Abstract
חשיפה לחומרים כימיים (כוללים חומרי לחימה כימית אלקילציה כמו חרדל גופרית וחנקן) לגרום לשפע של תסמינים קליניים כוללים הפרעת ריפוי פצע. התהליך הפיזיולוגי של ריפוי פצע הוא מורכב ביותר. ההיווצרות של רקמת פרור היא צעד מפתח בתהליך זה וכתוצאה מכך סגירת פצעים ראשונית ומתן רשת של כלי דם נימים חדשים - בין אם באמצעות vasculogenesis (היווצרות רומן) או אנגיוגנזה (הנבטה של כלי קיימים). שני vasculo- ואנגיוגנזה דורשת הגירה פונקציונלית, בבימויו של תאי האנדותל. כך, החקירה של הגירה מוקדם תא האנדותל (EEC) חשובה להבין הפתופיזיולוגיה של פצע כימי הנגרם על ריפוי הפרעות ופוטנציאל לזהות אסטרטגיות חדשות להתערבות טיפולית.
חוקרים הערכנו ריפוי פצע לקוי לאחר אלקילציה חשיפת סוכן ונבדקו תרכובות מועמד פוטנציאליות לTReatment. אנחנו השתמשנו בסט של טכניקות שתוארו בפרוטוקול זה. קאמרי בוידן שונה כדי לחקור כמותית chemokinesis של השוק האירופי המשותף מתואר. יתר על כן, השימוש בריפוי הפצע assay בשילוב עם ניתוח מסלול להעריך הגירה איכותית בא לידי ביטוי. לבסוף, אנחנו מדגימים את השימוש בTMRM הצבע פלואורסצנטי לחקירת פוטנציאל קרום המיטוכונדריה לזהות מנגנונים של נדידת תאים מופרעת. הפרוטוקול הבא מתאר טכניקות בסיסיות שהותאמו לחקירת EEC.
Introduction
נדידת תאים היא חשובה בתהליכים פיסיולוגיים רבים וpathophysiological כוללים פיתוח, מחלות שונות, וריפוי פצעים לאחר פציעת עור.
בעקבות פציעת עור, דלקת מסירה כונני רקמה ופרור פגומים או נמקי סגירת פצע ראשונית ומאפשרת היווצרות של רשת של נימי דם חדשים באמצעות vasculogenesis (היווצרות רומן) או אנגיוגנזה (הנבטה של שלפוחית הקיימת) 1-3. שני vasculo- ואנגיוגנזה דורשת הגירה של תאי האנדותל. הרשת הולכת והגדלה של כלי דם חיונית להובלת חמצן וחומרים מזינים למתרבה קרטינוציטים שסופו של דבר לעבור קרטיניזציה, יוצר האפיתל חדש ולספק סגירת פצע.
הגירה לקויה של תאי האנדותל היא סיבה בסיסית של ריפוי פצע הפרעת 4,5. הגירה כך, שיטות להערכה של תאי האנדותל מוקדמים נדרשות לחקור את pathophysiology של הפרעות נדידת תאים ולזהות אסטרטגיות חדשות להתערבות טיפולית.
חשיפת עור לסוכני אלקילציה (למשל, גופרית וחנקן חרדל) גורמת ריפוי פצע הפרעה 6. תרכובות כאלה היו בשימוש כחומרי לחימה כימית במספר עימותים במאה ה -20 ולהישאר סיבה לדאגה חזקה בשל מאגרים קיימים באזורים לא יציבים מבחינה פוליטית וסינתזה פשוטה יחסית. למרות שגז החרדל היה מסונתז ראשון בשנת 1822, פתולוגיה המולקולרית והקלינית של חשיפת SM אינה מובנת בפירוט ולא תרופה לחשיפת SM זוהתה.
מספר מחקרים שנערכו להבין ומודל ריפוי פצע לקוי לאחר חשיפת SM ולבדוק לתרכובות מועמד פוטנציאליות מסוגלים להזמין השפעה ש. שמידט ואח '. (2009) בדק את ההשפעה של כלוראמבוציל, מתחם אלקילציה עם מאפיינים דומים לSM בmouדגמי SE גוף embryoid ומצא לפעמים ירידה בהיווצרות כלי 7 דרמטית, יותר מ 99%. השפעה שלילית זו בולטת ביותר בשלב של פיתוח אשר, בתנאים פיסיולוגיים, הוא נשלט על ידי ההתפשטות והנדידה של תאי האנדותל של כלי דם מבשר. כך, תאים אלה זוהו להיות רגישים במיוחד לאלקילציה סוכנים. Steinritz et al. (2010) נבדק אוכלי נבלות של מיני חמצן מגיבים (ROS), ב, N-acetylcysteine מסוים (NAC) וחומצת אלפא לינולנית (ALA) ביכולתם להפחית את רעילות SM במודלי גוף עכבר embryoid ובפרט, ל לשחזר היווצרות כלי 8. השפעות מגנות זמניות נצפו, מצביעה על כך שהיווצרות ROS מוגזמת עשוי לתרום להשפעות השליליות של SM בריפוי פצעים. תופעות אלה לא היו קבועות ותרכובות שני המועמד לא יכולות להיות מסוגלים להחזיר היווצרות כלי וריפוי פצע בטווח הארוך 8. However, ניסויים אלה בוצעו במודל 3D מורכב שעשה יאפשר חקירה של נדידת תאים. לפיכך, אנו לאחר מכן נבדקו NAC וALA להשפעות מועילות על נדידת תאים של השוק האירופי המשותף שיש להם תפקיד מפתח בתהליך של היווצרות כלי 9.
