Abstract
Exponering för kemiska ämnen (inklusive alkylerande kemiska stridsmedel som svavel- och kvävesenaps) orsaka en uppsjö av kliniska symtom inklusive sårläkningsstörning. Den fysiologiska sårläkningsprocessen är mycket komplex. Bildandet av granulationsvävnad är ett viktigt steg i denna process resulterar i en preliminär sårtillslutning och ger ett nätverk av nya kapillära blodkärl - antingen genom vaskulogenes (roman bildning) eller angiogenes (groning av befintliga fartyg). Både vasculo- och angiogenes kräver en funktionell, riktad migrering av endotelceller. Således är utredning av tidig endotelceller (EEG) migration viktigt att förstå patofysiologin av kemikalieberoende sårläkningsstörningar och eventuellt identifiera nya strategier för terapeutisk intervention.
Vi bedömde försämrad sårläkning efter alkyleringsmedel exponering och testade potentiella kandidatföreningar för treatment. Vi använde en uppsättning tekniker som beskrivs i detta protokoll. En modifierad Boyden kammare för att kvantitativt undersöka kemokines av EEG beskrivs. Dessutom är användningen av sårläknings analys i kombination med spåranalys för att kvalitativt utvärdera migrerings illustreras. Slutligen visar vi användning av fluorescerande färgämne TMRM för utredning av mitokondriell membranpotential för att identifiera bakomliggande mekanismer för störd cellmigration. Följande protokoll beskriver grundläggande tekniker som har anpassats för utredning av EEG.
Introduction
Cell migration är viktigt i många fysiologiska och patofysiologiska processer inklusive utveckling, olika sjukdomar och sårläkning efter hudskada.
Efter hudskada, avlägsnar inflammation skadade eller nekrotisk vävnad och granulering enheter preliminära sårtillslutning och möjliggör bildandet av ett nätverk av nya kapillärer genom vaskulogenes (ny formation) eller angiogenes (groning av befintliga vesiklar) 1-3. Både vasculo- och angiogenes kräver migration av endotelceller. Den växande nätverk av blodkärl är avgörande för att transportera syre och näringsämnen till prolifererande keratinocyter som slutligen genomgår keratinisering, bilda en ny epitel och ger sårtillslutning.
Nedsatt migration av endotelceller är en underliggande orsak till sårläkningsstörning 4,5. Således metoder bedöma migration av tidiga endotelceller är skyldiga att utforska pathophysiolnik av cellmigrationsstörningar och för att identifiera nya strategier för terapeutisk intervention.
Hudexponering för alkyleringsmedel (t.ex. svavel- och kvävesenaps) orsakar sårläknings sjukdom 6. Sådana föreningar användes som kemiska stridsmedel i flera konflikter i 20-talet och fortfarande anledning till stark oro på grund av befintliga lager i politiskt instabila regioner och relativt enkel syntes. Även senapsgas syntetiserades första gången 1822, är den molekylära och klinisk patologi SM exponeringen inte förstås i detalj och ingen antidot för SM exponering har identifierats.
Flera studier har gjorts för att förstå och modellera försämrad sårläkning efter SM exponering och för att testa potentiella kandidat föreningar med förmåga att reservera ett liknande resonemang. Schmidt et al., (2009) testade effekten av klorambucil, ett alkylerande förening med egenskaper liknande SM i mouSE embryoid karossmodeller och hittade en dramatisk, ibland mer än 99% minskning av kärlbildning 7. Denna negativa effekt var mest uttalad vid ett utvecklingsstadium, som, under fysiologiska betingelser, domineras av proliferationen och migreringen av vaskulära endoteliala prekursorceller. Således var dessa celler identifierades att vara särskilt känsliga för alkyleringsmedel. Steinritz et al., (2010) testade scavengers av reaktiva syreföreningar (ROS), särskilt, N-acetylcystein (NAC) och alfa-linolensyra (ALA) för deras förmåga att reducera SM toxicitet i mus embryoid karossmodeller och i synnerhet till återställa kärlbildning 8. Tillfälliga skyddande effekter observerades, vilket tyder på att alltför ROS bildning var sannolikt att bidra till de negativa effekterna av SM på sårläkning. Dessa effekter var inte permanent och de två kandidatföreningar kanske inte är möjligt att återställa kärlbildning och sårläkning på lång sikt 8. However, har dessa experiment i en komplex 3D-modell som tillät undersökning av cellmigration. Således vi sedan testade NAC och ALA för positiva effekter på cellmigration av EEG som har en nyckelroll i processen för kärlbildning 9.
