Abstract
(Kükürt ve azot hardalları gibi alkilleyici kimyasal savaş ajanları dahil) kimyasal maddelere maruz kalma yara iyileşmesi bozukluğu gibi klinik belirtiler bir bolluk neden olur. Yara iyileşmesinin fizyolojik süreç oldukça karmaşıktır. Ya vaskülojenez yoluyla (roman oluşumu) veya anjiyojenezi (mevcut gemilerin filizlenmesi) - granülasyon dokusu oluşumu bir ön yara kapanması ile sonuçlanan ve yeni kılcal kan damarlarının ağını sağlayan bu süreçte önemli bir adımdır. Hem vasculo- ve anjiyojenez endotel hücrelerinin fonksiyonel yönelik geçiş gerektirmektedir. Böylece, erken endotel hücre (AET) göç soruşturma potansiyel terapötik müdahale için yeni stratejiler belirlemek bozuklukları şifa kimyasal kaynaklı yara patofizyolojisi anlamak ve önemlidir.
Biz ajan poz alkilleyici sonra bozulmuş yara iyileşmesi değerlendirildi ve tr için potansiyel aday bileşikler testeatment. Bu protokolde belirtilen tekniklerin bir dizi kullanılabilir. Modifiye Boyden odası kantitatif AET'nin kemokinezinin açıklanmıştır araştırmak. Ayrıca, niteliksel göç değerlendirmek için iz analizi ile birlikte tahlil yara iyileşmesi kullanımı gösterilmiştir. Son olarak, biz rahatsız hücre göçünün altında yatan mekanizmaları belirlemek için mitokondriyal membran potansiyelinin araştırılması için floresan boya TMRM kullanımını göstermek. Aşağıdaki protokol AET soruşturma için adapte edilmiş temel teknikleri anlatılmaktadır.
Introduction
Hücre göçü deri hasarı sonrasında gelişme, çeşitli hastalıklar ve yara iyileşmesi dahil olmak üzere, pek çok fizyolojik ve patofizyolojik işlemlerde önemlidir.
Cilt hasarı takiben iltihap hasarlı veya nekrotik doku ve granülasyon sürücüleri ön yara kapanması kaldırır ve vaskülojenez yoluyla yeni kılcal bir ağ oluşumunu (roman oluşumu) veya anjiyojenezi (mevcut veziküllerin filizlenme) 1-3 verir. Hem vasculo- ve anjiyojenez endotel hücrelerinin göçünü gerektirir. kan damarlarının artan ağ nihai olarak keratinizasyon tabi keratinositlerin çoğalan oksijen ve besin taşımak için gerekli olan, yeni bir epitel oluşturur ve yara kapanmasını sağlar.
Endotel hücrelerinin Engelliler göç bozukluğu 4,5 yara iyileşmesi altta yatan nedenidir. Erken endotelyal hücrelerin Dolayısıyla, yöntem değerlendirmek için geçiş pathophysiol keşfetmek için gerekli olanhücre göçü bozukluklarının ogy ve terapötik müdahale için yeni stratejiler belirlemek için.
Alkile edici maddeler (örneğin, kükürt ve azot hardalları) dermal maruz bozukluğu 6 yara iyileşme neden olur. Bu tür bileşikler nedeniyle siyasi istikrarsız bölgeler ve nispeten basit sentez mevcut stokları güçlü endişe nedeni, 20. yüzyılda çeşitli çatışmalarda kimyasal savaş maddeleri olarak kullanılan ve devam edildi. Sülfür, hardal, ilk 1822 sentezlendi rağmen, SM maruz moleküler ve klinik patoloji detaylı olarak anlaşılamamıştır SM maruz kalma bir antidot saptanmıştır.
Pek çok çalışma, anlamak ve SM maruz kaldıktan sonra bozuk yara iyileşmesi model ve bu etki ayırma yeteneğine potansiyel aday bileşikler test etmek için gerçekleştirilmiştir. Schmidt ve ark. (2009), klorambusil etkisini MM SM benzer özelliklere sahip bir alkilleme bileşiği testse embriyoid vücut modelleri ve damar oluşumunda 7 dramatik, bazen% 99'dan fazla azalma bulundu. Bu olumsuz etki, en, fizyolojik koşullar altında, proliferasyon ve vasküler endotel öncü hücrelerin göç hakim olduğu bir gelişme aşamasında belirgindir. Bu nedenle, bu hücreler, alkile edici maddeler, özellikle duyarlı olduğu tespit edilmiştir. Steinritz ve ark., (2010), fare embriyoit vücut modellerinde ve özellikle SM toksisitesini azaltmak için yetenekleri açısından özellikle, N-asetilsistein (NAC), ve alfa linolenik asit (ALA), reaktif oksijen türlerinin (ROS), temizleyicileridir test damar oluşumunu 8 geri yükleme. Geçici koruyucu etkilerinin aşırı ROS oluşumu yara iyileşmesi üzerine SM olumsuz etkilerine katkıda muhtemel olduğunu belirten gözlendi. Bu etkiler kalıcı değildir ve iki aday bileşikler, uzun vadede 8 damar oluşumu ve yara iyileşmesini geri yeteneğine sahip olmayabilir. However, bu deneyler, hücre göçü soruşturma izin vermedi karmaşık bir 3D modelinde yürütülmüştür. Böylece, sonradan damar oluşumu 9 sürecinde önemli bir role sahip EEC hücre göçü üzerindeki yararlı etkileri NAC ve ALA test edilmiştir.