יתר על כן, יש ראיות כי קוטביות התא נדרש לנדידת תאים. תפקוד לקוי של המיטוכונדריה המובילה להיווצרות ROS הוצג לפגוע בקוטביות תא ועלול להשפיע לרעה על כך נדידת תאים. לכן, הדמיה תא חי בכל קשור לתפקוד המיטוכונדריה בוצעה ואת ההשפעות של אוכלי נבלות ROS נבדקו. הפרוטוקול הבא מתאר דרישות כלליות לגידול של השוק האירופי המשותף, assay קאמרי בוידן, ריפוי הפצע assay כולל ניתוח מעקב תא והשימוש בTMRM להערכה של תפקוד המיטוכונדריה בפירוט. היבטים חשובים של פרוטוקולי ניסוי לגידול וההגירה EEC מודגשים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הפרוטוקול הבא מתאר טכניקות לחקירה של נדידת תאי אנדותל המוקדמת. הטיפוח הנכון של תאי האנדותל של כלי דם דורש מראש ציפוי של צלוחיות תרבית תאים עם ג'לטין כדי להבטיח שגשוג ותחזוקה נאותים של פנוטיפ האנדותל.
1. טרום ציפוי של צלוחיות תרבית תאים
- ממיסים ג'לטין ב 0.1 M PBS לריכוז סופי של 0.1%.
- החיטוי הפתרון עם פרמטרים למעוקר נוזלי (לפרטים ראו הוראות של החיטוי הספציפי).
- להוסיף נפח מספיק של פתרון ג'לטין autoclaved לבקבוק תרבות תא סטרילי (למשל, לפחות 5 מיליליטר לבקבוק תרבית תאי T25).
- העבר את צלוחיות לחממה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 אינו נדרש אבל לא מפריע) לפחות 30 דקות.
- הסר את פתרון ג'לטין שנותר. השתמש בצלוחיות מצופים מראש לאחר מכן (ראה טיפוח תא) או שלקרע בתנאים סטריליים עד לשימוש.
2. טיפוח תא של תאי האנדותל מוקדמים
הערה: תאי האנדותל מוקדמים בתאי גזע עובריים נגזרים (EEC) התקבלו מגופי embryoid עכברי מובחנים על ידי מיון תא מופעל מגנטי של שבריר התא החיובי PECAM-1 כמתואר לעיל 10,11.
- תרבות EEC על תרבות מנות תא ג'לטין המצופה DMEM בתוספת 15% FCS, 50 U / פניצילין מיליליטר, 50 U / ml סטרפטומיצין, L-גלוטמין 200 מיקרומטר, SS-mercaptoethanol 100 מיקרומטר ו 1% חומצות אמינו לא חיוניות. לטפל בתאים בתנאים סטריליים. לטפח את התאים עם 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס ולחות של 95% עד תת-מפגש (מקסימום. 80%).
- בתת-מפגש, לפצל את התאים ביחס של 1: 5. הערה: הפלוגה של תאי האנדותל היא שלב קריטי.
- לקצור את התאים עם Accutase RT. הסר את המדיה, לשטוף עם PBS ולהוסיף 1 מיליליטר של Accutase 25 סנטימטר ל
- דגירה הבקבוק ב RT עבור 2-10 דקות, עד שהתאים מנותקים. לפזר את התאים ולהעביר אותם ליישום הרצוי. הערה: נטרול כימי של Accutase אינו נדרש כפי שהוא מתרחש כאשר תאי זרע מאוחסנים בחממה על 37 מעלות צלזיוס. עם זאת, Accutase פעילות יכולה גם להיות ירידה על ידי הוספת DMEM FCS המכיל.
- לקצור את התאים עם Accutase RT. הסר את המדיה, לשטוף עם PBS ולהוסיף 1 מיליליטר של Accutase 25 סנטימטר ל
3. וידן קאמרית
הערה: מבחני קאמריים בוידן מבוצעים על ידי השימוש במערכות הכנס terephthalate פוליאתילן אור-אטומה עם גודל נקבובית 8 מיקרומטר.
