Abstract
Udsættelse for kemiske stoffer (herunder alkylerende kemiske kampstoffer som svovl og nitrogensennepper) forårsage en overflod af kliniske symptomer, herunder sårhelingslidelse. Den fysiologiske proces med sårheling er meget kompleks. Dannelsen af granulationsvæv er et vigtigt skridt i denne proces resulterer i en foreløbig sår lukning og give et netværk af nye skibe kapillære blod - enten gennem vaskulogenese (roman dannelse) eller angiogenese (spiring af eksisterende fartøjer). Både vasculo- og angiogenese kræver en funktionel, dirigeret migration af endotelceller. Således undersøgelse af tidlig endotelcelle (EØF) migration er vigtigt at forstå patofysiologien af kemisk påført sårhelende lidelser og potentielt identificere nye strategier for terapeutisk intervention.
Vi vurderede forringet sårheling efter alkylerende middel eksponering og testet potentielle kandidatlande forbindelser til treatment. Vi brugte et sæt af teknikker, der er skitseret i denne protokol. En modificeret Boyden kammer til kvantitativt undersøge kemokinese af EØF beskrives. Desuden er anvendelsen af den sårhelende assayet i kombination med spor analyse til kvalitativ evaluering migration illustreret. Endelig har vi demonstrere brugen af det fluorescerende farvestof TMRM for undersøgelse af mitochondriemembranpotential at identificere underliggende mekanismer forstyrret cellemigrering. Følgende protokol beskriver de grundlæggende teknikker, som er blevet tilpasset til undersøgelse af EØF.
Introduction
Cellemigrering er vigtig i mange fysiologiske og patofysiologiske processer, herunder udvikling, forskellige sygdomme og sårheling efter hudbeskadigelse.
Efter hud skade, betændelse fjerner beskadigede eller nekrotisk væv og granulering drev foreløbig sårlukning og tillader dannelse af et netværk af nye kapillærer gennem vaskulogenese (roman dannelse) eller angiogenese (spiring af eksisterende vesikler) 1-3. Både vasculo- og angiogenese kræver migration af endotelceller. Den voksende netværk af blodkar er afgørende for at transportere ilt og næringsstoffer til prolifererende keratinocytter som i sidste ende undergår keratinisering, danne et nyt epitel og give sårlukning.
Nedsat migration af endotelceller er en underliggende årsag til sårhelingslidelse 4,5. Således fremgangsmåder vurdere migration af tidlige endotelceller skal udforske pathophysiolnologi lidelser celle migration og at identificere nye strategier for terapeutisk intervention.
Hudeksponering for alkyleringsmidler (fx svovl og nitrogensennepper) forårsager sårhelingslidelse 6. Sådanne forbindelser blev brugt som kemisk kampstoffer i flere konflikter i det 20. århundrede og forbliver grund til stor bekymring på grund af de eksisterende lagre i politisk ustabile regioner og den relativt simple syntese. Selvom svovl sennep først blev syntetiseret i 1822, er den molekylære og kliniske patologi SM eksponering ikke forstået i detaljer, og ingen modgift mod SM eksponering er blevet identificeret.
Adskillige undersøgelser er blevet gennemført for at forstå og modellere forringet sårheling efter SM eksponering og til at teste for potentielle kandidatlande forbindelser, der kan forbeholde denne virkning. Schmidt et al. (2009) testede virkningen af chlorambucil, et alkylerende forbindelse med egenskaber svarende til SM i mouSE embryoid krop modeller og fundet en dramatisk, til tider mere end 99% reduktion i beholder formation 7. Denne negative effekt var mest udtalt på et udviklingstrin, som under fysiologiske betingelser, er domineret af proliferation og migration af vaskulære endotel præcursorceller. Således blev disse celler identificeret til at være særligt følsomme over for alkyleringsmidler. Steinritz et al. (2010) testede skyllevæsker af reaktive oxygen species (ROS), især N-acetylcystein (NAC) og alfa-linolensyre (ALA) for deres evne til at reducere SM toksicitet i mus embryoid body modeller og især til genoprette dannelse beholderen 8. Midlertidige beskyttende virkninger blev observeret, hvilket indikerer, at overdreven ROS-dannelse var sandsynligvis bidrage til de negative virkninger af SM på sårheling. Disse virkninger var ikke permanent, og de to kandidatforbindelser kan ikke være i stand til at genoprette dannelse fartøj og sårheling på lang sigt 8. However, blev disse eksperimenter udført i en kompleks 3D-model, der tillod undersøgelse af celle migration. Således har vi efterfølgende testet NAC og ALA til gavnlige virkninger på celle migration af EØF, der har en central rolle i processen med fartøjets dannelse 9.