Ayrıca, hücre kutup hücre göçü için gerekli olduğunu kanıtlar vardır. ROS oluşumuna yol açan Mitokondriyal işlev bozukluğu, hücre polarite bozduğu gösterilmiştir ve bu nedenle olumsuz hücre göçü etkileyebilir. Bu nedenle, mitokondriyal fonksiyon açısından canlı hücre görüntüleme uygulandı ve ROS temizleyicilerin etkileri incelenmiştir. Aşağıdaki protokol EEC, Boyden odasının deneyi, hücre izleme analizleri ayrıntılı olarak mitokondriyal fonksiyonun değerlendirilmesi için TMRM kullanımı dahil olmak üzere deney yara iyileşmesi kültivasyonu için genel şartları tarif eder. AET ekimi ve göç için deneysel protokollerin önemli yönleri vurgulanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Aşağıdaki protokol, erken endotelyal hücre göçü araştırılması için teknikleri açıklar. vasküler endotelyal hücrelerin uygun bir kültür endotelyal fenotipin uygun çoğalması ve bakım sağlamak için jelatin ile hücre kültürü şişelerinde ön-kaplama gerektirir.
Hücre kültürü şişeleri 1. Ön kaplama
- % 0.1 bir son konsantrasyona kadar, 0.1 M PBS içinde jelatin çözülür.
- (Ayrıntılar belli otoklav talimatlara bakın) sıvı otoklav için parametreleri ile çözüm otoklavlayın.
- Steril hücre kültürü şişesine (a T25 hücre kültürü şişesine örneğin, en azından 5 mi) otoklava jelatin solüsyonu yeterli hacim.
- Bir inkübatör içine şişeler aktarın (37 ° C,% 5 CO2 gerekli değildir ancak müdahale etmez), en az 30 dakika karıştırıldı.
- Kalan jelatin çözüm çıkarın. Daha sonra önceden kaplanmış şişeler kullanın (bkz hücre ekimi) ya da skullanılıncaya kadar steril şartlar altında yırtıldı.
Erken Endotel hücrelerinin 2. Hücre Yetiştiriciliği
Not: daha önce tarif edildiği gibi 10,11 Embriyonik kök hücre kaynaklı erken endotel hücreleri (EEC) PECAM-1 pozitif hücre fraksiyonunun, manyetik aktive edilen hücre sınıflandırma ile farklılaşmış fare embriyoid gövdelerinden elde edilmiştir.
- DMEM jelatin kaplı hücre kültür çanakları üzerinde Kültür EEC% 15 FCS, 50 U / ml penisilin, 50 u ile takviye / ml streptomisin, 200 uM L-glutamin, 100 uM beta-merkaptoetanol ve% 1 temel olmayan amino asitler yer alır. Steril koşullar altında hücrelerin taşıyınız. 37 ° C'de% 5 CO2 ile hücreleri yetiştirmek ve% 95 nem alt izdiham (maks.% 80) kadar.
- 5 oranında: alt izdiham, 1 hücreleri bölmek. Not: endotelyal hücrelerin Müfreze kritik bir adımdır.
- RT Accutase ile hücreleri Hasat. Ortamı çıkarın PBS ile yıkayın ve 25 cm başına Accutase 1 ml ekleyin
- Hücreler müstakil kadar 2-10 dakika boyunca oda sıcaklığında balon inkübe edin. Hücreleri Dağılın ve istenen uygulama aktarabilirsiniz. Not: Accutase kimyasal nötralizasyon serpilmiş hücreleri, 37 ° C'de inkübatör içinde depolanan zaman gerçekleşir olarak gerekli değildir. Ancak, Accutase aktivite de DMEM içeren FCS ekleyerek azaltılabilir.
- RT Accutase ile hücreleri Hasat. Ortamı çıkarın PBS ile yıkayın ve 25 cm başına Accutase 1 ml ekleyin
3. Boyden Odası
Not: Boyden haznesi Testler 8 um gözenek büyüklüğüne sahip ışık geçirmeyen, polietilen tereftalat ekleme sistemi kullanılarak gerçekleştirilir.