Dessutom finns det bevis för att cellpolaritet krävs för cellmigration. Mitochondrial dysfunktion leder till ROS bildning visades försämra cellpolaritet och kan således negativt påverka cellmigration. Därför var levande cell imaging med avseende på mitokondriell funktion som utförs och effekterna av ROS asätare undersöktes. Följande protokoll beskriver allmänna krav för odling av EEG, kammar analysen Boyden, sårläknings analysen inklusive spårning cellanalys och användning av TMRM för bedömning av mitokondriefunktion i detalj. Viktiga aspekter av experimentella protokoll för EEG odling och migration är markerade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Följande protokoll beskriver tekniker för undersökning av tidiga endotelcellmigration. Den korrekta odling av vaskulära endotelceller kräver förbeläggning av cellodlingsflaskor med gelatin för att säkerställa korrekt proliferation och bibehållande av en endotel fenotyp.
1. Pre-beläggning av cellodlingsflaskor
- Upplös gelatin i 0,1 M PBS till en slutkoncentration av 0,1%.
- Autoklavera lösningen med parametrar för flytande autoklavering (för mer information se instruktioner för den specifika autoklav).
- Lägg tillräcklig volym av det autoklavegelatinlösningen till en steril cellkultur kolv (t.ex. åtminstone 5 ml för en T25 cellodlingskolv).
- Överför kolvarna i en inkubator (37 ° C, 5% CO 2 inte erfordras men inte stör) under minst 30 minuter.
- Ta bort den kvarvarande gelatinlösningen. Använd förbelagda kolvar senare (se cellodlingar) eller sslet under sterila betingelser fram till användning.
2. Cell Odling av tidiga endotelceller
Obs: Embryonala stamceller som härrör tidiga endotelceller (EEG) erhölls från differentierade murina embryoidkroppar genom magnetisk aktiverad cellsortering av PECAM-1 positiva cellfraktionen som tidigare beskrivits 10,11.
- Kultur EEG på gelatinbelagda cellodlingsskålar i DMEM kompletterat med 15% FCS, 50 U / ml penicillin, 50 U / ml streptomycin, 200 | iM L-glutamin, 100 | iM p-merkaptoetanol och 1% icke-essentiella aminosyror. Handtag celler under sterila förhållanden. Odla cellerna med 5% CO2 vid 37 ° C och 95% luftfuktighet tills sub-konfluens (max. 80%).
- Vid underflödet, dela cellerna vid en 1: 5-förhållande. Obs: avlossning av endotelceller är ett kritiskt steg.
- Skörda cellerna med RT Accutase. Ta bort materialet, skölj med PBS och tillsätt 1 ml Accutase per 25 cm
- Inkubera kolven vid RT under 2-10 min tills cellerna har lossnat. Skingra cellerna och överföra dem till önskat program. Anmärkning: En kemisk neutralisering av Accutase krävs inte eftersom den äger rum när de sådda cellerna lagras i inkubator vid 37 ° C. Däremot kan Accutase aktivitet även minskas genom att tillsätta DMEM innehållande FCS.
- Skörda cellerna med RT Accutase. Ta bort materialet, skölj med PBS och tillsätt 1 ml Accutase per 25 cm
3. Boyden-kammare
Obs: Boyden kammar analyser utförs med hjälp av ljus ogenomskinlig polyetylentereftalat insatssystem med 8 pm porstorlek.
- Pre-coat filterinsatser (som får plats i cellodlingsbrunnar vilket skapar en Boyden kammare) genom att lägga till 500 l 0,1% gelatin upplöst i 0,1 M PBS under minst 30 minuter.
