Abstract
Exposição a substâncias químicas (incluindo alquilantes agentes químicos de guerra, como enxofre e nitrogênio mostardas) causar uma infinidade de sintomas clínicos, incluindo ferida desordem de cura. O processo fisiológico de cicatrização de feridas é altamente complexa. A formação de tecido de granulação é um passo fundamental neste processo, resultando em um fechamento da ferida preliminar e fornecendo uma rede de novos vasos sanguíneos capilares - quer através vasculogenesis (romance de formação) ou a angiogénese (brotação de navios existentes). Ambos vasculo- angiogénese e requerem funcional, migração dirigida de células endoteliais. Assim, a investigação de células endoteliais (CEE) migração precoce é importante para entender a fisiopatologia da química induzida ferida distúrbios de cicatrização e identificar potencialmente novas estratégias para intervenção terapêutica.
Foram avaliados a cicatrização de feridas prejudicada após alquilação exposição agente e testados compostos candidatos potenciais para trratamento. Foi utilizado um conjunto de técnicas delineadas neste protocolo. A câmara de Boyden modificada para investigar quantitativamente quimiocinese da CEE é descrito. Além disso, a utilização do ensaio de cicatrização da ferida, em combinação com a análise de faixas para avaliar qualitativamente migração é ilustrado. Finalmente, que demonstram a utilização do TMRM corante fluorescente para a investigação do potencial de membrana mitocondrial para identificar os mecanismos subjacentes à migração celular perturbado. O protocolo a seguir descreve técnicas básicas que foram adaptadas para a investigação da CEE.
Introduction
A migração celular é importante em muitos processos fisiológicos e patológicos incluindo desenvolvimento, várias doenças, e a cicatrização de feridas após a lesão da pele.
Após lesão da pele, inflamação remove as unidades de tecido de granulação e danificados ou necróticas fechamento da ferida preliminar e permite a formação de uma rede de novos capilares através vasculogenesis (romance de formação) ou angiogênese (surgimento de vesículas existentes) 1-3. Ambos vasculo- angiogénese e exige a migração de células endoteliais. A rede de crescimento de vasos sanguíneos é essencial para o transporte de oxigénio e nutrientes para os queratinócitos proliferam que em última análise se submetem a queratinização, formar um novo epitélio e fornecer o fechamento da ferida.
Prejudicada migração de células endoteliais é uma causa subjacente da ferida desordem 4,5 cura. Assim, os métodos para avaliar a migração de células endoteliais iniciais são necessárias para explorar a pathophysiolgia de distúrbios da migração celular e para identificar novas estratégias para a intervenção terapêutica.
Exposição cutânea aos agentes alquilantes (por exemplo, enxofre e mostardas de azoto) provoca transtorno 6 ferida cura. Esses compostos foram utilizados como agentes de guerra química em vários conflitos no século 20 e permanecem motivo para grande preocupação devido à estoques existentes em regiões politicamente instáveis e síntese relativamente simples. Embora mostarda de enxofre foi sintetizado pela primeira vez em 1822, a patologia molecular e clínica de exposição SM não é compreendido em pormenor e um antídoto para a exposição SM foi identificada.
Vários estudos têm sido realizados para compreender e modelar a cicatrização de feridas prejudicada após a exposição SM e para testar compostos potencialmente candidatos capazes de reservar esse efeito. Schmidt et ai (2009). Testaram o efeito de clorambucil, alquilando um composto com propriedades semelhantes a SM em mouSE modelos de corpos embrióides e encontrada uma dramática redução, por vezes mais de 99% na formação dos vasos 7. Este efeito adverso foi mais pronunciado, numa fase de desenvolvimento que, sob condições fisiológicas, é dominada pela proliferação e migração de células precursoras endoteliais vasculares. Assim, estas células foram identificadas como sendo particularmente sensível a agentes de alquilação. Steinritz et ai (2010). Testados sequestrantes de espécies reactivas de oxigénio (ROS), nomeadamente, N-acetilcisteína (NAC) e ácido alfa-linolénico (ALA) para a sua capacidade para reduzir a toxicidade SM em modelos de ratinho embrióides corpo e, em particular, a 8 restaurar a formação de vasos. Foram observados efeitos de protecção temporárias, indicando que a formação de ROS excessiva era susceptível de contribuir para os efeitos adversos da SM na cicatrização de feridas. Estes efeitos não eram permanentes e os dois compostos candidatos pode não ser capaz de restabelecer a formação de vasos e a cicatrização de feridas, a longo prazo 8. However, esses experimentos foram realizados em um complexo modelo 3D, que permitiu que a investigação de migração celular. Assim, subsequentemente testado NAC e ALA para os efeitos benéficos sobre a migração de células de CEE que têm um papel chave no processo de formação de vasos 9.
