Abstract
Blootstelling aan chemische stoffen (met inbegrip van alkylerende chemische strijdmiddelen zoals zwavel en stikstof mosterd) veroorzaken een overvloed aan klinische symptomen, waaronder wondgenezing stoornis. De fysiologische proces van wondgenezing is zeer complex. De vorming van granulatieweefsel is een belangrijke stap in dit proces resulteert in een eerste wondsluiting en leveren van een netwerk van nieuwe capillaire bloedvaatjes - hetzij door vasculogenese (novel vorming) of angiogenese (ontspruiten van bestaande schepen). Zowel vasculo- en angiogenese vereisen een functionele, geregisseerd migratie van endotheelcellen. Aldus onderzoek vroege endotheelcellen (EEG) migratie van belang de pathofysiologie van chemische geïnduceerde aandoeningen wondgenezende begrijpen en om potentieel nieuwe strategieën te identificeren voor therapeutische interventie.
We beoordeeld verstoorde wondgenezing na alkylerende blootstelling middel en getest potentiële kandidaat-verbindingen voor treatment. We gebruikten een reeks technieken die in dit protocol. Een gewijzigde Boyden kamer om kwantitatief onderzoek chemokinesis van EEG wordt beschreven. Bovendien wordt het gebruik van de wondgenezende assay in combinatie met track analyse kwalitatieve evaluatie migratie toegelicht. Tenslotte tonen we het gebruik van de fluorescente kleurstof TMRM voor het onderzoeken van mitochondriale membraanpotentiaal onderliggende mechanismen van verstoorde celmigratie identificeren. Het volgende protocol beschrijft de basistechnieken die zijn aangepast voor het onderzoek van de EEG.
Introduction
Celmigratie is belangrijk in vele fysiologische en pathofysiologische processen zoals ontwikkeling, verschillende ziekten, en wondheling bij huidletsel.
Na de huid letsel, ontsteking verwijdert beschadigd of necrotische weefsel en granulatie drives voorlopige wond sluiting en maakt de vorming van een netwerk van nieuwe haarvaten door middel vasculogenese (roman vorming) of angiogenese (kiemen van bestaande blaasjes) 1-3. Zowel vasculo- en angiogenese vereisen migratie van endotheelcellen. De groeiende netwerk van bloedvaten is essentieel om zuurstof en voedingsstoffen transporteren naar prolifererende keratinocyten die uiteindelijk ondergaan keratinisatie, vormen een nieuw epitheel en bieden wondsluiting.
Verminderde migratie van endotheliale cellen is een onderliggende oorzaak van wondgenezende stoornis 4,5. Aldus methoden te beoordelen migratie van endotheelcellen vroege moeten de pathophysiol verkennengie van celmigratie aandoeningen en om nieuwe strategieën te identificeren voor therapeutische interventie.
Dermale blootstelling aan alkylerende middelen (bijvoorbeeld zwavel en stikstof mosterds) veroorzaakt wondgenezende aandoening 6. Dergelijke verbindingen werden gebruikt als chemische oorlogsvoering agenten in verschillende conflicten in de 20e eeuw en blijft reden voor grote bezorgdheid als gevolg van de bestaande voorraden in politiek instabiele regio's en de relatief eenvoudige synthese. Hoewel zwavelmosterd eerst werd gesynthetiseerd in 1822, is de moleculaire en klinische pathologie van SM blootstelling niet begrepen in detail en geen antidotum voor SM blootstelling is geïdentificeerd.