- Om cellerna är att utsättas för giftiga kemikalier, exponera beroende på den specifika experimentella utformningen före cellskörd. Obs: Celler exponerades för 12,5 mikrogram klorambucil / ml DMEMunder 24 h. När det gäller den specifika experimentell design, kan instruktioner variera.
- Harvest EEG och bestämma cellantalet med en räkningscellkammare. Obs: Automatiska räkningsanordningar kan användas, men bör användas med försiktighet: manuell cellräkning är mer exakt och rekommenderas starkt.
- Tillsätt 500 l cellodlingsmedium i den undre kammaren facket på Boyden avdelningen.
- Tillsätt exakt 10 4 EEG 500 l cellodlingsmedium per filterinsats i den övre kammaren facket. Eliminera bubblor.
- Inkubera filterinsatser i inkubatorn för exakt 8 timmar.
- Skölj med PBS en gång och ersätta mediet med 0,5 ml 4% paraformaldehyd i båda fack för 25 min för cellfixering. Tvätta filtret omfattande men åtminstone tre gånger med 0,1 M PBS.
- Excidera membranen med en skalpell.
- Montera membranet mellan två täckglas med monteringsmedium innehållande DAPI för kärn staining. Var uppmärksam på orienteringen. Säkerställa att endast celler som har migrerat mot den undre avdelningen sidan av membranet räknas.
- Räkna celler som har migrerat mot den undre avdelningen sidan av membranet med ett fluorescensmikroskop vid 400X förstoring. Blanda inte ihop membranporerna med migrerade celler (Figur 1A, 1B). Undersök ett rimligt antal biologiska replikat (minst tre biologiska replikat per betingelse).
4. Sårläkningsanalys
- Beroende på tillgänglig utrustning, noggrant välja cellodlingsskålar eller plattor: När du använder DIC mikroskopi, undvika plastyta baserad odlingsskålar eller brunnsplattor men använder glas baserade enheter i stället.
Obs: Om du använder faskontrastmikroskopi, kan plastbaserade rätter också användas. - Odla EEG i ett lämpligt cellodlingsanordning (t.ex. 4 cm glas botten petriskål som lämpar sig för levande cell imaging) Tills 80% konfluens. Viktigt: inte odla cellerna för att slutföra sammanflödet.
- Skrapa monoskikten med sterila 10 pl pipettspetsar. Tryck spetsen försiktigt utan alltför mycket tryck på diskytan och flytta den i en rak linje smidigt från ena sidan till den other.Wash cellerna två gånger med 0,1 M PBS för att avlägsna lösgjorda celler.
- Lägg till en tillräcklig volym medium till odlingsskål. I förekommande fall, lägga föreningar som bör undersökas.
Anm: 1,5 ml medium innehållande 15 ng / ml alfa linolensyra tillsattes. - Montera kulturen skålen under ett mikroskop kan levande cell imaging. Se till 5% CO2, 37 ° C och en fuktig atmosfär.
Obs: Befuktning är särskilt viktigt att undvika medel avdunstning. - Förvärva tidsförlopp bilder under 24 timmar vid 10 minuters intervall. Plan för stora filstorlekar. Obs: En upplösning på 512 x 512 pixlar är vanligtvis tillräckligt; dock rekommenderar vi att du använder bilder, varav minst 1,024 x 1,024.
- Mät spaltbredden vid t = 0 h och vid t = 24 h med hjälp av längden verktyg för den programvara som medföljer mikroskopet eller använda öppen källkod (t.ex. ImageJ). Obs: I allmänhet viss bild insamling och analys programvara tillhandahålls av tillverkaren. Därför, för tekniska detaljer angående användningen av programvaran, se manualen.
5. Cellspårning
- Beroende på tillgänglig utrustning, noggrant välja cellodlingsskålar eller plattor: När du använder DIC mikroskopi, undvika plastyta baserad odlingsskålar eller brunnsplattor men använder glas baserade enheter i stället.