- Ön kaplama, en az 30 dakika boyunca 0.1 M PBS içinde çözülmüş,% 0.1 jelatin, 500 ul ilave edilerek filtre ekler (böylece bir Boyden haznesi oluşturmak hücre kültürü kuyu içinde bu uyum).
- Hücreler toksik kimyasallara maruz kalması ise, hücre hasat öncesi spesifik deneysel tasarım göre maruz kalmaktadır. Not: Hücreler / ml DMEM 12.5 mikrogram chlorambucil maruz bırakıldı24 saat karıştırıldı. Belirli bir deney tasarımı ile ilgili olarak, kullanım talimatları değişebilir.
- Hasat EEC bir sayma hücre odasını kullanarak hücre sayısını belirlemek ve. Not: Otomatik sayım cihazları kullanılabilir, ancak dikkatli kullanılmalıdır: manuel hücre sayımı daha doğru ve şiddetle tavsiye edilir.
- Boyden odasının alt bölmesi bölmesine 500 ul hücre kültür ortamı.
- Üst bölme bölmesindeki filtre elemanının 500 ul hücre kültür ortamı içinde tam olarak 10 4 EEC ekleyin. Kabarcıklar ortadan kaldırın.
- Tam 8 saat boyunca inkübatör filtre ekler inkübe.
- Bir kez PBS ile yıkayın ve hücre tespiti için 25 dakika süre ile, her iki bölme içinde 0.5 ml% 4 paraformaldehit ile orta yerine. Yoğun filtre yıkayın, ancak 0.1 M PBS ile en az 3 kez.
- Bir neşter ile membranlar tüketim.
- Nükleer lekelenme için DAPI içeren montaj ortamı ile iki cam kapak fişleri arasında membran monteörn. Yönlendirmeye dikkat edin. Zarın alt bölme tarafına doğru göç etmiş tek hücreler sayılır emin olun.
- 400X büyütmede bir floresan mikroskop ile zarın alt bölme tarafına doğru göç etmiş hücreleri saymak. Göç hücreleri (Şekil 1A, 1B) ile membran gözenekleri karıştırmayın. Biyolojik çoğaltır makul sayıda (koşul başına en az 3 biyolojik çoğaltır) araştırın.
4. Yara İyileşme Testi
- DIC mikroskopi kullanılarak, plastik yüzey tabanlı kültür kaplarına veya kuyu plakaları önlemek yerine cam tabanlı cihazlar kullanın: Mevcut donanımına bağlı olarak, dikkatli bir hücre kültürü yemekleri veya plakaları seçin.
Not: faz kontrast mikroskopisi kullanılarak durumunda, plastik esaslı yemekler de kullanılabilir. - Canlı hücre görüntüleme için uygun hücre kültürü cihazında AET Yetiştirmek (örneğin, 4 cm'lik cam alt petri uygun)% 80 izdiham kadar. Önemli: izdiham tamamlamak için hücreleri yetiştirmek yoktur.
- Steril 10 ul pipet uçları ile mono tabakaları Scratch. Çanak yüzeye çok fazla baskı olmadan hafifçe ucu itin ve müstakil hücreleri çıkarmak için 0.1 M PBS ile hücreler iki kez other.Wash bir taraftan sorunsuz bir çizgide hareket ettirin.
- Kültür çanak orta yeterli hacim ekleyin. Varsa, soruşturulması gerektiğini bileşikler ekleyin.
Not: ihtiva eden 1.5 ml'lik ortam 15 ng / ml a linolenik asit ilave edildi. - Canlı hücre görüntüleme yeteneğine sahip bir mikroskop altında kültür çanak monte edin. CO2% 5, 37 ° C ve nemlendirilmiş bir atmosfer sağlamak.
Not: Nemlendirme orta buharlaşmayı önlemek için özellikle önemlidir. - 10 dakika aralıklarla 24 saat boyunca zaman atlamalı görüntüler elde. Büyük dosya boyutları için planlayın. Not: 512 x 512 piksel çözünürlük genellikle yeterlidir; Ancak, en az 1,024 x 1,0 görüntülerini kullanmanızı öneririz24.
- Açık kaynak yazılım (örn ImageJ) mikroskop birlikte verilen yazılımın uzunluğu aracını kullanarak = 24 saat t = 0 saatte ve t boşluk genişliğini ölçün veya kullanmayın. Not: Genel spesifik görüntü toplama ve analiz yazılımında üreticisi tarafından sağlanır. Bu nedenle, yazılımın kullanımı ile ilgili teknik detaylar için, kılavuza bakınız.
