है। (3) हम इस तरह गैर-माइग्रेट कोशिकाओं (कोशिकाओं झिल्ली के शीर्ष पर) और माइग्रेट कोशिकाओं (झिल्ली के तल पर) के भेदभाव की अनुमति के प्रकाश संचरण ब्लॉक कि काले रंग का झरझरा झिल्ली का उपयोग करना चाहिये। नीचे की ओर कोशिकाओं को एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का उपयोग गिने जाते हैं प्रतिदीप्ति धुंधला के बाद (कोशिकाविज्ञान रंगों का इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है)। यह ग के लिए महत्वपूर्ण नहीं हैझिल्ली अभिविन्यास onfound। एक अपारदर्शी झिल्ली का प्रयोग गैर-माइग्रेट कोशिकाओं को दूर करने की जरूरत है अनावश्यक। अपारदर्शी झिल्ली, फ्लोरोसेंट धुंधला और मैनुअल सेल गिनती के उपयोग के लिए अन्य तरीकों से बेहतर बाहर कर दिया गया।
सामान्य में, Boyden कक्ष परख संभाल करने के लिए आसान है कि एक परख है और इस तरह यह सेल प्रवास के आकलन के लिए एक बार उपयोग किया परख है। (1) Boyden कक्ष परख के समापन बिंदु परख है: हालांकि, दो प्रमुख नुकसान कर रहे हैं। विश्लेषण के समय बिंदु गलत है अगर इसका मतलब है कि, परिणाम को गुमराह किया जा सकता है। (2) परख स्वचालित करने के लिए आसान नहीं है। फिर भी, इस परख सेल प्रवास के आकलन के लिए सबसे अधिक मूल्यवान उपकरणों में से एक है।
स्थिर Boyden कक्ष परख के विपरीत, परख घाव भरने (भी अंतर को बंद करने की परख या खरोंच परख के रूप में करने के लिए कहा गया है) वास्तविक समय में एक गतिशील परख है। यह तीन आयामी सेल आक्रमण आंदोलनों के बिना एक दो आयामी प्रवास परख है। एक विंदुक टिप के साथ सेल परतों के "लोग घायल हो गए" के बाद, कोशिकाओं खाई में आ जाते हैं। परख प्रदर्शन करने के लिए सरल है और एक स्थिर समापन बिंदु परख की समस्याओं से बचा जाता है। (1) एक जीवित कोशिका इमेजिंग सूक्ष्म प्रणाली (37 डिग्री सेल्सियस, humidified माहौल के साथ 5% सीओ 2) की आवश्यकता है: हालांकि, परख कुछ चुनौतियों का सामना किया। सेल संस्कृति व्यंजन बाहर सूखी नहीं है कि सुनिश्चित करें। (2) समय चूक छवि अधिग्रहण का इस्तेमाल किया मानकों (संकल्प, अंतराल) के आधार पर बड़े डेटा फ़ाइलों में परिणाम होगा। (3) एक विंदुक टिप के साथ सेल परत Scratching यह शुरू में प्रकट हो सकता है के रूप में आसान नहीं है। कलाकृतियों में हो सकता है, जो पकवान सतह को नुकसान होगा ज्यादा दबाव। इसके अलावा, अंतर चौड़ाई खरोंच के भीतर अलग हो सकता है और अलग अलग जांचकर्ताओं के बीच भिन्न हो सकती है। एक अनुभवी अन्वेषक की सिफारिश की है। (4) समानांतर में चला जा सकता है कि नमूनों की संख्या उपकरण द्वारा सीमित है। फिर भी, परख घाव भरने मात्रात्मक और qual के लिए एक और महत्वपूर्ण उपकरण हैसेल प्रवास के itative आकलन। माइग्रेशन वेग, माइग्रेशन की दूरी के बारे में जानकारी, निर्देशित माइग्रेशन एक प्रयोगात्मक सेटअप में इकट्ठा किया जा सकता है। एक दो आयामी प्रणाली में सेल पर नज़र रखने के लिए बहुत मुश्किल नहीं है और खुला स्रोत सॉफ्टवेयर (जैसे, ImageJ और MTrackJ) के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है।
सेल संस्कृति व्यंजन की कोटिंग सेल लगाव के लिए ही महत्वपूर्ण नहीं है, लेकिन प्रवास के संबंध में सेलुलर समारोह पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव है। Endothelial कोशिकाओं नियमित तौर पर 0.1% जिलेटिन लेपित सतहों पर संवर्धित कर रहे हैं। गैर लेपित endothelial सेल की खेती के लिए सामने का प्रयोग कमी आई प्रसार 14 में हुई। अन्य कोटिंग्स (जैसे, फ़ाइब्रोनेक्टिन) लघु अवधि की खेती के लिए भी उपयुक्त नहीं पाया गया है, तथापि, जिलेटिन कोटिंग्स लंबे समय तक खेती के प्रयोगों के 15 में बेहतर प्रदर्शन दिखाया।