Obs: Om du använder faskontrastmikroskopi, kan plastbaserade rätter också användas. - Seed 5 x 10 4 EEG kompletteras DMEM i en lämplig cellkultur enhet (t.ex. 24-flerkällsplatta) och odla cellerna med 5% CO2 vid 37 ° C och 95% luftfuktighet i 1-2 dagar.
- När cellerna har vuxit upp till en 80% Sammanflödet, ta bort media och kultur cellerna med nya medier i närvaro av respektive testsubstanser (t.ex. 12,5 mikrogram klorambucil / ml DMEM). Inkludera alltid kontrollceller (behandlade med lösningsmedel, t.ex. etanol) vid 37 ° C under en viss tid (24 timmar, beroende på den enskilda analyssystem).
- Montera odlingsskålen under ett mikroskop med förmåga att levande cell imaging (37 ° C, 5% CO2 och 95% fuktighet). Förvärva tidsförlopp bilder över 24 timmar vid fördefinierade intervall. Förvärva bilder på 10 minuters intervall.
- Utför manuellt spåra av EEG med hjälp av ImageJ plugin MTrackJ. Välj 10 celler slumpmässigt ur synfältet och spåra deras rörelser genom att lägga till en datapunkt per tidpunkt med hjälp av "Lägg till" behärskar MTrackJ.
Obs: MTrackJ är tillgänglig gratis på och ImageJ finns tillgänglig [Meijering, Mtrackj "http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/".]le på [Rasband, ImageJ. "http://rsbweb.nih.gov/ij/"]. En detaljerad handbok om MTrackJ plugin finns på "http://www.imagescience.org".
6. Levande cell imaging / Bedömning av mitokondriell membranpotential
- Odla EEG i ett lämpligt cellodlingsanordning (t.ex. 4 cm glas botten petriskål som lämpar sig för levande cell imaging) upp till 80% sammanflödet.
Viktigt: Inte odla cellerna för att slutföra sammanflödet. - I förekommande fall, utsätta cellerna för kemikalier. Not: Celler exponerades för 12,5 ^ g / ml klorambucil för 24 timmar. När det gäller den specifika experimentell design, kan instruktioner variera.
- Förbered en 10 mM stamlösning av tetrametylrodamin (TMRM) i DMSO. Skyddas från ljus. Obs: Förrådslösningen kan lagras vid -20 ° C.
- Späd stamlösningen i cellodlingsmedium till en arbetslösning med en koncentration av 10 ^ M (1: 1000 utspädning). Skyddas från ljusoch använda så snart som möjligt. Obs: Den arbetslösning kan hållas vid rumstemperatur under en tid (> 1 timme), men framställningen av en färsk arbetslösning rekommenderas starkt.
- Lägg 2 il av den verksamma lösningen till 1 ml färskt cellkulturmedium (lastning lösning).
- Ladda cellerna genom att ersätta cellkulturmedium med laddningslösningen. Inkubera i 15 minuter vid 37 ° C, 5% CO2 och fuktig atmosfär (inkubator). Varning: Nästan alla fluorescensindikatorer exporteras av levande celler över tiden; därför undvika långvarig belastning eller fördröjd analys.
- Utan tvättning, placera skålen under ett mikroskop som lämpar sig för levande cell imaging. Viktigt: fluorescensindikatorer är mycket känsliga för ljus, därför undvika onödig ljusexponering.
- Förvärva bilder utan att ändra ackvisitionsparametrar att säkerställa jämförbarhet mellan olika bilder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hudexponering för alkyleringsmedel provocerar rodnad, blåsbildning och dermal ulceration som är associerad med en sårläkande störning. Sårläkning kräver angio- och vaskulogenes som bygger på migration av endotelceller. Kvantitativ migration kan bedömas med hjälp av kammar analysen Boyden. Som visas i figur 1C exponering av EEG alkyleringsmedlet klorambucil resulterade i en signifikant minskning av cellmigration 9. Tillsats av ROS-renhållare alfa-linolensyra (ALA) direkt efter exponering för klorambucil under 24 timmar räddade avsevärt denna fenotyp, nästan till kontrollnivåer.