Desuden er der tegn på, at cellepolaritet er påkrævet for cellemigrering. Mitokondriel dysfunktion fører til ROS-dannelse blev vist at forringe celle polaritet og kan således påvirke celle migration. Derfor blev levende celler med hensyn til mitokondrisk funktion, der udføres, og virkningerne af ROS skyllevæsker blev undersøgt. Følgende protokol beskriver generelle krav til dyrkning af EØF Boyden kammer analysen, at sårheling analysen herunder celle sporing analyse og brug af TMRM til vurdering af mitokondriefunktion i detaljer. Vigtige aspekter af forsøgsprotokoller for EØF dyrkning og migration er fremhævet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følgende protokol beskriver teknikker til undersøgelse af tidlige endothelcellemigration. Den korrekte dyrkning af vaskulære endotelceller kræver præ-coating af celle kultur flasker med gelatine for at sikre korrekt proliferation og vedligeholdelse af et endothelial fænotype.
1. Pre-coating af celledyrkningskolber
- Opløs gelatine i 0,1 M PBS til en slutkoncentration på 0,1%.
- Autoklaver løsningen med parametre for flydende autoklavering (se nærmere instruktioner i den specifikke autoklave).
- Tilføj tilstrækkeligt volumen af autoklaveret gelatine opløsningen til en steril cellekultur kolbe (f.eks, mindst 5 ml til en T25 cellekultur-kolbe).
- Overfør kolberne i en inkubator (37 ° C, 5% CO2 ikke påkrævet, men ikke forstyrrer) i mindst 30 min.
- Fjern den resterende gelatineopløsning. (Dyrkning se celle) Brug de forud coatede kolber senere eller store under sterile forhold indtil brug.
2. Cell Dyrkning fra tidlige endotelceller
Bemærk: embryonale stamceller afledt tidlige endotelceller (EØF) blev opnået fra differentierede murine embryoide ved magnetisk cellesortering af PECAM-1-fraktionen positive celle som beskrevet tidligere 10,11.
- Kultur EØF om gelatineovertrukne cellekulturskåle i DMEM suppleret med 15% FCS, 50 U / ml penicillin, 50 U / ml streptomycin, 200 uM L-glutamin, 100 uM ß-mercaptoethanol og 1% ikke-essentielle aminosyrer. Håndtag celler under sterile betingelser. Dyrk cellerne med 5% CO2 ved 37 ° C og 95% fugtighed, indtil sub-konfluens (max. 80%).
- Ved sub-konfluens, opdeles cellerne i en 1: 5-forhold. Bemærk: Detachment af endotelceller er et kritisk trin.
- Høst cellerne med RT Accutase. Fjern medierne, skylles med PBS og tilsæt 1 ml Accutase pr 25 cm
- Inkuber kolben ved stuetemperatur i 2-10 min, indtil cellerne er fritliggende. Dispergere cellerne og overføre dem til den ønskede anvendelse. Bemærk: En kemisk neutralisation af Accutase er ikke påkrævet, da den finder sted, når de podede celler opbevares i inkubatoren ved 37 ° C. Imidlertid kan Accutase aktivitet også reduceres ved tilsætning af DMEM indeholdende FCS.
- Høst cellerne med RT Accutase. Fjern medierne, skylles med PBS og tilsæt 1 ml Accutase pr 25 cm
3. Boyden Chamber
Bemærk: Boyden kammer assays udføres ved hjælp af lys-uigennemsigtige polyethylenterephthalat insert systemer med 8 um porestørrelse.