लाइव सेल इमेजिंग के लिए बाजार पर कई प्रतिदीप्ति रंजक कर रहे हैं। हम चो हैसेन TMRM mitochondrial झिल्ली क्षमता की जाँच करने के लिए। कई अन्य रंगों (जैसे, जे.सी.-1, TMRE) तुलनीय प्रदर्शन दिखा रहे हैं। एकरंगा जांच (TMRM, TMRE) के विपरीत, माइटोकॉन्ड्रिया में संचय के बाद लाल को हरे रंग से जे.सी.-1 प्रतिदीप्ति पाली। इस 16 (उदाहरण के लिए, पर नजर रखने के रंगों का उपयोग माइटोकॉन्ड्रिया की पहचान करने के लिए) माइटोकॉन्ड्रियल ध्रुवीकरण राज्य के एक ratiometric अर्द्ध मात्रात्मक विश्लेषण की अनुमति देता है, लेकिन दोहरी धुंधला प्रयोगों बाधित। प्रयोगात्मक डिजाइन, सेल से निपटने और अधिग्रहण चुनौती दे रहा है और बहुत अधिक ध्यान देने की आवश्यकता है, जबकि हमारे अनुभव में डाई में ही प्रयोग के लिए कम महत्वपूर्ण है। लगभग सभी फ्लोरोसेंट रंगों प्रकाश के प्रति संवेदनशील हैं। इसलिए, सेल लोड हो रहा है अंधेरे में किया जाना चाहिए। सेल लोड हो रहा 15-30 मिनट की आवश्यकता है। लम्बे समय तक लोडिंग समय में वृद्धि हुई संकेतों में परिणाम नहीं करता है और सिफारिश नहीं है। विशिष्ट संकेतों लंबे लोड हो रहा है समय के बाद पता लगाया जा सकता है, डाई subcellular compart में जमा हो सकता हैबयान या यहां तक कि सेल से छुट्टी हो सकती है। एक परिणाम के रूप में, कोशिकाओं प्रयोग की शुरुआत में विश्लेषण करने से पहले और जरूरी नहीं कि सिर्फ लोड किया जाना चाहिए। डाई लोड हो रहा है एकाग्रता आमतौर पर 10 माइक्रोन की रेंज में है। हालांकि, TMRM साथ बहुत कम सांद्रता (20 एनएम) लेबलिंग के लिए पर्याप्त मिल गया है और अभी भी उचित परिणाम दिया गया। चित्र में दिखाया के रूप में 3 लेबलिंग 24 घंटे बाद क्लोरैम्बुसिल जोखिम mitochondrial झिल्ली क्षमता का एक अलग नुकसान में हुई। आरओएस-मैला ढोने वालों प्रारंभिक प्रदर्शन के बाद 24 घंटे में mitochondrial झिल्ली क्षमता बनाए रखने में सक्षम था के साथ क्लोरैम्बुसिल का उपचार ईईसी अवगत कराया।
सारांश, Boyden कक्ष परख में, गुणात्मक के संबंध में और मात्रात्मक पहलुओं के साथ प्रवास व्यवहार का आकलन करने के लिए एक सेल ट्रैक विश्लेषण के साथ संयोजन में कीमती उपकरण परख रहे हैं चिकित्सा घाव। TMRM साथ माइटोकॉन्ड्रियल संभावित की लेबलिंग अंतर्निहित तंत्र की पहचान करने में मदद कर सकते हैं।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Boyden Chamber | |||
| Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 3 µm | Corning Incorporated | #351151 | |
| Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 8 µm | Life Sciences | #351152 | |
| (for use with Falcon Insert 24 well Companion Plate (353504) | |||
| Wound healing assay | |||
| Glass bottom dishes | Word Precision Instruments, Inc. | #FD35-100 | |
| Assessment of mitochondrial potential | |||
| TMRM (tetramethylrhodamine methyl ester) | Life Technologies | #T669 | |
| Cell culture | |||
| Accutase | PAA, Pasching, Austria | # L11-007 | |
| α-Linolenic acid | Fluka (Sigma), Steinheim, Germany | # L2376 | |
| Chlorambucil | Fluka (Sigma), Steinheim, Germany | # 23125 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany | # G2500-100G |
References
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