- טרום מעיל מוסיף מסנן (נכון שבתוך בארות תרבית תאים ובכך ליצור חדר וידן) על ידי הוספת 500 μl של ג'לטין 0.1% מומס ב0.1 M PBS לפחות 30 דקות.
- אם תאים הם להיחשף לחומרים כימיים רעילים, לחשוף על פי תכנון הניסוי הספציפי לפני קצירת תא. הערה: תאים נחשפו ל12.5 מיקרוגרם כלוראמבוציל / מיליליטר DMEMלמשך 24 שעות. בכל קשור לתכנון הניסוי הספציפי, הוראות עשויות להשתנות.
- קציר EEC ולקבוע את המספר הסלולרי באמצעות תא תא ספירה. הערה: ניתן להשתמש במכשירי ספירה אוטומטיים, אך יש להשתמש בזהירות: ספירת תאים במדריך היא מדויקת יותר ומומלצת מאוד.
- הוסף 500 בינוני תרבית תאי μl לתוך תא התא התחתון של לשכת וידן.
- להוסיף בדיוק 10 4 EEC ב 500 בינוני תרבית תאי μl להוספת מסנן בתא התא העליון. לחסל את הבועות.
- דגירה מוסיף מסנן בחממה במשך 8 שעות בדיוק.
- לשטוף עם PBS אחת ולהחליף בינוניים עם paraformaldehyde 0.5 מיליליטר 4% בשני התאים במשך 25 דקות לקיבוע תא. שטוף את המסנן בהרחבה אבל לפחות 3 פעמים עם 0.1 M PBS.
- בלו הקרומים עם אזמל.
- הר הקרום בין שני תלושי כיסוי זכוכית עם הרכבה בינונית מכילים DAPI לstainin הגרעיניז. שים לב לנטייה. ודא כי תאים רק שהגרו לכיוון צד התא התחתון של הקרום נספרים.
- ספירת תאים שהגרו לכיוון צד התא התחתון של הקרום עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהגדלה 400X. אל תבלבלו את הנקבוביות קרום עם תאים נדדו (איור 1 א, 1 ב '). לחקור מספר סביר של חזרות ביולוגיות (לפחות 3 משכפל ביולוגי למצב).
4. ריפוי פצע Assay
- בהתאם לציוד זמין, לבחור בקפידה את מנות תרבית תאים או צלחות: בעת השימוש במיקרוסקופ דסק"ש, להימנע ממאכלים המבוססת תרבות משטח פלסטיק או צלחות טובות, אבל להשתמש במכשירים מבוססים זכוכית במקום.
הערה: אם באמצעות מיקרוסקופ שלב בניגוד, יכולות לשמש גם צלחות פלסטיק מבוססת. - לטפח EEC במכשיר תרבית תאים מתאים (למשל, צלחת פטרי 4 סנטימטר זכוכית תחתונה מתאים להדמיה תא חי) עד מפגש 80%. חשוב: לא לטפח את התאים כדי להשלים מפגש.
- לגרד את monolayers עם 10 טיפים פיפטה μl סטרילי. דחף את הקצה בעדינות בלי יותר מדי לחץ על פני השטח הצלחת ולהעביר אותו בקו ישר בצורה חלקה מצד אחד לother.Wash התאים פעמיים עם 0.1 M PBS להסיר תאים מנותקים.
- הוספת נפח מספק של מדיום למנה התרבות. במידת צורך, להוסיף תרכובות שיש לחקור.
הערה: 1.5 מיליליטר בינוני מכיל 15 ng / ml אלפא חומצה לינולנית נוסף. - הר צלחת התרבות תחת מיקרוסקופ מסוגל הדמיה תא חי. ודא 5% CO 2, 37 מעלות צלזיוס ואווירת humidified.
הערה: לחות חשוב במיוחד כדי למנוע אידוי בינוני. - לרכוש תמונות זמן לשגות מעל 24 שעות ב 10 דקות במרווחים. תכנית לגדלי קבצים גדולים. הערה: רזולוציה של 512 x 512 פיקסלים היא בדרך כלל מספיק; עם זאת, אנו ממליצים להשתמש בתמונות של לפחות 1,024 x 1,024.
- מדוד את רוחב הפער בזמן t = 0 שעה ובזמן t = 24 שעות באמצעות כלי האורך של התוכנה המסופק עם מיקרוסקופ או להשתמש בתוכנת קוד פתוח (לדוגמא, ImageJ). הערה: בתוכנת רכישת תמונה וניתוח ספציפית כללית מסופק על ידי היצרן. לכן, לפרטים טכניים בנוגע לשימוש בתוכנה, עיינו במדריך.