- Pre-coate filterindsatse (der passer inde cellekultur brønde således at der skabes et Boyden kammer) ved tilsætning af 500 pi 0,1% gelatine opløst i 0,1 M PBS i mindst 30 min.
- Hvis celler skal udsættes for giftige kemikalier, udsætte henhold til den specifikke eksperimentelle design, før cellehøst. Bemærk: Celler blev udsat for 12,5 ug chlorambucil / ml DMEMi 24 timer. Med hensyn til den konkrete eksperimentelle design, kan vejledningen variere.
- Harvest EØF og bestemme celle nummer ved hjælp af en optælling celle kammer. Bemærk: Automatisk optælling enheder kan bruges, men bør anvendes med forsigtighed: manuel celletælling er mere præcis, og kan varmt anbefales.
- Tilsæt 500 pi cellekulturmedium ind i det nedre kammer rum af Boyden Chamber.
- Tilføj præcis 10 4 EØF i 500 pi cellekulturmedium per filterindsats i det øvre kammer rum. Eliminer bobler.
- Inkubér filterindsatse i inkubatoren i præcis 8 timer.
- Skyl med PBS gang og erstatte mediet med 0,5 ml 4% paraformaldehyd i begge rum i 25 min for celle fiksering. Vask filteret ekstensivt men mindst 3 gange med 0,1 M PBS.
- Udskære membraner med en skalpel.
- Monter membranen mellem to dækglas med montering medium, der indeholder DAPI for nuklear staining. Vær opmærksom på orientering. Sikre, at kun celler, der er migreret hen imod det nedre kammer af membranen tælles.
- Tæl celler, der er migreret hen imod det nedre kammer af membranen med et fluorescens-mikroskop ved 400X forstørrelse. Du må ikke forveksle membran porer med migrerede celler (figur 1A, 1B). Undersøg et rimeligt antal biologiske gentagelser (mindst 3 biologiske replikater pr betingelse).
4. Sår Healing Assay
- Afhængigt af det udstyr, der findes, omhyggeligt vælge de cellekultur retter eller plader: Ved brug af DIC mikroskopi, undgå plastic overflade baseret kultur retter eller brønde, men bruger glas baserede enheder i stedet.
Bemærk: Hvis du bruger fase-kontrast mikroskopi, kan også bruges plast baserede retter. - Dyrk EØF i en egnet cellekultur-enhed (f.eks 4 cm glasbund petriskål egnet til levende celler) Indtil 80% konfluens. Vigtigt: ikke dyrke cellerne til at fuldføre sammenløb.
- Ridse monolag med sterile 10 pi pipettespidser. Skub spidsen forsigtigt uden for meget tryk på skålen overflade og bevæge det i en lige linje jævnt fra den ene side til den other.Wash cellerne to gange med 0,1 M PBS for at fjerne løsnede celler.
- Tilføj et tilstrækkeligt volumen af medium til dyrkningsskålen. Hvis det er relevant, tilføjer forbindelser, der bør undersøges.
Bemærk: 1,5 ml medium indeholdende 15 ng / ml a-linolensyre blev tilsat. - Montere dyrkningsskålen under et mikroskop i stand til levende celler. Sikre 5% CO2, 37 ° C og en fugtig atmosfære.
Bemærk: Befugtning er især vigtigt at undgå medium fordampning. - Anskaf time-lapse billeder over 24 timer ved 10 min intervaller. Plan for store filstørrelser. Bemærk: En opløsning på 512 x 512 pixels er normalt tilstrækkeligt; dog anbefaler vi at bruge billeder af mindst 1.024 x 1,024..
- Mål afstanden bredde ved t = 0 timer og ved t = 24 timer ved hjælp af længden værktøj af software, der leveres med mikroskopet eller bruge open-source software (f.eks ImageJ). Bemærk: Generelt specifik indsamling og analyse billede software leveres af producenten. Derfor, for tekniske detaljer vedrørende brugen af softwaren, henvises til manualen.
5. Cell Tracking
- Afhængigt af det udstyr, der findes, omhyggeligt vælge de cellekultur retter eller plader: Ved brug af DIC mikroskopi, undgå plastic overflade baseret kultur retter eller brønde, men bruger glas baserede enheder i stedet.