Verschillende studies zijn uitgevoerd om te begrijpen en te modelleren vertraagde wondgenezing na blootstelling SM en te testen op potentiële kandidaat-verbindingen kunnen reserveren daartoe. Schmidt et al. (2009) het effect van chloorambucil, een alkyleringsverbinding met eigenschappen vergelijkbaar met SM in mou getestse embryoid body modellen en vond een dramatische, soms meer dan 99% verlaging van vat 7. Dit nadelige effect is het meest uitgesproken in een ontwikkelingsstadium dat onder fysiologische omstandigheden wordt gedomineerd door de proliferatie en migratie van vasculaire endotheliale voorlopercellen. Aldus werden deze cellen geïdentificeerd bijzonder gevoelig alkyleringsmiddelen zijn. Steinritz et al. (2010) testte vangers van reactieve zuurstof species (ROS), in het bijzonder N-acetylcysteïne (NAC) en alfa-linoleenzuur (ALA) op hun vermogen SM toxiciteit verminderen muizen embryoiden lichaam modellen en met name herstellen bloedvatvorming 8. Tijdelijke beschermende effecten werden waargenomen, wat aangeeft dat overmatige ROS formatie kunnen bijdragen tot de nadelige effecten van SM op wondgenezing. Deze effecten waren niet permanent en de twee kandidaat-verbindingen niet kunnen herstellen vat en wondgenezing op lange termijn 8 zijn. However, die experimenten werden uitgevoerd in een complexe 3D model dat toeliet onderzoeken celmigratie. Zo hebben we vervolgens getest NAC en ALA voor gunstige effecten op celmigratie van EEG die een belangrijke rol in het proces van het vat 9 heeft.
Bovendien zijn er aanwijzingen dat celpolariteit nodig is voor celmigratie. Mitochondriale dysfunctie wat leidt tot de vorming van ROS werd aangetoond dat celpolariteit schaden en kan dus nadelig beïnvloeden celmigratie. Daarom live cell imaging wat mitochondriale functie werd uitgevoerd en de effecten van ROS scavengers onderzocht. Het volgende protocol beschrijft de algemene eisen voor de teelt van de EEG, de Boyden kamer assay, de wondgenezing assay waaronder cell tracking-analyse en het gebruik van TMRM voor de beoordeling van de mitochondriale functie in detail. Belangrijke aspecten van de experimentele protocollen voor EEG teelt en migratie worden gemarkeerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het volgende protocol beschrijft technieken voor het onderzoeken van vroege endotheliale celmigratie. De juiste kweken van vasculaire endotheelcellen vereist pre-coating van celkweekkolven met gelatine juiste proliferatie en instandhouding van een endotheliaal fenotype waarborgen.
1. Pre-coating van celkweekkolven
- Los gelatine in 0,1 M PBS tot een eindconcentratie van 0,1%.
- Autoclaaf de oplossing met parameters voor vloeibare autoclaaf (voor details zie de handleiding van de specifieke autoclaaf).
- Voeg voldoende hoeveelheid van de geautoclaveerde gelatine oplossing voor een steriele celkweekkolf (bijvoorbeeld ten minste 5 ml voor een T25 celkweek kolf).
- Breng de kolven in een incubator (37 ° C, is 5% CO 2 niet vereist, maar heeft geen invloed) gedurende ten minste 30 min.
- Verwijder het resterende gelatineoplossing. Gebruik de pre-coated flesjes vervolgens (zie cel kweek) of sscheurde onder steriele omstandigheden tot gebruik.
2. Cell Teelt van Early endotheelcellen
Opmerking: Embryonale stamcellen afgeleide vroege endotheelcellen (EEG) werden op basis van afzonderlijke muizen embryoïde lichamen verkregen door magnetische-geactiveerde celsortering van PECAM-1 positieve celfractie zoals eerder beschreven 10,11.
- Culture EEG-gelatine beklede celcultuurschalen in DMEM gesupplementeerd met 15% FCS, 50 U / ml penicilline, 50 U / ml streptomycine, 200 uM L-glutamine, 100 uM ß-mercaptoethanol en 1% niet-essentiële aminozuren. Behandel cellen onder steriele omstandigheden. Cultiveren van de cellen met 5% CO2 bij 37 ° C en 95% luchtvochtigheid tot sub-confluentie (max. 80%).
- Bij bijna-confluentie splitsing van de cellen bij een 1: 5 verhouding. Opmerking: Onthechting van endotheelcellen is een cruciale stap.