מעקב 5. סלולארי
- בהתאם לציוד זמין, לבחור בקפידה את מנות תרבית תאים או צלחות: בעת השימוש במיקרוסקופ דסק"ש, להימנע ממאכלים המבוססת תרבות משטח פלסטיק או צלחות טובות, אבל להשתמש במכשירים מבוססים זכוכית במקום.
הערה: אם באמצעות מיקרוסקופ שלב בניגוד, יכולות לשמש גם צלחות פלסטיק מבוססת. - זרע 5 x 10 4 EEC DMEM בתוספת במכשיר תרבית תאים מתאים (למשל, צלחת 24 multiwell) ולטפח את התאים עם 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס ולחות% 95 במשך 1-2 ימים.
- כאשר התאים גדלו עד 80מפגש%, להסיר את המדיה ותרבות התאים עם המדיה חדשה בנוכחות חומרי הבדיקה המתאימות (למשל, 12.5 מיקרוגרם כלוראמבוציל / מיליליטר DMEM). תמיד כוללים תאי שליטה (שטופלו בממס, למשל, אתנול) על 37 מעלות צלזיוס למשך פרק זמן מסוים (24 שעות, בהתאם למערכת assay הבודד).
- הר צלחת התרבות תחת מיקרוסקופ מסוגל הדמיה לחיות תא (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ולחות של 95%). לרכוש תמונות זמן לשגות מעל 24 שעות במרווחים מוגדרים מראש. לרכוש תמונות במרווחים של 10 דקות.
- לבצע באופן ידני מעקב של השוק האירופי המשותף על ידי השימוש בתוסף ImageJ MTrackJ. בחר 10 תאים באופן אקראי משדה הראייה ולעקוב אחר תנועותיהם על ידי הוספת נקודה לכל נקודת נתונים בזמן באמצעות "הוסף" הפקודה של MTrackJ.
הערה: MTrackJ זמין בחינם ובImageJ הוא availab [Meijering, Mtrackj "http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/".]le ב[ Rasband, ImageJ. "http://rsbweb.nih.gov/ij/"]. במדריך מפורט על תוסף MTrackJ זמין ב" http://www.imagescience.org ".
6. הדמיה של תא חי / הערכה של מיטוכונדריאלי ממברנה פוטנציאלי
- לטפח EEC במכשיר תרבית תאים מתאים (למשל, 4 סנטימטר צלחת זכוכית תחתונה פטרי מתאימה להדמיה תא חי) עד מפגש 80%.
חשוב: אל לטפח את התאים כדי להשלים מפגש. - במידת צורך, לחשוף את התאים לכימיקלים. הערה: תאים נחשפו לכלוראמבוציל / מיליליטר 12.5 מיקרוגרם למשך 24 שעות. בכל קשור לתכנון הניסוי הספציפי, הוראות עשויות להשתנות.
- הכן פתרון 10 מ"מ מניות של tetramethylrhodamine (TMRM) בDMSO. להגן מפני אור. הערה: פתרון המניות ניתן לאחסן ב -20 ° C.
- לדלל את פתרון המניות במדיום תרבית תאים לפתרון עובד עם ריכוז של 10 מיקרומטר (1: 1,000 דילול). להגן מפני אורולהשתמש בהקדם האפשרי. הערה: הפתרון עובד יכול להיות כל הזמן בRT לכמה זמן (HR> 1), לעומת זאת, הכנה של פתרון עובד טרי מומלצת מאוד.
- הוסף 2 μl של הפתרון עובד עד 1 מיליליטר בינוני (פתרון טעינה) תרבית תאים טרי.
- טען את התאים על ידי החלפה בינוני תרבית תאים עם פתרון הטעינה. דגירה במשך 15 דקות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ואווירה humidified (חממה). זהירות: כמעט כל האינדיקטורים הקרינה מיוצאים על ידי תאי חיים לאורך זמן; לכן להימנע מהעמסה ממושכת או ניתוח מתעכב.
- ללא שטיפה, מניח את הצלחת תחת מיקרוסקופ המתאים להדמיה תא חי. חשובה: מדדי הקרינה הם רגישים מאוד לאור, ולכן, יש להימנע מחשיפה לאור מיותרת.
- לרכוש תמונות מבלי לשנות את הפרמטרים הרכישה כדי להבטיח השוואתיים בין תמונות שונות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
חשיפת עור לסוכני אלקילציה מעוררת אודם, היווצרות כיב כיב עורי ושמזוהה עם הפרעת ריפוי פצע. ריפוי פצע דורש vasculogenesis angio- ואשר מבוססים על הגירה של תאי האנדותל. הגירה כמותי יכולה להיות מוערכת על ידי שימוש של assay קאמרי בוידן. כפי שניתן לראות בתרשים 1C חשיפה של השוק האירופי המשותף לכלוראמבוציל סוכן אלקילציה הביא לירידה משמעותית בתא הגירה 9. תוספת של חומצת אלפא-ROS הנבלות לינולנית (ALA) מייד לאחר החשיפה לכלוראמבוציל למשך 24 שעות הצילה באופן משמעותי פנוטיפ זה, כמעט לרמות שליטה.