5. Hücre Takibi
- DIC mikroskopi kullanılarak, plastik yüzey tabanlı kültür kaplarına veya kuyu plakaları önlemek yerine cam tabanlı cihazlar kullanın: Mevcut donanımına bağlı olarak, dikkatli bir hücre kültürü yemekleri veya plakaları seçin.
Not: faz kontrast mikroskopisi kullanılarak durumunda, plastik esaslı yemekler de kullanılabilir. - Uygun bir hücre kültürü cihazında takviye edilmiş DMEM içinde 5 x 10 4 EEC Tohum (örneğin, 24-çok-yuvalı plaka) 37 ° C ve 1-2 gün süreyle% 95 nemde% 5 CO2 ile hücrelerin kültive edilmesi.
- Hücreler 80 büyüdü zaman% Izdiham, ilgili test maddelerinin varlığında medya ve kültür, yeni medya ile hücreleri çıkarmak (örneğin, 12.5 mikrogram klorambusil / ml DMEM). Her zaman (bireysel deney sistemine bağlı olarak 24 saat), belli bir süre için, 37 ° C 'de (çözücü, örneğin, etanol ile muamele edilmiş), kontrol hücreleri içerir.
- Canlı hücre görüntüleme (37 ° C,% 5 CO2 ve% 95 nem) edebilen bir mikroskop altında bir kültür çanağı monte edin. Önceden tanımlanmış aralıklarla 24 saat boyunca zaman atlamalı görüntüler elde. 10 dakika aralıklarla görüntüleri edinin.
- ImageJ eklentisi MTrackJ kullanılarak elle AET izleme yapın. Görüş alanından rastgele 10 hücreleri seçin ve MTrackJ komutasını "Add" seçeneğini kullanarak zaman içinde noktası başına bir veri noktası ekleyerek onların hareketlerini izlemek.
[. Meijering, Mtrackj "http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/"] MTrackJ ücretsiz olarak mevcuttur ve ImageJ availab: Not[Rasband, ImageJ. "http://rsbweb.nih.gov/ij/"] at le. MTrackJ eklenti hakkında detaylı manuel "http://www.imagescience.org" mevcuttur.
6. Canlı Hücre Görüntüleme / Mitokondriyal Membran Değerlendirilmesi Potansiyeli
- Uygun bir hücre kültürü cihazında AET Yetiştirmek (örneğin, canlı hücre görüntüleme için uygun 4 cm'lik cam alt petri)% 80 izdiham kadar.
Önemli: izdiham tamamlamak için hücreleri yetiştirmek etmeyin. - Varsa, kimyasallara maruz hücreleri. Not: Hücreler, 24 saat boyunca 12.5 ug / ml klorambusil maruz bırakılmıştır. Belirli bir deney tasarımı ile ilgili olarak, kullanım talimatları değişebilir.
- Tetrametilrodamin DMSO (TMRM) içindeki bir 10 mM stok çözelti hazırlayın. Işıktan koruyunuz. Not: Stok solüsyonu -20 ° C 'de muhafaza edilebilir.
- (: 1000 sulandırma 1), 10 uM'lik bir konsantrasyon ile bir çalışma çözeltisine hücre kültür ortamı içinde stok çözeltisi ile seyreltilir. Işıktan koruyunuzve mümkün olduğu kadar kısa zamanda kullanılır. Not: çalışma çözeltisi bir süre (> 1 saat) oda sıcaklığında muhafaza edilebilir, bununla birlikte, yeni bir çalışma çözeltisinin hazırlanması önerilir.
- 1 ml taze hücre kültürü ortamı (yükleme çözeltisi) çalışma çözeltisinin 2 ul ekleyin.
- Yükleme çözümü ile hücre kültür ortamı değiştirerek hücreleri yükleyin. 37 ° C'de,% 5 CO2 ve nemlendirilmiş bir atmosfer (kuluçka makinesinde) 15 dakika için kuluçkalayın. Dikkat: Hemen hemen tüm floresan göstergeleri zamanla canlı hücreler tarafından ihraç edilmektedir; Bu nedenle, uzun süreli yükleme veya gecikmeli analizi kaçının.
- Yıkama olmadan canlı hücre görüntüleme için uygun olan bir mikroskop altında çanak yerleştirin. Önemli: floresan göstergeleri, bu nedenle, gereksiz ışık maruziyeti önlemek, ışığa karşı oldukça duyarlıdır.