Den Boyden kammaranalys är ett lämpligt verktyg för att bedöma hur många (kvantitet) av migrerade celler. Däremot analysen inte ge information om vandringsbeteende av cellerna. Figur 2 visar att oexponerad EEG har möjlighet att överbrygga klyftan i såret och helande assay inom 24 timmar 9. Däremot EEG utsätts för alkyleringsmedlet klorambucil inte kunde överbrygga klyftan i sårläknings analysen 9. Dessutom cell spårning av gemensamt EEG visade att under påverkan av klorambucil riktad rörelse inte observerades 9. Behandling av EEG ROS-asätare kunde återställa riktad cellmigration 9.
Mitokondrie ROS bildning har associerats med nedsatt cellmigration 12. Som visas i Figur 3 exponering av EEG till klorambucil resulterade i fördelningen av mitokondriell membranpotential 9. Behandling av EEG ROS-renhållare förhindrade mitokondriell skada och underhålls den mitokondriella membranpotential.
Sammanfattningsvis, alla metoder som beskrivs i protokollet avsnitt är lämpliga verktyg för att bedöma cellmigration. Resultaten på förlust eller bevarandet av mitokondriell membranpotential kan ge valuable tips om de bakomliggande molekylära mekanismer av nedsatt cellmigration.
Figur 1. Boyden kammaranalys. (A) EEG såddes på Boyden kammarfilterinsatser, inkuberades under 8 h, fixerades och färgades med DAPI. Asterisker indikerar migrerade EEG. I den presenterade bilden totalt 19 celler kan räknas (Figur 1B). Röda pilspetsar indikerar celler som inte har migrerat över insatsen helt eller som inte är helt i synfältet och därmed uteslöts från cellräkning. (B) Porerna (8 ^ m) i membranet blir synliga vid användning av långa exponeringstider för bildinhämtning. Inte förväxla dem med migrerade celler. (C) Under kontrollbetingelser i genomsnitt 212 celler migrerade genom membranet. Klorambucil exponering resulterade i endast 128 migrerade celler. Behandling av klorambucil exponerade EEG med ROS-renhållare alfa-linolensyra (ALA) signifikant räddade cellmigration. Symboler representerar individuella resultat från en filterinsats. Svarta horisontella staplar anger medel (n = 4), felstaplar visar SD och asterisker visar på betydande skillnader. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. sårläknings analys / spårning cell. EEG var skenbehandlade (utbyte av medium) eller utsättas för 12,5 mikrogram / ml klorambucil. Efter repor, celler were undersöktes under 24 timmar. (A) EEG kunde överbrygga klyftan i sårläknings analysen inom 24 timmar medan klorambucil utsätts EEG inte kunde överbrygga klyftan. Behandling med ALA resulterade i en signifikant förbättring av cellmigration. (B) Medelvärden från tre oberoende experiment med vardera fem tekniska replikat per grupp (n = 15 per grupp) visas. Felstaplar representerar standardavvikelser och asterisker indikerar statistiska signifikanta skillnader (envägs ANOVA, p <0,05). Modifierad från Steinritz et al. (2014) 9. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Bedömning av mitokondriell membranpotential. EEG var skenbehandlade, utsätts för klorambucil (12,5 mikrogram / ml) eller chlorambUCIL exponerad och ALA (15 ng / ml) behandlas. 24 h efter exponering, var cellerna laddade med TMRM under 15 minuter och omedelbart avbildas. (A) oexponerad EEG visade en tydlig signal efter TMRM märkning som anger en felfri mitokondriell membranpotential. (B) Chlorambucil exponering resulterade i en signifikant minskning av TMRM signalen. (C) Behandling av klorambucil-exponerade EEG med ROS-renhållare alfa linolensyra återställde mitokondriell membranpotential. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dermal exponering för giftiga kemikalier resulterar ofta i svår sårläkning sjukdom. De bakomliggande mekanismerna är i stort sett okända. Sårläkning är en komplex process som består av olika faser (hemostas, inflammation, spridning och remodeling). Cellmigration är involverad i varje fas, är det emellertid av största betydelse för bildandet av granulationsvävnad. Här är nya blodkärl bildas antingen genom angio- eller vaskulogenes.