- Oogst de cellen met RT Accutase. Verwijder de media, spoelen met PBS en voeg 1 ml Accutase per 25 cm
- Incubeer de kolf bij kamertemperatuur gedurende 2-10 min totdat de cellen losgemaakt. De verspreiding van de cellen en overbrengen naar de gewenste toepassing. Opmerking: Een chemische neutralisatie van het Accutase is niet vereist als het plaatsvindt wanneer de geënte cellen opgeslagen in de incubator bij 37 ° C. Echter, Accutase activiteit ook worden verminderd door toevoeging van DMEM bevattende FCS.
- Oogst de cellen met RT Accutase. Verwijder de media, spoelen met PBS en voeg 1 ml Accutase per 25 cm
3. Boyden Kamer
Opmerking: Boyden kamer assays worden uitgevoerd met behulp van licht ondoorlaatbare polyethyleentereftalaat insert systemen 8 urn poriegrootte.
- Pre-coat de filterelementen (die passen in celkweek putjes zodat een Boyden-kamer) Door toevoeging van 500 gl 0,1% gelatine, opgelost in 0,1 M PBS gedurende ten minste 30 min.
- Wanneer cellen worden blootgesteld aan toxische chemicaliën blootstellen volgens de specifieke experimentele opzet voor verzamelen van cellen. Opmerking: De cellen werden blootgesteld aan 12,5 ug chloorambucil / ml DMEMgedurende 24 uur. Wat de specifieke experimentele opzet, kunnen instructies variëren.
- Harvest EEG en bepalen het aantal cellen met behulp van een telling cel kamer. Opmerking: Het automatische tellen apparaten kunnen worden gebruikt, maar moet met voorzichtigheid worden gebruikt: handmatig cel tellen is nauwkeuriger en wordt sterk aanbevolen.
- Voeg 500 ul celkweek medium in de onderste kamer compartiment van de Boyden kamer.
- Voeg exact 10 4 EEG in 500 pi celkweekmedium per filter insert in de bovenste kamer compartiment. Elimineer bubbels.
- Incubeer de filter inserts in de incubator voor precies 8 uur.
- Spoelen met PBS eens en vervang het medium met 0,5 ml 4% paraformaldehyde in beide vakken voor 25 min voor mobiele fixatie. Was het filter uitgebreid maar minstens 3 maal met 0,1 M PBS.
- Uitsnijden van de membranen met een scalpel.
- Monteer het membraan tussen twee glazen dekglaasjes met montage medium met DAPI voor nucleaire staining. Besteed aandacht aan de oriëntatie. Zorg ervoor dat alleen cellen die zijn gemigreerd naar het onderste compartiment van het membraan geteld.
- Tellen cellen die gemigreerd naar het onderste compartiment van het membraan met een fluorescentiemicroscoop bij 400x vergroting. Niet te verwarren membraanporiën met gemigreerde cellen (Figuur 1A, 1B). Onderzoek een redelijk aantal biologische herhalingen (minstens 3 biologische herhalingen per conditie).
4. Wound Healing Assay
- Afhankelijk van de beschikbare apparatuur, zorgvuldig kiezen van de celcultuur gerechten of platen: Bij het gebruik van DIC microscopie, vermijd plastic oppervlak gebaseerde cultuur gerechten of goed platen maar gebruik glas gebaseerde apparaten plaats.
Opmerking: Bij gebruik fasecontrast microscopie, kan kunststofbasis schotels worden gebruikt. - Cultiveren EEG in een geschikte celcultuur (bijv, 4 cm glazen bodem petrischaal geschikt voor live-cell imaging) Tot 80% confluentie. Belangrijk: de cellen niet te cultiveren om samenloop voltooien.
- Kras aan de monolagen met steriele 10 ul pipet tips. Druk de tip zachtjes zonder al te veel druk op de schotel oppervlak en bewegen in een rechte lijn soepel van de ene kant naar de other.Wash de cellen tweemaal met 0,1 M PBS tot vrijstaande cellen te verwijderen.