Além disso, há evidências de que a polaridade da célula é necessária para a migração celular. Disfunção mitocondrial conduzindo a formação de ROS foi mostrado para danificar polaridade celular e pode, consequentemente, afectar adversamente a migração celular. Assim, imagens de células vivas em relação à função mitocondrial foi realizada e os efeitos de ROS sequestrantes foram examinados. O protocolo que se segue descreve os requisitos gerais de cultivo da CEE, o ensaio de câmara de Boyden, o ensaio de cicatrização de feridas, incluindo a análise de células e seguimento da utilização de TMRM para a avaliação da função mitocondrial em detalhe. Aspectos importantes de protocolos experimentais para o cultivo CEE ea migração são realçados.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
O protocolo seguinte descreve técnicas para a investigação de migração celular endotelial precoce. O cultivo adequado de células endoteliais vasculares exige a pré-revestimento de frascos de cultura de células com proliferação de gelatina para assegurar adequada e manutenção de um fenótipo endotelial.
1. Pré-revestimento de frascos de cultura celular
- Dissolver a gelatina em PBS a 0,1 M a uma concentração final de 0,1%.
- Autoclave a solução com parâmetros para autoclavagem líquido (para mais detalhes veja instruções da autoclave específico).
- Adicionar um volume suficiente da solução de gelatina autoclavado a um frasco estéril de cultura de células (por exemplo, pelo menos 5 ml de um frasco de cultura de célula T25).
- Transferir os frascos em uma incubadora (37 ° C, 5% de CO 2 não é necessária, mas não interfere) durante pelo menos 30 min.
- Remover a solução de gelatina restante. Use os frascos pré-revestidas posteriormente (veja o cultivo de células) ou srasgou em condições estéreis até ser utilizado.
2. O cultivo celular de células endoteliais adiantados
Nota: células estaminais embrionárias derivadas de células endoteliais precoces (CEE) foram obtidas a partir de corpos embrióides de murídeo diferenciadas por separação de células activada por magnética da fracção celular positiva PECAM-1 como descrito anteriormente 10,11.
- Cultura CEE sobre pratos de cultura de células revestidas com gelatina em DMEM suplementado com 15% de FCS, 50 U / ml de penicilina, 50 U / ml de estreptomicina, 200? M de L-glutamina, 100 uM ß-mercaptoetanol e 1% aminoácidos não-essenciais. Pega células sob condições estéreis. Cultivar as células com 5% de CO2 a 37 ° C e 95% de humidade até sub-confluência (máx. 80%).
- Na sub-confluência, divididas as células a uma razão de 1: 5. Nota: Destacamento de células endoteliais é um passo crítico.
- Colher as células com RT Accutase. Remova a mídia, enxaguar com PBS e adicionar 1 ml de Accutase por 25 centímetros
- Incubar o balão à temperatura ambiente durante 2-10 min, até que as células têm destacado. Dispersa-se as células e transferi-los para a aplicação desejada. Nota: A neutralização química dos Accutase não é necessária, uma vez que tem lugar quando as células inoculadas são armazenadas na incubadora a 37 ° C. No entanto, Accutase actividade também pode ser diminuída pela adição de meio DMEM contendo FCS.
- Colher as células com RT Accutase. Remova a mídia, enxaguar com PBS e adicionar 1 ml de Accutase por 25 centímetros
3. Boyden Câmara
Nota: Os ensaios de câmara de Boyden são realizados por meio de sistemas de pastilhas de tereftalato de polietileno de luz-opaco com 8 um de tamanho de poro.