Assay קאמרי בוידן הוא כלי מתאים כדי להעריך את המספר (כמות) של תאים נדדו. עם זאת, assay אינו מספק מידע על הגירת ההתנהגות של התאים. איור 2 מראה כי השוק האירופי המשותף שלא נחשף מסוגל לסגור את הפער בפצע וריפוי התחתאיי בתוך 24 שעות 9. לעומת זאת, השוק האירופי המשותף החשוף לכלוראמבוציל סוכן אלקילציה לא הצליחו לסגור את הפער בריפוי הפצע assay 9. יתר על כן, מעקב תא של השוק האירופי המשותף אחת גילה כי תחת ההשפעה של תנועה בבימויו כלוראמבוציל לא נצפה 9. טיפול בשוק האירופי המשותף עם ROS-נבלות הצליח לשחזר נדידת תאים ביים 9.
היווצרות מיטוכונדריאלי ROS נקשרה עם ירידת ערך של תא הגירה 12. כפי שניתן לראות באיור 3 חשיפה של השוק האירופי המשותף לכלוראמבוציל הביא להתמוטטות של קרום המיטוכונדריה פוטנציאל 9. טיפול בשוק האירופי המשותף עם ROS-נבלות מנע נזק המיטוכונדריה ומתוחזק פוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה.
לסיכום, כל השיטות שתוארו בסעיף הפרוטוקול הן כלים מתאימים כדי להעריך נדידת תאים. ממצאים על האובדן או שימור של פוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה עשוי לספק נ 'רמזי aluable לגבי המנגנונים מולקולריים שבבסיס של נדידת תאים פגומה.
איור 1. התא assay וידן. () EEC היה זרע במוסיף תא מסנן וידן, טופח במשך 8 שעות, קבוע ומוכתם עם DAPI. כוכביות מצביעות היגרו EEC. בתמונה מוצגת כולל של 19 תאים ניתן לספור (איור 1). ראשי חץ אדומים מצביעים על תאים שלא היגרו מעבר להוספה לחלוטין או שאינם לחלוטין בשדה הראייה ולכן לא נכללו בספירת תאים. (ב) הנקבוביות (8 מיקרומטר) בקרום להיות גלוי בעת שימוש בזמני חשיפה ארוכות לרכישת תמונה. אל תבלבל אותם עם תאים נדדו. (ג) תחת שליטהתנאים ממוצע של 212 תאים נדדו דרך הממברנה. חשיפת כלוראמבוציל הביאה רק 128 תאים נדדו. טיפול בשוק האירופי המשותף חשוף כלוראמבוציל עם חומצת אלפא ROS-הנבלות לינולנית (ALA) נדידת תאים הצילו באופן משמעותי. סימנים מייצגים תוצאות בודדות מהוספת מסנן אחד. פסים אופקיים שחורים מצביעים על אמצעים (n = 4), ברים שגיאה מצביעים SD וכוכביות מצביעים על הבדלים משמעותיים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. assay ריפוי פצע / מעקב תא. EEC היה שטופל דמה (חילופי בינוניים) או חשוף ל12.5 מיקרוגרם / מיליליטר כלוראמבוציל. לאחר הגירוד, תאי wבטרם נחקר במשך 24 שעות. () EEC הצליחו לסגור את הפער בassay ריפוי הפצע בתוך 24 שעות ואילו כלוראמבוציל נחשף EEC לא הצליחו לסגור את הפער. טיפול עם ALA הביא לשיפור משמעותי של נדידת תאים. (ב) ממוצע ערכים מ3 ניסויים בלתי תלויים כל אחד עם 5 חזרות טכניות לכל קבוצה (n = 15 לכל קבוצה) מוצגים. ברים שגיאה מייצגים סטיות וכוכביות סטנדרטיים מצביעים על הבדלים משמעותיים סטטיסטיים (כיוון אחד ANOVA, p <0.05). שונה מSteinritz et al. (2014) 9. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. הערכה של קרום פוטנציאלי. EEC המיטוכונדריה היתה שטופל דמה, נחשף לכלוראמבוציל (12.5 מיקרוגרם / מיליליטר) או chlorambucil חשוף וALA (15 ng / ml) שטופל. 24 שעות לאחר החשיפה, תאים היו עמוסים TMRM במשך 15 דקות ומייד צילמו. (א) לא החשוף EEC גילה אות מובהקת לאחר תיוג TMRM מציינת פוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה אינו פגום. חשיפת כלוראמבוציל (ב ') הביאה לירידה משמעותית של אות TMRM. (ג) טיפול בשוק האירופי המשותף חשוף כלוראמבוציל עם חומצת אלפא לינולנית ROS-נבלות החזיר את פוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
חשיפת עור לחומרים כימיים רעילים לעתים קרובות תוצאות הפרעה בריפוי פצע חמורה. המנגנונים הם במידה רבה לא ידועים. ריפוי פצע הוא תהליך מורכב הכולל שלבים שונים (עצירת דימום, דלקת, שגשוג ושיפוץ). נדידת תאים מעורבת בכל שלב, לעומת זאת, זה הוא בעל חשיבות עליונה ליצירת רקמת פרור. הנה, כלי דם חדשים נוצרים גם על ידי angio- או vasculogenesis.