Båda processerna kräver opåverkad migration av föregångaren och tidiga endotelceller. Bedömning av cellmigration och klargöra de bakomliggande mekanismerna för störd cellmigration är mycket relevant för att utveckla nya behandlingsstrategier mot gift inducerad sårläkningsstörningar.
Cellmigration kan bedömas genom olika metoder. En ofta använd teknik är kammaren analysen Boyden som ursprungligen infördes för att analysera antikropps antigsv orsakade kemotaxi på leukocyter 13. Denna analys är en kvantitativ slutpunktsanalys som återspeglar invasionen kapaciteten av celler från det övre utrymmet av en transwell insatsen till det nedre utrymmet som svar på en kemo-attraherande. I den teknik som beskrivs häri har ingen chemoattractant sattes till den undre kammaren. Således kemokines (slumpvis migration utan en specifik kemoattraktant) i EEG under kontroll tillstånd eller som svar på klorambucil undersöktes.
Insatsen består av ett poröst membran som tillåter tredimensionell cellmigrering genom porerna i membranet. Porstorleken hos membranet måste väljas i förhållande till cellstorleken: porer som är för små kommer att förhindra cellmigrering fullständigt, porer som är för stora kommer att tillåta obehindrad passage av alla celler. För tidig endotelceller, är en porstorlek av 8 ^ m rekommenderas. Användningen av en olämplig porstorlek resulterar i reproducerbara resultat. In order att anpassa protokollet till celler med olika egenskaper som EEG, rekommenderar vi att du börjar med en porstorlek större än kärnorna och öka porstorlek steg-för-steg vid behov. Till exempel för små celler som leukocyter en porstorlek av 3 ^ m rekommenderas.
En kritisk fråga är bestämningen av inkubationstiden tills analys. Med tiden kommer cellproliferation (åtminstone i kontrollgrupper) äger rum. Detta i sin tur kommer att amplifiera antalet celler som kan tränga genom membranet och eventuellt reducera känsligheten hos förfarandet: även med något nedsatt flytt förmågor kan celler kunna migrera över långa tidsperioder. Därför är långa perioder (t.ex. 24 h) rekommenderas inte för endotelceller. Å andra sidan, om inkuberingen är för kort efter cellsådd, endast mindre mängder av celler kommer att ha passerat membranet. En åtta timmars inkubation befanns optimalt. Efter den definierade inkubationstid på 8 timmar, celler are fast, färgade och manuellt räknades.
Det finns tre möjliga metoder för analys: (1) celler på toppen av membranet (som inte har migrerat) tas bort av en bomullstopp. Då cellerna på bottensidan av membranet (migrerade celler) färgas antingen med en cytologisk (t.ex., hematoxylin) eller ett fluorescerande färgämne (t.ex. DAPI) och räknas. (2) Alternativt kan celler på undersidan färgas med ett fluorescerande färgämne första och lösgörs efteråt (t.ex., genom användning av trypsin). Fluorescens kvantifieras sedan genom användning av en fluorescensläsare. (3) Vi rekommenderar användning av mörkt färgade porösa membran som blockerar ljustransmissionen därigenom medge differentiering av icke-migrerade celler (celler på toppen av membranet) och migrerade celler (på undersidan av membranet). Efter fluorescensfärgning (kan cytologiska färgämnen inte användas) celler på bottensidan räknas med användning av ett fluorescensmikroskop. Det är viktigt att inte confound membran orientering. Använda ett ogenomskinligt membran undanröjer behovet av att avlägsna icke-migrerade celler. Användningen av ogenomskinliga membran, fluorescerande färgning och manuell cellräkning har visat sig överlägsen de andra metoderna.
I allmänhet, är kammaranalys Boyden en analys som är lätt att hantera och därför är det ett ofta använt test för bedömning av cellmigration. Det finns dock två stora nackdelar: (1) Den Boyden kammaranalys är en endpoint analys. Det innebär att om tidpunkten för analys är felaktig, kan resultatet vara missvisande. (2) Analysen är inte lätt att automatisera. Icke desto mindre är denna analys en av de mest värdefulla verktyg för utvärdering av cellmigration.