- Pré-revestimento as inserções de filtro (que se encaixam no interior de poços de cultura de células, criando assim uma câmara de Boyden) por adição de 500 ul de 0,1% de gelatina dissolvidos em PBS a 0,1 M durante pelo menos 30 min.
- Se as células são para ser expostas a produtos químicos tóxicos, expor de acordo com o desenho experimental específico antes da colheita das células. Nota: As células foram expostas a 12,5 ug clorambucil / ml de DMEMdurante 24 h. No que diz respeito ao desenho experimental específico, as instruções podem variar.
- Colheita CEE e determinar o número de células utilizando uma câmara de contagem de células. Nota: Os dispositivos de contagem automática pode ser usado, mas deve ser usado com cautela: contagem manual de células é mais preciso e é altamente recomendado.
- Adicionar 500 ul de meio de cultura de células para dentro do compartimento inferior da câmara da câmara de Boyden.
- Adicionar exatamente 10 4 CEE em 500 � de meio de cultura de células por elemento do filtro no compartimento de câmara superior. Eliminar as bolhas.
- Incubam-se as inserções de filtro na incubadora durante exactamente 8 h.
- Lavar uma vez com PBS e substituir o meio com 0,5 ml de paraformaldeído 4% em ambos os compartimentos durante 25 min para a fixação das células. Lavar o filtro amplamente mas, pelo menos, três vezes com 0,1 M de PBS.
- Extirpar as membranas com um bisturi.
- Monte a membrana entre duas lamelas de vidro com meio de montagem contendo DAPI para stainin nuclearg. Preste atenção à orientação. Assegure-se que apenas as células que migraram para o lado do compartimento inferior da membrana são contadas.
- Contagem de células que migraram para o lado do compartimento inferior da membrana com um microscópio de fluorescência com uma ampliação de 400X. Não confunda poros da membrana com células migraram (Figura 1A, 1B). Investigar um número razoável de repetições biológicas (pelo menos 3 repetições biológicas por condição).
4. cicatrização de feridas Assay
- Dependendo do equipamento disponível, escolher com cuidado os pratos de cultura de células ou placas: Ao usar microscopia DIC, evitar placas de cultura com base na superfície de plástico ou placas bem mas utilizam dispositivos baseados em vez de vidro.
Nota: Se estiver usando microscopia de contraste de fase, pratos de plástico com base também pode ser usado. - Cultive CEE em um dispositivo de cultura de células adequado (por exemplo, quatro centímetros de vidro de fundo petri prato adequado para imagens de células vivas) Até 80% de confluência. Importante: não cultivar as células para completar confluência.
- Raspe as monocamadas com estéreis 10 dicas ul pipeta. Empurrar a ponta suavemente sem demasiada pressão sobre a superfície do prato e movê-lo em linha recta sem problemas de um lado para o other.Wash as células duas vezes com PBS a 0,1 M para remover as células destacadas.
- Adicionar um volume suficiente do meio para o prato de cultura. Se for o caso, adicionar compostos que devem ser investigadas.
Nota: 1,5 ml de meio contendo 15 ng / ml de ácido alfa linolénico foi adicionado. - Monte o prato de cultura sob um microscópio capaz de imagens de células vivas. Certifique-se de 5% de CO2, 37 ° C e numa atmosfera humidificada.
Nota: A humidificação é especialmente importante para evitar a evaporação forma. - Adquirir imagens de lapso de tempo superior a 24 horas a intervalos de 10 min. Plano para tamanhos de arquivos grandes. Nota: A resolução de 512 x 512 pixels é geralmente suficiente; no entanto, recomendamos o uso de imagens de pelo menos 1.024 x 1,024.
- Meça a largura da abertura em t = 0 horas e em t = 24 horas usando a ferramenta comprimento do software fornecido com o microscópio ou usar software de código aberto (por exemplo, ImageJ). Nota: Em software de aquisição e análise de imagem específico geral é fornecido pelo fabricante. Por isso, para obter mais detalhes técnicos sobre o uso do software, consulte o manual.
Rastreamento 5. celular
- Dependendo do equipamento disponível, escolher com cuidado os pratos de cultura de células ou placas: Ao usar microscopia DIC, evitar placas de cultura com base na superfície de plástico ou placas bem mas utilizam dispositivos baseados em vez de vidro.