שני התהליכים דורשים הגירה מושפעת של מבשר ותאי האנדותל מוקדמים. הערכה של נדידת תאים והבהרת המנגנונים לנדידת תאים מופרעת היא רלוונטית ביותר על מנת לפתח אסטרטגיות טיפוליות חדשות נגד הפרעות ריפוי פצע toxicant מושרה.
נדידת תאים ניתן להעריך על ידי גישות שונות. טכניקה נפוצות היא assay קאמרי בוידן שהוצג במקור כדי לנתח נוגדנים antigen גרם chemotaxis על כדוריות דם לבנות 13. assay זה assay נקודות קצה כמותי שמשקף את יכולת הפלישה של תאים מהתא העליון של הוספת transwell לתא התחתון בתגובה לchemoattractant. בטכניקה המתוארת במסמך זה, אין chemoattractant התווסף לתא התחתון. כך chemokinesis (הגירה אקראית ללא chemoattractant ספציפי) של השוק האירופי המשותף בתנאי שליטה או בתגובה לכלוראמבוציל נחקר.
הכנס מורכב מקרום נקבובי המאפשר שלוש נדידת תאים ממדית דרך הנקבוביות של הקרום. הגודל הנקבובית של הקרום יש לבחור ביחס לגודל התא: נקבוביות שהם קטנים מדי ימנעו נדידת תאים לחלוטין, נקבוביות שהם גדולים מדי יאפשר חולף ללא הפרעה של כל התאים. לתאי האנדותל מוקדמים, גודל נקבובית של 8 מיקרומטר מומלץ. השימוש בגודל נקבובית בלתי הולם יביא לתוצאות irreproducible. ביורדr להתאים את הפרוטוקול לתאים בעלי תכונות שונות כמו השוק האירופי המשותף, אנו ממליצים להתחיל עם גודל נקבובית גדול יותר מהגרעינים ולהגדיל את הגודל הנקבובית צעד-אחר-צעד במידת צורך. לדוגמא, לתאים קטנים כמו כדוריות דם לבנות גודל נקבובית של 3 מיקרומטר מומלץ.
נושא קריטי הוא קביעת זמן הדגירה עד לניתוח. לאורך זמן, התפשטות תאים (לפחות בקבוצות שליטה) תתקיים. זה בתורו להגביר את מספר התאים שיכולים לחדור דרך הקרום, פוטנציאל הפחתת הרגישות של השיטה: אפילו עם יכולות נדידה מעט לקויים, תאים ייתכן שיוכלו להעביר על פני תקופות זמן ארוכות. לכן, תקופות ארוכות (שעות למשל 24) אינן מומלצים לתאי האנדותל. מצד השני, אם הדגירה קצרה מדי לאחר זריעת תאים, רק כמויות קטנות של תאים שעברו את הקרום. דגירה 8 שעות נמצאה אופטימלית. לאחר זמן דגירה המוגדרת של 8 שעות, תאיםמחדש קבוע, מוכתם ונספר באופן ידני.
ישנן שלוש גישות אפשריות לניתוח: (1) תאים על גבי הקרום (שלא היגר) יוסרו על ידי ספוגית. אז התאים בצד התחתון של הקרום (תאים נדדו) הם מוכתמים גם עם ציטולוגית (למשל, hematoxylin) או צבע פלואורסצנטי (למשל, DAPI) ונספר. (2) לחלופין, תאים בצד התחתון יכולים להיות מוכתמים עם צבע ניאון ראשון ומנותקים לאחר מכן (למשל, על ידי השימוש בטריפסין). הקרינה היא לכמת לאחר מכן על ידי השימוש בקורא הקרינה. (3) אנו ממליצים להשתמש בממברנות נקבוביות בצבע כהה שחוסמות העברת אור ובכך לאפשר התמיינות של תאים שאינם מוסבים (תאים על גבי הקרום) ותאים נדדו (בחלק התחתון של הקרום). לאחר צביעת הקרינה (לא ניתן להשתמש בצבעי ציטולוגית) תאים בצד התחתון נספרים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. זה חשוב לא גonfound אוריינטצית הקרום. שימוש בקרום אטום מייתר את הצורך להסיר את התאים הלא-שהועברו. השימוש בממברנות אטומות, מכתים ניאון וספירה תאי מדריך להתבררה מעולה לגישות האחרות.