Bemærk: Hvis du bruger fase-kontrast mikroskopi, kan også bruges plast baserede retter. - Seed 5 x 10 4 EØF suppleret DMEM i en egnet cellekultur enhed (f.eks, 24-flerbrøndspladen) og dyrke cellerne med 5% CO2 ved 37 ° C og 95% fugtighed i 1-2 dage.
- Når celler er vokset op til en 80% Sammenløb, fjerne medier og kultur cellerne med nye medier i overværelse af de respektive teststoffer (fx 12,5 mg chlorambucil / ml DMEM). Altid omfatte kontrolceller (behandlet med opløsningsmidlet, f.eks ethanol) ved 37 ° C i et bestemt tidsrum (24 timer, afhængigt af den enkelte assaysystem).
- Montere dyrkningsskålen under et mikroskop i stand til levende celler (37 ° C, 5% CO2 og 95% fugtighed). Anskaf time-lapse billeder over 24 timer ved foruddefinerede intervaller. Anskaf billeder på 10 min intervaller.
- Udfør manuel sporing af EØF ved brug af ImageJ plugin MTrackJ. Vælg 10 celler tilfældigt fra synsfeltet og spore deres bevægelser ved at tilføje et datapunkt pr tidspunkt ved hjælp af "Tilføj" kommando MTrackJ.
Bemærk: MTrackJ er tilgængelig gratis på og ImageJ rådighed i [Meijering, Mtrackj "http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/".]le på [Rasband, ImageJ. "http://rsbweb.nih.gov/ij/"]. En detaljeret manual om MTrackJ plugin findes på "http://www.imagescience.org".
6. Levende Cell Imaging / Vurdering af mitokondrie Membrane Potentielle
- Dyrk EØF i en indretning egnet cellekultur (f.eks, 4 cm glasbund petriskål egnet til levende celler) op til en 80% konfluens.
Vigtigt: Du må ikke dyrke cellerne til at fuldføre sammenløb. - Hvis det er relevant, udsættes cellerne for kemikalier. Note: Celler blev eksponeret for 12,5 pg / ml chlorambucil i 24 timer. Med hensyn til den konkrete eksperimentelle design, kan vejledningen variere.
- Forbered en 10 mM stamopløsning af tetramethylrhodamin (TMRM) i DMSO. Beskyt mod lys. Bemærk: Stamopløsningen kan opbevares ved -20 ° C.
- (: 1.000 fortynding 1) stamopløsningen i cellekultur medium til en arbejdsgruppe løsning med en koncentration på 10 uM Fortynd. Beskyt mod lysog bruge så hurtigt som muligt. Bemærk: Arbejdsgruppen løsning kan opbevares ved stuetemperatur i nogen tid (> 1 time), men udarbejdelse af en frisk arbejdsgruppe løsning anbefales.
- Tilsæt 2 pi af arbejderklassen løsningen på 1 ml frisk cellekulturmedium (lastning opløsning).
- Indlæse cellerne ved at erstatte cellekulturmediet med lastning opløsning. Der inkuberes i 15 minutter ved 37 ° C, 5% CO2 og befugtet atmosfære (inkubator). Forsigtig: Næsten alle fluorescens indikatorer eksporteres af levende celler over tid; derfor undgå langvarig belastning eller forsinket analyse.
- Uden vask, placere fadet under et mikroskop egnet til levende celler. Vigtigt: fluorescens indikatorer er meget følsomme over for lys, derfor undgå unødig udsættelse for lys.
- Anskaf billeder uden at ændre erhvervelse parametre for at sikre sammenlignelighed mellem de forskellige billeder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hudeksponering for alkyleringsmidler provokerer erytem, blæredannelse og dermal ulceration, der er forbundet med en sårhelingslidelse. Sårheling kræver angio- og vaskulogenese som er baseret på migration af endotelceller. Kvantitativ migration kan vurderes ved anvendelse af Boyden kammer assay. Som vist i figur 1C eksponering af EØF alkyleringsmidlet chlorambucil resulterede i et signifikant fald i cellemigrering 9. Tilsætning af ROS-scavenger alpha linolensyre (ALA) direkte efter udsættelse for chlorambucil i 24 timer signifikant reddet denne fænotype, næsten til kontrolniveauer.