Nota: Se estiver usando microscopia de contraste de fase, pratos de plástico com base também pode ser usado. - Semente de 5 x 10 4 CEE em DMEM suplementado em um dispositivo de cultura de células adequado (por exemplo, placa de 24 poços múltiplos) e cultivar as células com 5% de CO2 a 37 ° C e 95% de humidade durante 1-2 dias.
- Quando as células têm crescido a um 80% De confluência, remova a mídia ea cultura das células com novas mídias na presença das respectivas substâncias de ensaio (por exemplo, 12,5 ug chlorambucil / ml DMEM). Sempre incluem células de controlo (tratados com o solvente, por exemplo, etanol) a 37 ° C durante um certo período de tempo (24 h, dependendo do sistema de ensaio individual).
- Montar o prato de cultura sob um microscópio capaz de imagens ao vivo de células (37 ° C, 5% de CO 2 e 95% de humidade). Adquirir imagens de lapso de tempo superior a 24 horas em intervalos predefinidos. Adquirir imagens em intervalos de 10 min.
- Realizar rastreamento manual de CEE pela utilização do plugin ImageJ MTrackJ. Escolha 10 células aleatoriamente a partir do campo de visão e rastrear seus movimentos através da adição de um ponto de dados por ponto no tempo usando a opção "Adicionar" comando de MTrackJ.
Nota: MTrackJ está disponível gratuitamente no ImageJ e está dispon [Meijering, Mtrackj "http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/".]le em [Rasband, ImageJ. "http://rsbweb.nih.gov/ij/"]. Um manual detalhado sobre o plugin MTrackJ está disponível em "http://www.imagescience.org".
6. Imagens de células vivas / Avaliação do Potencial de Membrana Mitocondrial
- Cultive CEE em um dispositivo de cultura de células adequado (por exemplo, quatro centímetros de vidro de fundo placa de Petri adequado para imagens de células vivas) até uma confluência de 80%.
Importante: Não cultivar as células para completar confluência. - Se for o caso, expor as células a produtos químicos. Nota: As células foram expostas a 12,5 ug / ml clorambucil, durante 24 h. No que diz respeito ao desenho experimental específico, as instruções podem variar.
- Prepara-se uma solução de estoque 10 mM de tetrametilrodamina (TMRM) em DMSO. Proteger da luz. Nota: A solução-mãe pode ser armazenado a -20 ° C.
- Dilui-se a solução de stock em meio de cultura celular a uma solução de trabalho com uma concentração de 10 uM (1: 1000 de diluição). Proteger da luze utilizar o mais rapidamente possível. Nota: A solução de trabalho pode ser mantida à temperatura ambiente durante algum tempo (> 1 h), no entanto, a preparação de uma solução de trabalho de fresco é altamente recomendável.
- Adicionar 2 ml da solução de trabalho de 1 ml (solução de carga) fresco meio de cultura de células.
- Carregar as células através da substituição do meio de cultura de células com a solução de carga. Incubar durante 15 min a 37 ° C, 5% de CO2 e atmosfera humidificada (incubadora). Cuidado: Quase todos os indicadores de fluorescência são exportados por células ao longo do tempo vivendo; portanto, evitar o carregamento prolongado ou atrasado a análise.
- Sem lavar, coloque o prato sob um microscópio apropriado para imagens de células vivas. Importante: indicadores de fluorescência são altamente sensíveis à luz, portanto, evitar a exposição à luz desnecessária.
- Adquirir imagens sem alterar os parâmetros de aquisição de garantir a comparabilidade entre as diferentes imagens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Exposição dérmica para agentes alquilantes provoca eritema, formação de bolhas e ulceração dérmica que está associada com uma desordem de cura de feridas. A cicatrização de feridas requer vasculogénese angio- e que se baseiam na migração de células endoteliais. Migração quantitativa pode ser avaliada pela utilização do ensaio de câmara de Boyden. Como mostrado na Figura 1C exposição de CEE para o clorambucil agente alquilante resultou numa diminuição significativa na migração de células 9. A adição do ácido linolénico ROS-sequestrante alfa (ALA) directamente após a exposição ao clorambucil durante 24 h resgatado significativamente este fenótipo, quase até níveis de controlo.