- Farklı görüntüler arasında karşılaştırılabilirliği sağlamak iktisap parametrelerini değiştirmeden görüntüleri edinin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Alkilleyici ajanlara dermal maruziyet eritem, blister oluşumu ve yara iyileştirici bozukluğu ile ilişkili dermal ülserasyon kışkırtır. Yara iyileşmesi endotel hücrelerinin göçü dayalı anjio ve vaskülogenezis gerektirir. Kantitatif geçiş Boyden odasının deneyinin kullanımı ile değerlendirilebilir. Alkilleyici ajan klorambüsil için AET Şekil 1C maruz gösterildiği gibi hücre migrasyonu 9 önemli bir azalmaya neden olmuştur. Doğrudan 24 saat chlorambucil maruz kaldıktan sonra ROS-çöpçü alfa linolenik asit (ALA) eklenmesi önemli ölçüde neredeyse kontrol seviyelerine, bu fenotip kurtarıldı.
Boyden haznesi tahlili geçirilmiş hücrelerin sayısını (miktar) değerlendirmek için uygun bir araçtır. Ancak, tahlil hücrelerinin göç davranışı hakkında bilgi vermemektedir. Şekil 2 maruz kalmayan AET yara ve şifa eşek açığını kapatmak mümkün olduğunu gösteriyor24 saat 9 içinde ay. Buna karşılık, alkilleyici ajan klorambusil maruz AET tahlil 9 yara iyileşmesi de farkı kapatmak için koyamadık. Üstelik, tek EEC hücre takibi klorambusil yönelik hareketinin etkisi ile 9 gözlenmedi ortaya koymuştur. ROS-temizleyiciler ile AET tedavisi yönelik hücre göçü 9 geri başardı.
Mitokondriyal ROS oluşumu hücre migrasyonu 12 bozulma ile ilişkili bulunmuştur. Klorambusil için AET Şekil 3 maruz gösterildiği gibi 9 potansiyel mitokondriyal membran arıza sonuçlandı. ROS-süpürücü ile AET tedavisi mitokondriyal hasar engelledi ve mitokondrial membran potansiyeli sürdürdü.
Özet olarak, iletişim kuralı bölümünde tarif edilen tüm yöntemler, hücre göçünü değerlendirmek için uygun araçlardır. V sağlayabilir mitokondriyal membran potansiyeli kaybı veya korunmasında Bulgularengelli hücre göçünün altında yatan moleküler mekanizmaları ile ilgili aluable ipuçları.
Şekil 1. Boyden odasının deney (A). EEC, 8 saat süre ile inkübe edildi, Boyden odasının, filtre ekler üzerinde tohumlandı sabit ve DAPI ile boyanmıştır. Yıldız AET göç göstermektedir. Sunulan bir imge içinde 19 toplam hücre (Şekil 1B) sayılabilir. Kırmızı ok uçları tamamen ekleme genelinde geçirilmez veya bu görüş alanında tamamen değildir ve bu nedenle hücre sayımı alınmadı olan hücreleri göstermektedir. (B) görüntü elde etmek için uzun pozlama süreleri kullanarak görünür hale zarında gözenekler (8 um). Göç hücreleri ile karıştırmayın. Kontrol altında (C)koşullar zarından göç 212 hücrelerinin ortalama. Klorambusil maruz sadece 128 göç hücrelerde sonuçlandı. ROS-çöpçü alfa linolenik asit (ALA) önemli ölçüde kurtarıldı hücre göçü ile klorambusil maruz kalan EEC tedavisi. Semboller, bir filtre elemanının tek tek sonuçlarını temsil etmektedir. Siyah yatay çubuklar (n = 4), hata çubukları, SD ve yıldız anlamlı farklar bildiren araçları göstermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. Yara iyileşmesi tahlil / hücre izleme. AET (orta değişimi) tedavi-sahte ya da 12.5 mikrogram / ml chlorambucil maruz edildi. Hücreleri w tırmalama sonraere 24 saat süre ile incelenmiştir. (A) EEC EEC maruz chlorambucil ise 24 saat içinde yara iyileşmesi tahlilde açığını kapatmak mümkün boşluğu kapatmak koyamadık idi. ALA ile muamele hücre göçü önemli bir gelişme ile sonuçlandı. Grup başına 5 teknik tekrarlı 3 bağımsız deney, her (B) ortalama değerler (n = grup başına 15) gösterilmiştir. Hata çubukları standart sapmalar ve yıldız istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar (Tek yönlü ANOVA, p <0.05) göstermektedir temsil etmektedir. Steinritz ve ark. (2014) 9 modifiye. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Mitokondriyal membran potansiyeli. EEC Şekil 3. Değerlendirme klorambusil (12.5 ug / ml) ya da chloramb maruz, plasebo ile muamele edildiucil maruz kalan ve Ala (15 ng / ml) işlemden geçirildi. 24 saat maruz kaldıktan sonra, hücreler görüntülü hemen 15 dakika boyunca TMRM ile yüklenen ve edildi. (A) Pozlanmamış EEC bir bozulmamış mitokondriyal membran potansiyeli gösteren TMRM etiketleme sonra farklı bir sinyal tespit edildi. (B) Klorambusil maruz TMRM sinyalinin anlamlı bir azalma ile sonuçlandı. ROS-çöpçü alfa linolenik asit ile klorambusil maruz AET (C) Tedavi mitokondriyal membran potansiyeli restore. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zehirli kimyasallara dermal maruziyet sık sık şiddetli yara iyileşmesi bozukluğu ile sonuçlanır. altında yatan mekanizmalar tam olarak bilinmemektedir. Yara iyileşmesi farklı aşamalardan (hemostaz, inflamasyon, proliferasyon ve yeniden şekillenme) oluşan karmaşık bir süreçtir. Hücre göçü, ancak, bu granülasyon dokusunun oluşması için büyük önem taşımaktadır, her aşamada yer almaktadır. Burada, yeni kan damarlarının anjiyo- veya vaskülojenez yoluyla oluşturulur.