Boyden kammer assayet er et passende værktøj til vurdering af antallet (mængde) af migrerede celler. Men analysen ikke give oplysninger om opførslen af cellernes migration. Figur 2 viser, at eksponerede EØF er i stand til at lukke hullet i såret og helbredelse røvay inden 24 timer 9. I modsætning hertil EØF udsat for alkyleringsmidlet chlorambucil var ude af stand til at lukke hullet i sårheling assay 9. Endvidere celle sporing af enkelt EØF afslørede, at under indflydelse af chlorambucil styret bevægelse ikke blev observeret 9. Behandling af EØF ROS-skraldemanden var i stand til at genoprette rettet cellemigration 9.
Mitokondrie ROS-dannelse har været forbundet med forringelse af cellemigration 12. Som vist i figur 3 eksponering af EØF til chlorambucil resulterede i fordelingen af mitokondrielle membran potentiale 9. Behandling af EØF ROS-scavenger forhindrede skade på mitokondrier og vedligeholdt den mitokondrielle membranpotentiale.
Sammenfattende alle metoderne beskrevet i protokollen afsnit, er egnede redskaber til at vurdere cellemigrering. Resultater om tab eller bevarelse af mitokondriemembranen potentiale kan give valuable hints om de underliggende molekylære mekanismer i forringet celle migration.
Figur 1. Boyden kammer assay. (A) EØF blev podet på Boyden kammer filterindsatse, inkuberet i 8 timer, fikseret og farvet med DAPI. Stjerner angiver migreret EØF. I det præsenterede billede kan tælles i alt 19 celler (Figur 1B). Røde pilehoveder angiver celler, der ikke har migreret hen over indsatsen fuldstændigt eller som ikke fuldstændigt i synsfeltet og blev således udelukket fra celletælling. (B) Porerne (8 pm) i membranen bliver synlige, når du bruger lange eksponeringstider for billedoptagelse. Må ikke forveksle dem med migrerede celler. (C) Under kontrolbetingelser et gennemsnit på 212 celler migrerede gennem membranen. Chlorambucil eksponering resulterede i kun 128 migrerede celler. Behandling af chlorambucil-eksponerede EØF med ROS-scavenger alpha linolensyre (ALA) signifikant reddet celle migration. Symboler repræsenterer individuelle resultater fra en filterindsats. Sorte vandrette streger indikerer middel (n = 4), fejlsøjler indikerer SD og stjerner angiver signifikante forskelle. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. sårheling assay / celle sporing. EØF var sham-behandlede (udveksling af medium) eller udsættes for 12,5 pg / ml chlorambucil. Efter ridser, celler were undersøgt i 24 timer. (A) EØF var i stand til at lukke hullet i sårheling analysen inden 24 timer, mens chlorambucil udsat EØF ikke var i stand til at lukke hullet. Behandling med ALA resulterede i en signifikant forbedring af cellemigrering. (B) Middelværdier fra 3 uafhængige forsøg med hver 5 tekniske replikater pr gruppe (n = 15 pr gruppe) er vist. Fejlsøjler repræsenterer standardafvigelser og stjerner angiver statistisk signifikante forskelle (One-way ANOVA, p <0,05). Modificeret fra Steinritz et al. (2014) 9. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Vurdering af mitokondriemembranen potentiale. EØF var sham-behandlede, udsat for chlorambucil (12,5 pg / ml) eller chlorambUCIL eksponerede og ALA (15 ng / ml) behandlet. 24 timer efter eksponering blev celler fyldt med TMRM i 15 minutter og straks afbildes. (A) ikke eksponerede EØF afslørede en tydelig signal efter TMRM mærkning indikerer en usvækket mitokondrielle membranpotentiale. (B) Chlorambucil eksponering resulterede i et signifikant fald i TMRM signalet. (C) Behandling af chlorambucil-eksponerede EØF med ROS-scavenger alpha linolensyre genoprettede mitokondrielle membranpotentiale. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dermal eksponering for giftige kemikalier ofte resulterer i alvorlige sårheling lidelse. De underliggende mekanismer er stort set ukendte. Sårheling er en kompleks proces, som består af forskellige faser (hæmostase, inflammation, proliferation og remodeling). Cellemigrering er involveret i hver fase, men det er af største betydning for dannelsen af granulationsvæv. Her bliver nye blodkar dannes enten af angio- eller vaskulogenese.