O ensaio de câmara de Boyden é uma ferramenta adequada para avaliar o número (quantidade) de células que migraram. No entanto, o ensaio não fornece informações sobre o comportamento de migração das células. A Figura 2 mostra que não impressionados CEE são capazes de fechar a lacuna na ferida e bunda curaay dentro de 24 horas 9. Em contraste, CEE exposta ao chlorambucil agente alquilante foram incapazes de fechar a lacuna na ferida ensaio 9 de cura. Além disso, o controle de célula única CEE revelou que, sob a influência do movimento dirigido clorambucil não foi observada 9. Tratamento da CEE com Ros-catadores foi capaz de restaurar a migração celular dirigida 9.
Formação de ROS mitocondrial tem sido associada com diminuição da migração de células 12. Como se mostra na Figura 3 a exposição de CEE para clorambucil resultou na degradação da membrana mitocondrial potencial 9. Tratamento da CEE com ROS-limpador impedido dano mitocondrial e mantido o potencial de membrana mitocondrial.
Em resumo, todos os métodos descritos na secção protocolo ferramentas são adequados para avaliar a migração celular. As conclusões sobre a perda ou preservação do potencial de membrana mitocondrial pode fornecer valuable dicas a respeito dos mecanismos moleculares subjacentes à migração celular prejudicada.
Figura 1. ensaio de câmara de Boyden. (A) CEE foram semeadas em filtros de câmara de Boyden inserções, incubou-se durante 8 h, fixadas e coradas com DAPI. Os asteriscos indicam migraram CEE. Na imagem apresentado um total de 19 células podem ser contadas (Figura 1B). Cabeças de setas vermelhas indicam células que não migraram através da inserção completamente ou que não são completamente no campo de vista e, assim, foram excluídas da contagem de células. (B) Os poros (8 mm) na membrana tornar-se visível quando se usa os tempos de exposição longos para aquisição de imagem. Não os confunda com células migraram. (C) Sob controlecondições de uma média de 212 células que migraram através da membrana. Exposição clorambucil resultou em apenas 128 células que migraram. Tratamento da CEE exposta-clorambucil com o ácido linolénico ROS-sequestrante alfa (ALA) a migração de células resgatado significativamente. Símbolos representam os resultados individuais a partir de um elemento filtrante. Barras horizontais pretas indicam meios (n = 4), barras de erro indicam SD e asteriscos indicam diferenças significativas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. cicatrização de feridas ensaio de seguimento / célula. CEE sham foram tratados (troca de meio) ou expostos a 12,5 ug / ml de clorambucil. Depois de coçar, células were investigada durante 24 h. (A) CEE foram capazes de fechar a lacuna no ensaio de cicatrização da ferida dentro de 24 horas, enquanto que chlorambucil expostos CEE foram incapazes de fechar a lacuna. Tratamento com ALA resultou numa melhoria significativa da migração celular. (B) Os valores médios de três experiências independentes, cada um com 5 repetições técnicas por grupo (n = 15 por grupo) são mostrados. As barras de erro representam desvios-padrão e asteriscos indicam diferenças estatísticas significativas (ANOVA, p <0,05). Modificado de Steinritz et al. (2014) 9. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. A avaliação do potencial de membrana mitocondrial. CEE foram tratados simulada, exposto a clorambucil (12,5 ug / ml) ou chlorambUCIL exposta e ALA (15 ng / ml) tratada. 24 horas após a exposição, as células foram carregadas com TMRM durante 15 min e imediatamente fotografadas. (A) não impressionados CEE revelou um sinal distinto após marcação TMRM indicando um potencial de membrana mitocondrial intacta. Exposição (B) Clorambucil resultou numa redução significativa do sinal de TMRM. (C) O tratamento de expor-chlorambucil CEE com o ácido alfa-linolênico ROS-limpador restaurou o potencial de membrana mitocondrial. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Exposição dérmica a substâncias químicas tóxicas, muitas vezes resulta em desordem cicatrização de feridas graves. Os mecanismos subjacentes são em grande parte desconhecido. A cicatrização de feridas é um processo complexo que consiste em diferentes fases (hemostasia, inflamação, proliferação e remodelação). A migração celular está envolvida em cada fase, no entanto, é de extrema importância para a formação do tecido de granulação. Aqui, novos vasos sanguíneos são formados por angio- ou vasculogênese.