Hem süreçler habercisi ve erken endotel hücrelerinin etkilenmemiş göç gerektirir. Hücre göçü ve rahatsız hücre göçü için yatan mekanizmaları açıklığa kavuşturulması değerlendirilmesi toxicant kaynaklı yara iyileşmesi bozukluklara karşı yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi amacıyla büyük önem taşımaktadır.
Hücre göçü, farklı yaklaşımlar ile değerlendirilebilir. Yaygın olarak kullanılan bir tekniktir aslında antikor antig analiz etmek tanıtıldı Boyden odası testtiren lökositlerin 13 kemotaksis neden oldu. Bu deney, bir kimyasal çekici yanıt olarak düşük bir bölmeye, bir Transwell ucun üst bölmeden hücre istilası kapasitesini yansıtan bir niceliksel uç deneyidir. Burada tarif edilen teknikte, bir kemo-çekici alt bölmeye eklendi. Kontrol koşulunda veya chlorambucil yanıt AET Böylece kemokinezinin (belirli bir kemoatraktan olmadan rastgele göç) araştırılmıştır.
uç zarın gözenekleri sayesinde üç boyutlu bir hücre göçünü sağlayan bir gözenekli zar oluşur. Tüm hücre engelsiz geçen sağlayacak kadar büyük olan gözenekler tamamen hücre göçünü önler çok küçük gözeneklerin: Zarın gözenek boyutu, hücre boyutuna göre seçilmelidir. Erken endotel hücreleri için, 8 um arasında bir gözenek boyutuna tavsiye edilir. Uygun olmayan bir gözenek boyutu kullanımı 'tekrarı sonuçlara neden olur. Order, çekirdekle daha büyük bir gözenek boyutuna sahip başlangıç tavsiye EEC gibi farklı özelliklere sahip hücrelere protokolü uyum ve gerekirse gözenek boyutuna adım adım artış. Örneğin, lökositler gibi küçük hücreler için 3 um arasında bir gözenek boyutuna tavsiye edilir.
Bir kritik konu analize kadar inkübasyon süresi belirlenmesidir. Zaman içinde, (en azından kontrol gruplarında) hücre proliferasyonu gerçekleştirilecektir. Bu da, potansiyel olarak yöntemin duyarlılığı azaltan, membrandan nüfuz edebilir hücrelerin sayısını artıracaktır: daha az zarar göç yeteneklerine sahip, hücreler uzun süreler boyunca göç edebilir. Bu nedenle, uzun süreleri (örneğin 24 saat), endotel hücreleri için tavsiye edilmez. Kuluçka hücresi tohumlama sonra çok kısa olması durumunda, diğer yandan, hücrelerin sadece küçük miktarlarda membran geçmiş olacaktır. Bir 8 saatlik inkübasyon optimum bulundu. 8 saat belirlenen kuluçka süresinden sonra, hücreler, birre, sabit, lekeli ve elle sayılır.
(Göç değil) zarın üstünde (1) Hücreler bir çubukla çıkarılır: analiz için üç olası yaklaşımlar vardır. Daha sonra membran (göç eden hücreler) alt tarafındaki hücreler boyanmış ya bir sitolojik (örneğin, hematoksilin) ya da bir floresan boya (örneğin, DAPI) ile sayılır. (2) Alternatif olarak, alt tarafta hücreler önce bir floresan boya ile boyanmış olabilir ve (örneğin, tripsin kullanılarak) daha sonra ayrılır. Floresans daha sonra bir floresan okuyucu kullanılarak ölçülür. (3) bu şekilde olan, taşınmayan hücreler (hücre membran üstünde) ve göç hücreleri (zar altında) farklılaşmasını sağlayan ışık iletimi bloke koyu renkli gözenekli zarların kullanılması önerilir. Alt tarafta Hücreler bir flüoresans mikroskop kullanılarak sayılmıştır floresan boyama sonrasında (sitolojik boyalar kullanılamaz). Bu c önemli değilMembran yönelimi onfound. Opak bir membran kullanılarak göç-hücreleri çıkarmak için ihtiyacı ortadan kaldırmaktadır. opak membranların, floresan boyama ve manuel hücre sayımı kullanımı diğer yaklaşımlar üstün gelmiştir.