Begge processer kræver upåvirket migration af forstadie og tidlige endotelceller. Vurdering af celle migration og afklaring af de underliggende mekanismer for forstyrret celle migration er yderst relevant for at udvikle nye terapeutiske strategier mod giftstof induceret sårheling lidelser.
Cellemigration kan vurderes ved forskellige fremgangsmåder. En almindeligt anvendt teknik er Boyden kammer assay, der oprindeligt blev indført for at analysere antistof-antigOr forårsagede kemotaxi på leukocytter 13. Dette assay er et kvantitativt assay endpoint som afspejler invasion kapacitet af celler fra det øvre rum af en transwell insert til det nedre rum som reaktion på en kemoattraktant. I den her beskrevne teknik blev der ikke chemoattractant tilsat til det nederste kammer. Således kemokinese (tilfældig migration uden en specifik kemoattraktant) i EØF under kontrol tilstand eller som reaktion på chlorambucil blev undersøgt.
Indsatsen består af en porøs membran, der tillader tredimensionel cellevandring gennem porerne i membranen. Porestørrelsen af membranen skal vælges i forhold til cellestørrelsen: porer, som er for små vil forhindre cellemigration fuldstændigt, porer, som er for store, vil tillade uhindret passage af alle celler. For tidlige endotelceller, er en porestørrelse på 8 um anbefales. Anvendelsen af en uhensigtsmæssig porestørrelse vil medføre reproducerbare resultater. I order at tilpasse protokollen til celler med forskellige egenskaber som EØF, anbefaler vi at starte med en porestørrelse større end kerner og øge porestørrelse trin-for-trin, hvis det er nødvendigt. For eksempel til små celler leukocytter anbefales en porestørrelse på 3 um.
Et kritisk spørgsmål er bestemmelsen af inkubationstiden indtil analyse. Over tid vil celleproliferation (mindst i kontrolgrupperne) finde sted. Dette vil igen amplificere antallet af celler, der kan trænge gennem membranen, hvilket potentielt reducerer følsomheden af metoden: selv med minimalt nedsat migrerende evner kan celler kunne migrere over lange perioder. Derfor er lange perioder (f.eks 24 timers) anbefales ikke til endotelceller. På den anden side, hvis inkubationen er for kort efter cellepodning, kun mindre mængder af celler vil have passeret membranen. En 8 timers inkubation blev fundet optimal. Efter den definerede inkubationstid på 8 timer, celler are fast, farves og manuelt optalt.
Der er tre forskellige metoder for analyse: (1) celler på toppen af membranen (som ikke migreret) fjernes med en pensel. Derefter cellerne på undersiden af membranen (migrerede celler) farves enten med en cytologisk (f.eks hæmatoxylin) eller et fluorescerende farvestof (fx DAPI) og tælles. (2) Alternativt kan celler på undersiden farves med et fluorescerende farvestof først og er fritliggende bagefter (fx ved anvendelse af trypsin). Fluorescens kvantificeres derefter ved anvendelse af en fluorescens-læser. (3) Det anbefales at bruge mørkfarvede porøse membraner, der blokerer lystransmission for derved at tillade differentiering af ikke-migrerede celler (celler oven på membranen) og migrerede celler (i bunden af membranen). Efter fluorescens-farvning (cytologiske farvestoffer kan ikke anvendes) celler på undersiden tælles under anvendelse af et fluorescensmikroskop. Det er vigtigt ikke at confound membranen orientering. Ved anvendelse af en uigennemsigtig membran undgår behovet for at fjerne ikke-migrerede celler. Brugen af uigennemsigtige membraner, fluorescerende farvning og manuel celletælling har vist sig overlegen i forhold til andre metoder.