באופן כללי, assay קאמרי בוידן הוא assay שהוא קל לטפל ולכן הוא משמש לעתים קרובות assay להערכה של נדידת תאים. עם זאת, יש שני חסרונות עיקריים: (1) assay תא וידן הוא assay נקודת סיום. כלומר, אם נקודת זמן הניתוח היא שגויה, התוצאה עלולה להיות מטעה. (2) assay לא קל להפוך. עם זאת, assay זה הוא אחד הכלים החשובים ביותר להערכה של נדידת תאים.
בניגוד לassay קאמרי בוידן סטטי, ריפוי הפצע assay (המכונה גם assay סגירת פער או assay מאפס) הוא assay דינמי בזמן אמת. זה assay שתי הגירה ממדית ללא שלוש תנועות פלישת תא ממדיות. אחרי "פצע" של שכבות תאים עם קצה פיפטה, תאים לנדוד לתוך הפער. Assay הוא פשוט לביצוע וימנע את הבעיות של assay נקודת סיום סטטי. עם זאת, יש כמה אתגרים assay: (1) מערכת הדמיה תא חי מיקרוסקופית (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עם אווירת humidified) נדרש. ודא כי מנות תרבית תאים לא יתייבשו. (2) רכישת תמונת זמן לשגות תגרום קבצי נתונים גדולים בהתאם לפרמטרים (רזולוציה, המרווח) משמשים. (3) מגרד את שכבת התא עם קצה פיפטה הוא לא קל כמו שזה עשוי בתחילה מופיע. יותר מדי לחץ יפגע במשטח הצלחת שעלולה לגרום לחפצים. יתר על כן, רוחב הפער עשוי להיות שונה בהתחלה ויכול להיות שונה בין חוקרים שונים. חוקר מנוסה מומלץ. (4) מספר הדגימות שניתן להריץ במקביל מוגבל על ידי הציוד. עם זאת, ריפוי הפצע assay הוא עוד כלי רב ערך עבור כמותיים וqualהערכת itative של נדידת תאים. מידע על מהירות הגירה, מרחק הגירה, הגירה מכוונת יכול להיות שנאספה בהתקנה אחת ניסיונית. מעקב תא במערכת דו-ממדית הוא לא קשה מאוד וניתן לבצע עם תוכנת קוד פתוחה (לדוגמא, ImageJ וMTrackJ).
ציפוי של תרבות מנות תא אינו חשוב רק לקובץ מצורף תא, אך יש לו השפעה משמעותית על תפקוד סלולארי ביחס להגירה. תאי האנדותל בתרבית באופן שיגרתי על משטחים מצופים ג'לטין 0.1%. שימוש במצופים שאינם עלה לטיפוח תא האנדותל הביאו שגשוג ירד 14. ציפויים אחרים (למשל, פיברונקטין) נמצאו מתאימים גם לטיפוח לטווח קצר, לעומת זאת, ציפוי ג'לטין הראה ביצועים מעולים בניסויי טיפוח לטווח ארוך 15.
יש צבעי הקרינה רבים בשוק הדמיה תא חי. יש לנו צ'וסן TMRM לחקור את פוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה. צבעים רבים אחרים (למשל, JC-1, TMRE) להפגין ביצועים דומים. בניגוד לבדיקות מונוכרומטי (TMRM, TMRE), משמרות הקרינה JC-1 מירוק לאדום לאחר ההצטברות במיטוכונדריה. זה מאפשר ניתוח חצי כמותית ratiometric של מדינת קיטוב המיטוכונדריה אבל מעכבי ניסויי צביעה כפולים (לדוגמא, באמצעות צבעי גשש לזהות מיטוכונדריה) 16. מניסיוננו הצבע עצמו הוא פחות קריטי עבור הניסוי ואילו עיצוב ניסיוני, טיפול התא והרכישה הוא מאתגר ודורש תשומת לב רבה יותר. כמעט כל צבעי הניאון הם רגישים לאור. לכן, טעינה סלולארי צריכה להיעשות בחושך. טעינה נייד דורשת 15-30 דקות. זמן טעינה ממושך לא לגרום לאותות מוגברים ואינו מומלץ. למרות שניתן היו לזהות אותות ספציפיים לאחר תקופות ארוכות טעינה, הצבע עלול להצטבר בCompart subcellularמפעלים או אולי אפילו להיות משוחררים מהתא. כתוצאה מכך, יש לטעון תאים בדיוק לפני ניתוח ולא בהכרח בתחילת הניסוי. ריכוז טעינת הצבע בדרך כלל הוא בטווח של 10 מיקרומטר. עם זאת, עם TMRM ריכוזים נמוכים בהרבה (20 ננומטר) נמצאו מספיק לתיוג ועדיין נתנו תוצאות סבירות. כפי שניתן לראות באיור 3 חשיפת פוסט כלוראמבוציל 24 שעות תיוג הביאה להפסד ברור של פוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה. טיפול בכלוראמבוציל נחשף EEC עם ROS-אוכלי נבלות היו מסוגלת לשמור על פוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה בשעה 24 לאחר החשיפה הראשונית.