Genel olarak, Boyden odasının deney kullanımı kolay olan bir deney, ve bu nedenle, hücre göçünün değerlendirilmesi için sıklıkla kullanılan bir deneydir. (1) Boyden haznesi deneyi, bir nokta deneyidir: Bununla birlikte, iki önemli dezavantajı vardır. Analizin zaman noktası yanlış ise, Bu demektir ki, sonuç yanıltıcı olabilir. (2) deney otomatikleştirmek için kolay değildir. Bununla birlikte, bu deney hücre göçü değerlendirilmesi için en değerli araçlardan biridir.
Statik Boyden odasının tahlilinde aksine, tahlil yara iyileşme (ayrıca aralık kapak deneyi ya da sıfırdan deneyi olarak da adlandırılır), gerçek zamanlı olarak dinamik bir deneyidir. Üç boyutlu hücre işgali hareketleriyle olmadan iki boyutlu bir göç testtir. Bir pipet ucu ile hücre tabakası "yaralama" sonra, hücreler boşluğu içine göç ederler. Deney gerçekleştirmek için basit ve statik bir uç nokta deneyi sorunlarını önler. (1) canlı hücre görüntüleme mikroskopik sistemi (37 ° C, nemli bir atmosfere sahip% 5 CO 2) gereklidir: Ancak, tahlil bazı zorlukları vardır. Hücre kültürü yemekleri kurumasına yok emin olun. (2) Time-lapse görüntü toplama kullanılan parametreler (çözünürlük, aralık) bağlı büyük veri dosyaları neden olur. (3), bir pipet ile hücre tabakasını Taraklı başlangıçta görünebilir kadar kolay değildir. Eserler neden olabilir çanak yüzeyine zarar verecektir Çok fazla baskı. Ayrıca, boşluk genişliği sıfırdan içinde değişebilir ve farklı araştırmacılar arasında farklılık gösterebilir. Deneyimli bir araştırmacı tavsiye edilir. (4) paralel olarak çalıştırılabilir numune sayısı ekipman ile sınırlıdır. Bununla birlikte, tahlil şifa yara nicel ve qual başka değerli bir araçtırHücre göçünün itative değerlendirilmesi. Göç hızı, göç mesafesi hakkında bilgi, yönetmenliğini göç biri deney düzeneği toplanmış olabilir. Iki boyutlu sistemde Hücre izleme çok zor değil ve açık kaynak yazılım (örneğin ImageJ ve MTrackJ) ile yapılabilir.
Hücre kültürü tabakları kaplanması hücre eki için sadece önemli değildir, ancak geçiş ile ilgili hücre fonksiyonu üzerinde anlamlı bir etkisi vardır. Endotel hücreler, rutin olarak% 0.1 jelatin kaplı yüzeylerde kültürlenir. Kaplı olmayan endotelyal hücre ekimi için yüzüne kullanımı azalmış çoğalması 14 sonuçlandı. Başka kaplamalar (örn fibronektin) Kısa vadeli ekimi için de uygun bulunmuştur, ancak, jelatin kaplama Uzun süreli yetiştirme deneylerinde 15 üstün performans gösterdi.
Canlı hücre görüntüleme için piyasada çok sayıda floresan boyalar vardır. Biz Cho varsen TMRM mitokondriyal membran potansiyelini araştırmak için. Pek çok diğer boyalar (örneğin, JC-1, TMRE), karşılaştırılabilir bir performans sergiler. Monokromatik sondalar (TMRM, TMRE) aksine, mitokondrilerde birikimi sonra yeşilden kırmızıya JC-1 floresan geçer. Bu 16 (örneğin, izci boyalar kullanarak mitokondri belirlemek için) mitokondriyal polarizasyon durumunun rasyometrik yarı kantitatif analiz izin verir, ancak ikili boyama deneyleri engellemektedir. Deneysel tasarım, hücre işleme ve toplama zorlu ve çok daha fazla dikkat gerektirir oysa bizim deneyim boya kendisi deney için daha az kritiktir. Hemen hemen tüm floresan boyalar ışığa duyarlı bulunmaktadır. Bu nedenle, hücre yükleme karanlıkta yapılmalıdır. Hücre yükleme 15-30 dk gerektirir. Uzamış yükleme süresi artan sinyaller yol açmaz ve tavsiye edilmez. Özel sinyaller uzun yükleme periyodundan sonra tespit edilebilir, ancak, boya sub-hücresel ara bölmeler içinde birikebilirments ya da hücreden tahliye edilebilir. Bunun bir sonucu olarak, hücrelerin deneyin başlangıcında analizden önce olup mutlaka sadece yüklenmelidir. Boya yükleme konsantrasyonu genellikle 10 uM aralığındadır. Bununla birlikte, TMRM çok daha düşük konsantrasyonlarda (20 nM), etiketleme için yeterli bulundu ve yine de makul sonuçlar verdi. Şekil 3'de gösterildiği gibi etiket 24 saat sonra klorambusil maruz mitokondriyal membran potansiyeli belirgin bir kayıp ile sonuçlanmıştır. ROS-temizleyiciler ilk maruz kaldıktan sonra 24 saat sonra mitokondriyal membran potansiyelini korumayı başardı ile klorambusil tedavisi AET gözler önüne serdi.