Ambos os processos exigem migração de precursor inalterado e células endoteliais iniciais. Avaliação da migração celular e entender os mecanismos subjacentes para a migração celular perturbado é altamente relevante, a fim de desenvolver novas estratégias terapêuticas contra doenças de cura tóxico induzida ferida.
A migração celular pode ser avaliada por abordagens diferentes. A técnica utilizada é o ensaio de câmara de Boyden, que foi originalmente introduzido para analisar anticorpo-antigen causada quimiotaxia em leucócitos 13. Este ensaio é um ensaio de ponto final quantitativa que reflecte a capacidade de invasão de células do compartimento superior da inserção de um Transwell ao compartimento inferior, em resposta a um quimioatractor. Na técnica aqui descrita, não quimioatraente foi adicionada à câmara inferior. Assim quimiocinese (migração aleatória sem uma chemoattractant específico) da CEE sob condição de controle ou em resposta a clorambucil foi investigada.
A inserção é constituído por uma membrana porosa que permite a migração de células de três dimensões através dos poros da membrana. O tamanho dos poros da membrana tem de ser escolhido em relação com o tamanho da célula: poros que são demasiado pequenos irá impedir completamente a migração de células, poros que são demasiado grande irá permitir passagem desimpedida de todas as células. Para células endoteliais início, um tamanho de poro de 8 um é recomendado. O uso de um tamanho de poro inadequado irá resultar em resultados reprodutíveis. Em order para adaptar o protocolo de células com propriedades diferentes como CEE, recomendamos começar com um tamanho de poro maior do que os núcleos e aumentar o tamanho de poro passo-a-passo, se necessário. Por exemplo, para as pequenas células, como os leucócitos é recomendado um tamanho de poro de 3 um.
Um problema crítico é a determinação do tempo de incubação até à análise. Ao longo do tempo, a proliferação celular (pelo menos, em grupos de controlo) terá lugar. Isto por sua vez vai amplificar o número de células que podem penetrar através da membrana, reduzindo potencialmente a sensibilidade do método: mesmo com capacidades migratórias ligeiramente prejudicada, as células podem ser capazes de migrar ao longo de grandes períodos de tempo. Assim, períodos longos (por exemplo, 24 h) não são recomendados para as células endoteliais. Por outro lado, se a incubação é muito curto após a sementeira de células, apenas pequenas quantidades de células vai ter passado a membrana. Uma incubação de 8 horas foi encontrado ideal. Após o tempo de incubação definido de 8 horas, as células dere fixadas, coradas e contadas manualmente.
Existem três abordagens possíveis para análise: (1) células na parte superior da membrana (que não migraram) são removidos por um cotonete. Em seguida, as células no lado inferior da membrana (células que migraram) são coradas quer com um citológico (por exemplo, hematoxilina) ou um corante fluorescente (por exemplo, DAPI) e são contadas. (2) Em alternativa, as células no lado inferior podem ser marcadas com um corante fluorescente em primeiro lugar e depois são separadas (por exemplo, através da utilização de tripsina). A fluorescência é depois quantificada através da utilização de um leitor de fluorescência. (3) Recomendamos a utilização de membranas porosas coloridos escuros que bloqueiam a transmissão de luz permitindo assim a diferenciação de células não-migrados (células no topo da membrana) e células que migraram (na parte inferior da membrana). Depois de coloração por fluorescência (corantes citológicas não pode ser usado), as células no lado inferior são contadas utilizando um microscópio de fluorescência. Não é importante para confound a orientação membrana. Usando uma membrana opaca obvia a necessidade de remover as células que não migraram. O uso de membranas opacas, marcação fluorescente e a contagem manual de células despejou superior às outras abordagens.
Em geral, o ensaio de câmara de Boyden é um ensaio que é fácil de manusear e, portanto, é frequentemente utilizado um ensaio para a avaliação da migração celular. No entanto, há duas desvantagens principais: (1) O ensaio de câmara de Boyden é um ensaio de ponto final. Isso significa que, se o ponto de tempo de análise é incorreta, o resultado pode ser enganosa. (2) O ensaio não é fácil de automatizar. No entanto, este ensaio é uma das ferramentas mais importantes para a avaliação da migração celular.