Generelt Boyden kammer assayet er et assay, der er let at håndtere og det er således en ofte anvendt assay til vurdering af cellemigrering. Der er dog to store ulemper: (1) Boyden kammer assayet er et endepunkt-assay. Det betyder, at hvis tidspunkt for analyse er forkert, kan resultatet være misvisende. (2) Assayet er ikke let at automatisere. Alligevel dette assay er et af de mest værdifulde værktøjer til vurdering af cellemigrering.
I modsætning til den statiske Boyden kammer assay sårhelingen assay (også omtalt som udbedring assay eller scratch assay) er en dynamisk assay i realtid. Det er en todimensionel migration assay uden tredimensionelle celleinvasion bevægelser. Efter "sårede" af cellelag med en pipettespids, celler migrerer ind i hullet. Assayet er enkel at udføre og undgår problemerne med en statisk endpoint assay. Men assayet har nogle udfordringer: (1) en levende celler mikroskopisk systemet (37 ° C, 5% CO2 med fugtig atmosfære) er påkrævet. Sørg for, at cellekultur retter ikke tørre ud. (2) Time-lapse billede erhvervelse vil resultere i store datafiler afhængigt af parametre (opløsning, interval), der anvendes. (3) ridses celle lag med en pipette tip er ikke så nemt som det i første omgang kan forekomme. For meget tryk vil beskadige skålen overflade, som kan resultere i artefakter. Endvidere kan afstanden bredde varierer i bunden og kan variere mellem forskellige efterforskere. Anbefales en erfaren efterforsker. (4) Antallet af prøver, der kan køre parallelt er begrænset af udstyret. Ikke desto mindre sårhelende assayet er et andet værdifuldt værktøj til den kvantitative og kvaliitative vurdering af cellemigrering. Oplysninger om migration hastighed, migration afstand, kan dirigeret migration samles i én forsøgsopstillingen. Celle tracking i et todimensionelt system er ikke meget vanskeligt og kan udføres med open source software (f.eks ImageJ og MTrackJ).
Overtrækning af cellekulturskåle er ikke kun vigtig for cellebinding, men har en betydelig indflydelse på cellulær funktion med hensyn til migration. Endotelceller dyrkes rutinemæssigt på 0,1% gelatine-coatede overflader. Anvendelse af ikke-coatede overflade til dyrkning endotelcelle resulterede i nedsat proliferation 14. Andre belægninger (f.eks fibronektin) blev også fundet egnet til dyrkning kortsigtet dog gelatine belægninger viste overlegen ydelse i de lange dyrkningsforsøg 15.
Der er talrige fluorescensfarvestoffer på markedet for levende celler. Vi har chosen TMRM at undersøge mitokondriemembranpotentiale. Mange andre farvestoffer (f.eks JC-1, TMRE) udviser sammenlignelige resultater. I modsætning til monokromatiske sonder (TMRM, TMRE), JC-1 fluorescens skifter fra grøn til rød efter ophobning i mitokondrierne. Dette giver en ratiometrisk semikvantitativ analyse af det mitokondrielle polariseringstilstand men hindrer dobbelt farvende eksperimenter (fx under anvendelse tracker farvestoffer til at identificere mitochondrier) 16. Det er vores erfaring farvestoffet i sig selv er mindre kritisk for eksperimentet mens den eksperimentelle design, håndtering og erhvervelse celle er udfordrende og kræver meget mere opmærksomhed. Næsten alle fluorescerende farvestoffer er lysfølsomme. Derfor bør celle loading ske i mørke. Celle loading kræver 15-30 min. Langvarig indlæsningstiden ikke medfører forøgede signaler og anbefales ikke. Selvom specifikke signaler kunne påvises efter lange loading perioder, kan farvestoffet ophobes i subcellulære Compartmenter eller måske endda blive udledt fra cellen. Som følge heraf bør celler belastes lige før analyse og ikke nødvendigvis ved begyndelsen af eksperimentet. Farvestof loading Koncentrationen den normalt er i området på 10 uM. Men med TMRM meget lavere koncentrationer (20 nM) blev fundet tilstrækkelig til mærkning og stadig gav rimelige resultater. Som vist i figur 3 mærkning 24 timer efter chlorambucil eksponering resulterede i et distinkt tab af mitokondriemembranpotentiale. Behandling af chlorambucil udsatte EØF med ROS-skraldemanden var i stand til at opretholde mitokondrielle membranpotentiale ved 24 timer efter den første eksponering.