לסיכום, assay קאמרי בוידן, ריפוי הפצעים assay בשילוב עם ניתוח מסלול תא בודד כלים חשובים להעריך הגירת התנהגות ביחס לאיכותיים והיבטים כמותיים. תיוג של פוטנציאל של המיטוכונדריה עם TMRM יכול לעזור לזהות מנגנונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Boyden Chamber | |||
| Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 3 µm | Corning Incorporated | #351151 | |
| Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 8 µm | Life Sciences | #351152 | |
| (for use with Falcon Insert 24 well Companion Plate (353504) | |||
| Wound healing assay | |||
| Glass bottom dishes | Word Precision Instruments, Inc. | #FD35-100 | |
| Assessment of mitochondrial potential | |||
| TMRM (tetramethylrhodamine methyl ester) | Life Technologies | #T669 | |
| Cell culture | |||
| Accutase | PAA, Pasching, Austria | # L11-007 | |
| α-Linolenic acid | Fluka (Sigma), Steinheim, Germany | # L2376 | |
| Chlorambucil | Fluka (Sigma), Steinheim, Germany | # 23125 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany | # G2500-100G |
References
- Bauer, S. M., Bauer, R. J., Velazquez, O. C. Angiogenesis, vasculogenesis, and induction of healing in chronic wounds. Vascular and Endovascular Surgery. 39, 293-306 (2005).
- Reinke, J. M., Sorg, H.
- Hart, J. Inflammation. 1: Its role in the healing of acute wounds. Journal of Wound Care. 11, 205-209 (2002).
- Liu, Z. J., Hyperoxia Velazquez, O. C. endothelial progenitor cell mobilization, and diabetic wound healing. Antioxidants & Redox Signaling. 10, 1869-1882 (2008).
- Gallagher, K. A., Goldstein, L. J., Thom, S. R., Velazquez, O. C. Hyperbaric oxygen and bone marrow-derived endothelial progenitor cells in diabetic wound healing. Vascular. 14, 328-337 (2006).
- Kehe, K., Balszuweit, F., Steinritz, D., Thiermann, H. Molecular toxicology of sulfur mustard-induced cutaneous inflammation and blistering. Toxicology. 263, 12-19 (2009).
- Schmidt, A., et al. Nitrogen mustard (Chlorambucil) has a negative influence on early vascular development. Toxicology. 263, 32-40 (2009).
- Steinritz, D., et al. Effect of N-acetyl cysteine and alpha-linolenic acid on sulfur mustard caused impairment of in vitro endothelial tube formation. Toxicological Sciences. 118, 521-529 (2010).
- Steinritz, D., et al. Chlorambucil (nitrogen mustard) induced impairment of early vascular endothelial cell migration - Effects of alpha-linolenic acid and N-acetylcysteine. Chemico-biological Interactions. 219C, 143-150 (2014).
- Schmidt, A., et al. Influence of endostatin on embryonic vasculo- and angiogenesis. Developmental Dynamics : an Official Publication of the American Association of Anatomists. 230, 468-480 (2004).
- Dainiak, M. B., Kumar, A., Galaev, I. Y., Mattiasson, B.
- Wang, Y., et al. Regulation of VEGF-induced endothelial cell migration by mitochondrial reactive oxygen species. American Journal of Physiology. Cell physiology. 301, C695-C704 (2011).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
- Relou, I. A., Damen, C. A., van der Schaft, D. W., Groenewegen, G., Griffioen, A. W. Effect of culture conditions on endothelial cell growth and responsiveness. Tissue & Cell. 30, 525-530 (1998).
- Smeets, E. F., von Asmuth, E. J., vander Linden, C. J., Leeuwenberg, J. F., Buurman, W. A. A comparison of substrates for human umbilical vein endothelial cell culture. Biotechnic & Histochemistry : Official Publication of the Biological Stain Commission. 67, 241-250 (1992).
- Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. BioTechniques. 50, 98-115 (2011).