Em contraste com o ensaio de câmara de Boyden estática, o ensaio de cura de feridas (também referido como ensaio de anulação do diferencial ou ensaio de zero) é um ensaio dinâmico em tempo real. É um ensaio de duas dimensões, sem migração três movimentos de invasão celular dimensionais. Após "ferimento" de camadas de células com uma ponta de pipeta, as células migram para dentro do intervalo. O ensaio é simples de executar e evita os problemas de um ensaio de ponto final estático. No entanto, o ensaio tem alguns desafios: (1) um sistema de microscópio de imagem de células vivas (37 ° C, 5% de CO 2, com uma atmosfera humidif içada) é necessária. Certifique-se de que as placas de cultura de células não sequem. (2) aquisição de imagem Time-lapse irá resultar em grandes arquivos de dados, dependendo dos parâmetros (resolução, intervalo) utilizados. (3) Riscar a camada de células com uma ponteira não é tão fácil como pode parecer inicialmente. Muita pressão irá danificar a superfície prato que pode resultar em artefatos. Além disso, a largura da abertura pode ser diferente dentro do zero e pode diferir entre diferentes investigadores. Um investigador experiente é recomendado. (4) O número de amostras que podem ser executados em paralelo é limitada pelo equipamento. No entanto, a ferida ensaio de cura é outra ferramenta valiosa para a quantitativa e quaitative avaliação da migração celular. Informações sobre velocidade de migração, distância de migração, migração dirigida podem ser reunidos em uma configuração experimental. Rastreamento de celular em um sistema bidimensional não é muito difícil e pode ser realizado com o software de código aberto (por exemplo, ImageJ e MTrackJ).
O revestimento das placas de cultura de células não só é importante para a ligação de células, mas tem uma influência significativa sobre a função celular no que se refere à migração. As células endoteliais são rotineiramente cultivadas em 0,1% superfícies revestidas com gelatina. Uso de tona não-revestido para o cultivo de células endoteliais resultou numa diminuição da proliferação 14. Outros revestimentos (por exemplo, fibronectina) foram encontrados também adequado para o cultivo de curto prazo, no entanto, os revestimentos de gelatina mostrou um desempenho superior em experiências de cultivo a longo prazo 15.
Existem inúmeros corantes de fluorescência no mercado para imagens de células vivas. Temos chosen TMRM para investigar o potencial de membrana mitocondrial. Muitos outros corantes (por exemplo, JC-1, TMRE) apresentar um desempenho comparável. Em contraste com sondas monocromáticos (TMRM, TMRE), JC-1 desvios de fluorescência de verde para vermelho após acumulação nas mitocôndrias. Isto permite uma análise semi-quantitativa raciométrica do estado de polarização mitocondrial, mas dificulta experiências de coloração dupla (por exemplo, usando corantes Tracker para identificar as mitocôndrias) 16. Em nossa experiência o próprio corante é menos crítica para o experimento que a concepção experimental, manuseio e aquisição de células é um desafio e requer muito mais atenção. Quase todos os corantes fluorescentes são sensíveis à luz. Portanto, células de carga deve ser feita no escuro. Carregamento celular requer 15-30 min. O tempo de carregamento prolongado não resulta em aumento de sinais e não é recomendada. Embora os sinais específicos pode ser detectada após longos períodos de carregamento, o corante pode acumular-se no compartimento subcelularmentos ou pode até ser descarregada a partir do celular. Como consequência, as células devem ser carregado imediatamente antes da análise e não necessariamente no início da experiência. A concentração de carga de corante é geralmente na gama de 10 uM. No entanto, com TMRM concentrações muito inferiores (20 Nm) foram encontrados suficiente para rotulagem e ainda deram resultados razoáveis. Como mostrado na Figura 3 rotulagem 24 h pós-exposição clorambucil resultou numa perda nítida de potencial de membrana mitocondrial. Tratamento de clorambucil exposta CEE com ROS-sequestrantes foi capaz de manter o potencial de membrana mitocondrial às 24 h após a exposição inicial.