I motsats till den statiska Boyden kammaranalys, sårläknings analys (även hänvisad till som lucka tillslutnings analys eller repa-analys) är en dynamisk analys i realtid. Det är en tvådimensionell migrering analysen utan tredimensionella cellinvasionsrörelser. Efter "sårade" av cellskikt med en pipettspets, celler migrerar in i gapet. Analysen är enkel att utföra och undviker problemen med en statisk slutpunkt analys. Dock har analysen vissa utmaningar: (1) en levande cell imaging mikroskopisk systemet (37 ° C, 5% CO2 med fuktig atmosfär) krävs. Se till att cellodlingsskålar inte torkar ut. (2) Time-lapse bild förvärv kommer att resultera i stora datafiler beroende på parametrarna (upplösning, intervall) används. (3) Skrapa cellskiktet med en pipett tips är inte så lätt som det först kan verka. Alltför mycket tryck kan skada diskytan vilket kan leda till artefakter. Dessutom kan spaltbredden skiljer sig i grunden och kan skilja sig mellan olika utredare. En erfaren utredare rekommenderas. (4) Antalet prover som kan köras parallellt begränsas av utrustningen. Icke desto mindre är sårläknings analysen annan värdefullt verktyg för den kvantitativa och qualitative bedömning av cellmigration. Information om migrationshastighet, migration avstånd, kan riktad migration samlas i en experimentuppställning. Cell spårning i ett tvådimensionellt systemet är inte särskilt svårt och kan utföras med öppen källkod (t.ex. ImageJ och MTrackJ).
Beläggning av cellodlings rätter är inte bara viktigt för cellbindning, men har en betydande påverkan på cellulär funktion när det gäller migration. Endotelceller rutinmässigt odlas på 0,1% gelatinbelagda ytor. Användning av icke-belagda ytan för odling endotelceller resulterat i minskad proliferation 14. Andra beläggningar (t.ex. fibronektin) konstaterades även lämplig för korttidsodling, dock gelatinbeläggningar visade överlägsen prestanda i långsiktiga odlingsförsök 15.
Det finns många fluorescens färgämnen på marknaden för levande cell imaging. Vi har chosen TMRM att undersöka mitokondriell membranpotential. Många andra färgämnen (t.ex. JC-1, TMRE) uppvisar jämförbara prestanda. I motsats till monokromatiska sonder (TMRM, TMRE), JC-1 fluorescens skiftar från grönt till rött efter ackumulering i mitokondrierna. Detta möjliggör en ratiometrisk halv kvantitativ analys av mitokondrie polarisationstillståndet men hämmar dubbla färgningsexperiment (t.ex. för att med hjälp av tracker färgämnen identifiera mitokondrier) 16. I vår erfarenhet färgämnet i sig är mindre kritisk för experimentet medan experimentell design, hantering cell och förvärv är utmanande och kräver mycket mer uppmärksamhet. Nästan alla fluorescerande färgämnen är ljuskänsliga. Därför bör cellbelastning göras i mörker. Cellbelastning kräver 15-30 min. Förlängd laddningstid inte resulterar i ökade signaler och rekommenderas inte. Även om specifika signaler kunde detekteras efter långa last perioder, kan färgämnet ackumuleras i subcellulär utrymmetringar eller kanske till och med ut från cellen. Som en följd av detta bör celler laddas strax före analys och inte nödvändigtvis vid början av experimentet. Färgämnet lastning koncentrationen är vanligtvis i området av 10 ^ M. Men med TMRM mycket lägre koncentrationer (20 nm) funnit tillräckliga för märkning och fortfarande gav rimliga resultat. Såsom visas i fig 3 märkning 24 timmar efter klorambucil exponering resulterade i en distinkt förlust av mitokondriell membranpotential. Behandling av klorambucil utsätts EEG ROS-asätare kunde upprätthålla mitokondriell membranpotential på 24 timmar efter den första exponeringen.