Sammenfattende Boyden kammer assay, sårheling assay i kombination med enkelt celle track analyse værdifulde værktøjer til at vurdere migration adfærd med hensyn til kvalitative og kvantitative aspekter. Mærkning af mitokondrie potentiale med TMRM kan hjælpe med at identificere underliggende mekanismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Boyden Chamber | |||
| Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 3 µm | Corning Incorporated | #351151 | |
| Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 8 µm | Life Sciences | #351152 | |
| (for use with Falcon Insert 24 well Companion Plate (353504) | |||
| Wound healing assay | |||
| Glass bottom dishes | Word Precision Instruments, Inc. | #FD35-100 | |
| Assessment of mitochondrial potential | |||
| TMRM (tetramethylrhodamine methyl ester) | Life Technologies | #T669 | |
| Cell culture | |||
| Accutase | PAA, Pasching, Austria | # L11-007 | |
| α-Linolenic acid | Fluka (Sigma), Steinheim, Germany | # L2376 | |
| Chlorambucil | Fluka (Sigma), Steinheim, Germany | # 23125 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany | # G2500-100G |
References
- Bauer, S. M., Bauer, R. J., Velazquez, O. C. Angiogenesis, vasculogenesis, and induction of healing in chronic wounds. Vascular and Endovascular Surgery. 39, 293-306 (2005).
- Reinke, J. M., Sorg, H.
- Hart, J. Inflammation. 1: Its role in the healing of acute wounds. Journal of Wound Care. 11, 205-209 (2002).
- Liu, Z. J., Hyperoxia Velazquez, O. C. endothelial progenitor cell mobilization, and diabetic wound healing. Antioxidants & Redox Signaling. 10, 1869-1882 (2008).
- Gallagher, K. A., Goldstein, L. J., Thom, S. R., Velazquez, O. C. Hyperbaric oxygen and bone marrow-derived endothelial progenitor cells in diabetic wound healing. Vascular. 14, 328-337 (2006).
- Kehe, K., Balszuweit, F., Steinritz, D., Thiermann, H. Molecular toxicology of sulfur mustard-induced cutaneous inflammation and blistering. Toxicology. 263, 12-19 (2009).
- Schmidt, A., et al. Nitrogen mustard (Chlorambucil) has a negative influence on early vascular development. Toxicology. 263, 32-40 (2009).
- Steinritz, D., et al. Effect of N-acetyl cysteine and alpha-linolenic acid on sulfur mustard caused impairment of in vitro endothelial tube formation. Toxicological Sciences. 118, 521-529 (2010).
- Steinritz, D., et al. Chlorambucil (nitrogen mustard) induced impairment of early vascular endothelial cell migration - Effects of alpha-linolenic acid and N-acetylcysteine. Chemico-biological Interactions. 219C, 143-150 (2014).
- Schmidt, A., et al. Influence of endostatin on embryonic vasculo- and angiogenesis. Developmental Dynamics : an Official Publication of the American Association of Anatomists. 230, 468-480 (2004).
- Dainiak, M. B., Kumar, A., Galaev, I. Y., Mattiasson, B.
- Wang, Y., et al. Regulation of VEGF-induced endothelial cell migration by mitochondrial reactive oxygen species. American Journal of Physiology. Cell physiology. 301, C695-C704 (2011).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
- Relou, I. A., Damen, C. A., van der Schaft, D. W., Groenewegen, G., Griffioen, A. W. Effect of culture conditions on endothelial cell growth and responsiveness. Tissue & Cell. 30, 525-530 (1998).
- Smeets, E. F., von Asmuth, E. J., vander Linden, C. J., Leeuwenberg, J. F., Buurman, W. A. A comparison of substrates for human umbilical vein endothelial cell culture. Biotechnic & Histochemistry : Official Publication of the Biological Stain Commission. 67, 241-250 (1992).
- Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. BioTechniques. 50, 98-115 (2011).