Em resumo, ensaio de câmara de Boyden, ferida ensaio de cura em combinação com a análise de faixas de células individuais são ferramentas valiosas para avaliar o comportamento de migração no que diz respeito a aspectos qualitativos e quantitativos. Rotulagem de potencial mitocondrial com TMRM pode ajudar a identificar os mecanismos subjacentes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Boyden Chamber | |||
| Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 3 µm | Corning Incorporated | #351151 | |
| Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 8 µm | Life Sciences | #351152 | |
| (for use with Falcon Insert 24 well Companion Plate (353504) | |||
| Wound healing assay | |||
| Glass bottom dishes | Word Precision Instruments, Inc. | #FD35-100 | |
| Assessment of mitochondrial potential | |||
| TMRM (tetramethylrhodamine methyl ester) | Life Technologies | #T669 | |
| Cell culture | |||
| Accutase | PAA, Pasching, Austria | # L11-007 | |
| α-Linolenic acid | Fluka (Sigma), Steinheim, Germany | # L2376 | |
| Chlorambucil | Fluka (Sigma), Steinheim, Germany | # 23125 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany | # G2500-100G |
References
- Bauer, S. M., Bauer, R. J., Velazquez, O. C. Angiogenesis, vasculogenesis, and induction of healing in chronic wounds. Vascular and Endovascular Surgery. 39, 293-306 (2005).
- Reinke, J. M., Sorg, H. Wound repair and regeneration. European Surgical Research. Europaische Chirurgische Forschung. Recherches Chirurgicales Europeennes. 49, 35-43 (2012).
- Hart, J. Inflammation. 1: Its role in the healing of acute wounds. Journal of Wound Care. 11, 205-209 (2002).
- Liu, Z. J., Hyperoxia Velazquez, O. C. endothelial progenitor cell mobilization, and diabetic wound healing. Antioxidants & Redox Signaling. 10, 1869-1882 (2008).
- Gallagher, K. A., Goldstein, L. J., Thom, S. R., Velazquez, O. C. Hyperbaric oxygen and bone marrow-derived endothelial progenitor cells in diabetic wound healing. Vascular. 14, 328-337 (2006).
- Kehe, K., Balszuweit, F., Steinritz, D., Thiermann, H. Molecular toxicology of sulfur mustard-induced cutaneous inflammation and blistering. Toxicology. 263, 12-19 (2009).
- Schmidt, A., et al. Nitrogen mustard (Chlorambucil) has a negative influence on early vascular development. Toxicology. 263, 32-40 (2009).
- Steinritz, D., et al. Effect of N-acetyl cysteine and alpha-linolenic acid on sulfur mustard caused impairment of in vitro endothelial tube formation. Toxicological Sciences. 118, 521-529 (2010).
- Steinritz, D., et al. Chlorambucil (nitrogen mustard) induced impairment of early vascular endothelial cell migration - Effects of alpha-linolenic acid and N-acetylcysteine. Chemico-biological Interactions. 219C, 143-150 (2014).
- Schmidt, A., et al. Influence of endostatin on embryonic vasculo- and angiogenesis. Developmental Dynamics : an Official Publication of the American Association of Anatomists. 230, 468-480 (2004).
- Dainiak, M. B., Kumar, A., Galaev, I. Y., Mattiasson, B. Methods in cell separations. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 106, 1-18 (2007).
- Wang, Y., et al. Regulation of VEGF-induced endothelial cell migration by mitochondrial reactive oxygen species. American Journal of Physiology. Cell physiology. 301, C695-C704 (2011).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
- Relou, I. A., Damen, C. A., van der Schaft, D. W., Groenewegen, G., Griffioen, A. W. Effect of culture conditions on endothelial cell growth and responsiveness. Tissue & Cell. 30, 525-530 (1998).
- Smeets, E. F., von Asmuth, E. J., vander Linden, C. J., Leeuwenberg, J. F., Buurman, W. A. A comparison of substrates for human umbilical vein endothelial cell culture. Biotechnic & Histochemistry : Official Publication of the Biological Stain Commission. 67, 241-250 (1992).
- Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. BioTechniques. 50, 98-115 (2011).