Özetle, Boyden odası tahlilde, niteliksel ve niceliksel ilgili yönleri ile göç davranışlarını değerlendirmek için tek bir hücre parça analizi ile birlikte değerli araçlar tahlil edilir yara iyileşmesi. TMRM ile mitokondriyal potansiyeli Etiketleme altında yatan mekanizmaları belirlemeye yardımcı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Boyden Chamber | |||
| Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 3 µm | Corning Incorporated | #351151 | |
| Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 8 µm | Life Sciences | #351152 | |
| (for use with Falcon Insert 24 well Companion Plate (353504) | |||
| Wound healing assay | |||
| Glass bottom dishes | Word Precision Instruments, Inc. | #FD35-100 | |
| Assessment of mitochondrial potential | |||
| TMRM (tetramethylrhodamine methyl ester) | Life Technologies | #T669 | |
| Cell culture | |||
| Accutase | PAA, Pasching, Austria | # L11-007 | |
| α-Linolenic acid | Fluka (Sigma), Steinheim, Germany | # L2376 | |
| Chlorambucil | Fluka (Sigma), Steinheim, Germany | # 23125 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany | # G2500-100G |
References
- Bauer, S. M., Bauer, R. J., Velazquez, O. C. Angiogenesis, vasculogenesis, and induction of healing in chronic wounds. Vascular and Endovascular Surgery. 39, 293-306 (2005).
- Reinke, J. M., Sorg, H.
- Hart, J. Inflammation. 1: Its role in the healing of acute wounds. Journal of Wound Care. 11, 205-209 (2002).
- Liu, Z. J., Hyperoxia Velazquez, O. C. endothelial progenitor cell mobilization, and diabetic wound healing. Antioxidants & Redox Signaling. 10, 1869-1882 (2008).
- Gallagher, K. A., Goldstein, L. J., Thom, S. R., Velazquez, O. C. Hyperbaric oxygen and bone marrow-derived endothelial progenitor cells in diabetic wound healing. Vascular. 14, 328-337 (2006).
- Kehe, K., Balszuweit, F., Steinritz, D., Thiermann, H. Molecular toxicology of sulfur mustard-induced cutaneous inflammation and blistering. Toxicology. 263, 12-19 (2009).
- Schmidt, A., et al. Nitrogen mustard (Chlorambucil) has a negative influence on early vascular development. Toxicology. 263, 32-40 (2009).
- Steinritz, D., et al. Effect of N-acetyl cysteine and alpha-linolenic acid on sulfur mustard caused impairment of in vitro endothelial tube formation. Toxicological Sciences. 118, 521-529 (2010).
- Steinritz, D., et al. Chlorambucil (nitrogen mustard) induced impairment of early vascular endothelial cell migration - Effects of alpha-linolenic acid and N-acetylcysteine. Chemico-biological Interactions. 219C, 143-150 (2014).
- Schmidt, A., et al. Influence of endostatin on embryonic vasculo- and angiogenesis. Developmental Dynamics : an Official Publication of the American Association of Anatomists. 230, 468-480 (2004).
- Dainiak, M. B., Kumar, A., Galaev, I. Y., Mattiasson, B.
- Wang, Y., et al. Regulation of VEGF-induced endothelial cell migration by mitochondrial reactive oxygen species. American Journal of Physiology. Cell physiology. 301, C695-C704 (2011).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
- Relou, I. A., Damen, C. A., van der Schaft, D. W., Groenewegen, G., Griffioen, A. W. Effect of culture conditions on endothelial cell growth and responsiveness. Tissue & Cell. 30, 525-530 (1998).
- Smeets, E. F., von Asmuth, E. J., vander Linden, C. J., Leeuwenberg, J. F., Buurman, W. A. A comparison of substrates for human umbilical vein endothelial cell culture. Biotechnic & Histochemistry : Official Publication of the Biological Stain Commission. 67, 241-250 (1992).
- Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. BioTechniques. 50, 98-115 (2011).