Sammanfattningsvis Boyden kammaranalys, sårläknings analys i kombination med en enda cell spår analys värdefulla verktyg för att bedöma migrationsbeteende när det gäller kvalitativa och kvantitativa aspekter. Märkning av mitokondriell potential med TMRM kan hjälpa till att identifiera bakomliggande mekanismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Boyden Chamber | |||
| Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 3 µm | Corning Incorporated | #351151 | |
| Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 8 µm | Life Sciences | #351152 | |
| (for use with Falcon Insert 24 well Companion Plate (353504) | |||
| Wound healing assay | |||
| Glass bottom dishes | Word Precision Instruments, Inc. | #FD35-100 | |
| Assessment of mitochondrial potential | |||
| TMRM (tetramethylrhodamine methyl ester) | Life Technologies | #T669 | |
| Cell culture | |||
| Accutase | PAA, Pasching, Austria | # L11-007 | |
| α-Linolenic acid | Fluka (Sigma), Steinheim, Germany | # L2376 | |
| Chlorambucil | Fluka (Sigma), Steinheim, Germany | # 23125 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany | # G2500-100G |
References
- Bauer, S. M., Bauer, R. J., Velazquez, O. C. Angiogenesis, vasculogenesis, and induction of healing in chronic wounds. Vascular and Endovascular Surgery. 39, 293-306 (2005).
- Reinke, J. M., Sorg, H. Wound repair and regeneration. European Surgical Research. Europaische Chirurgische Forschung. Recherches Chirurgicales Europeennes. 49, 35-43 (2012).
- Hart, J. Inflammation. 1: Its role in the healing of acute wounds. Journal of Wound Care. 11, 205-209 (2002).
- Liu, Z. J., Hyperoxia Velazquez, O. C. endothelial progenitor cell mobilization, and diabetic wound healing. Antioxidants & Redox Signaling. 10, 1869-1882 (2008).
- Gallagher, K. A., Goldstein, L. J., Thom, S. R., Velazquez, O. C. Hyperbaric oxygen and bone marrow-derived endothelial progenitor cells in diabetic wound healing. Vascular. 14, 328-337 (2006).
- Kehe, K., Balszuweit, F., Steinritz, D., Thiermann, H. Molecular toxicology of sulfur mustard-induced cutaneous inflammation and blistering. Toxicology. 263, 12-19 (2009).
- Schmidt, A., et al. Nitrogen mustard (Chlorambucil) has a negative influence on early vascular development. Toxicology. 263, 32-40 (2009).
- Steinritz, D., et al. Effect of N-acetyl cysteine and alpha-linolenic acid on sulfur mustard caused impairment of in vitro endothelial tube formation. Toxicological Sciences. 118, 521-529 (2010).
- Steinritz, D., et al. Chlorambucil (nitrogen mustard) induced impairment of early vascular endothelial cell migration - Effects of alpha-linolenic acid and N-acetylcysteine. Chemico-biological Interactions. 219C, 143-150 (2014).
- Schmidt, A., et al. Influence of endostatin on embryonic vasculo- and angiogenesis. Developmental Dynamics : an Official Publication of the American Association of Anatomists. 230, 468-480 (2004).
- Dainiak, M. B., Kumar, A., Galaev, I. Y., Mattiasson, B. Methods in cell separations. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 106, 1-18 (2007).
- Wang, Y., et al. Regulation of VEGF-induced endothelial cell migration by mitochondrial reactive oxygen species. American Journal of Physiology. Cell physiology. 301, C695-C704 (2011).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
- Relou, I. A., Damen, C. A., van der Schaft, D. W., Groenewegen, G., Griffioen, A. W. Effect of culture conditions on endothelial cell growth and responsiveness. Tissue & Cell. 30, 525-530 (1998).
- Smeets, E. F., von Asmuth, E. J., vander Linden, C. J., Leeuwenberg, J. F., Buurman, W. A. A comparison of substrates for human umbilical vein endothelial cell culture. Biotechnic & Histochemistry : Official Publication of the Biological Stain Commission. 67, 241-250 (1992).
- Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. BioTechniques. 50, 98-115 (2011).