- Voeg een voldoende hoeveelheid van middel aan de kweekschaal. Eventueel voegen verbindingen die onderzocht moeten worden.
Opmerking: 1,5 ml medium bevattende 15 ng / ml alfa-linoleenzuur werd toegevoegd. - Monteer de cultuur schotel onder een microscoop in staat live cell imaging. Verzeker 5% CO 2, 37 ° C en een vochtige atmosfeer.
Opmerking: bevochtiging is vooral belangrijk om middelgrote verdamping te voorkomen. - Acquire time-lapse beelden van meer dan 24 uur bij 10 min intervallen. Plan voor grote bestanden. Opmerking: Een resolutie van 512 x 512 pixels is meestal voldoende; Toch raden we het gebruik van beelden van ten minste 1.024 x 1,024.
- Meet de spleetbreedte op t = 0 uur en op t = 24 uur met behulp van de lengte instrument van de software die bij de microscoop of gebruik van open-source software (bijvoorbeeld ImageJ). Opmerking: In het algemeen specifiek beeld acquisitie en analyse software wordt geleverd door de fabrikant. Daarom is voor de technische details met betrekking tot het gebruik van de software, raadpleegt u de handleiding.
5. Cell Tracking
- Afhankelijk van de beschikbare apparatuur, zorgvuldig kiezen van de celcultuur gerechten of platen: Bij het gebruik van DIC microscopie, vermijd plastic oppervlak gebaseerde cultuur gerechten of goed platen maar gebruik glas gebaseerde apparaten plaats.
Opmerking: Bij gebruik fasecontrast microscopie, kan kunststofbasis schotels worden gebruikt. - Seed 5 x 10 4 EEG aangevuld DMEM in een geschikte celcultuur inrichting (bijvoorbeeld 24-multi-putjesplaat) en cultiveren van de cellen met 5% CO2 bij 37 ° C en 95% vochtigheid gedurende 1-2 dagen.
- Wanneer cellen zijn opgegroeid met een 80% Confluentie, verwijdert het medium en kweek van de cellen met nieuwe media in aanwezigheid van de desbetreffende teststoffen (bijvoorbeeld 12,5 ug chloorambucil / ml DMEM). Vermeld altijd controlecellen (behandeld met het oplosmiddel, bijvoorbeeld ethanol) bij 37 ° C gedurende een bepaalde tijd (24 uur, afhankelijk van het individu testsysteem).
- Monteer de kweekschaal onder een microscoop die live cell imaging (37 ° C, 5% CO2 en 95% luchtvochtigheid). Acquire time-lapse beelden van meer dan 24 uur op vooraf bepaalde tijdstippen. Acquire beelden op 10 min met tussenpozen.
- Voer handmatig bijhouden van de EEG door het gebruik van de ImageJ plugin MTrackJ. Kies 10 cellen willekeurig uit het gezichtsveld en volgen hun bewegingen door het toevoegen van een data punt per punt in de tijd met behulp van de "toevoegen" bevel van MTrackJ.
Opmerking: MTrackJ is gratis beschikbaar op en ImageJ is availab [Meijering, Mtrackj "http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/".]le op [Rasband, ImageJ. "http://rsbweb.nih.gov/ij/"]. Een uitgebreide handleiding over de MTrackJ plugin is beschikbaar op "http://www.imagescience.org".
6. live cell imaging / Beoordeling van de mitochondriale membraan Potentiële
- Cultiveren EEG in een geschikte celcultuur (bijv, 4 cm glazen bodem petrischaal geschikt voor live-cell imaging) tot 80% samenvloeiing.
Belangrijk: de cellen niet te cultiveren om samenloop voltooien. - Indien van toepassing, de cellen bloot aan chemicaliën. Opmerking: De cellen werden blootgesteld aan 12,5 ug / ml voor chloorambucil 24 uur. Wat de specifieke experimentele opzet, kunnen instructies variëren.
- Bereid een 10 mM voorraad oplossing van tetramethylrhodamine (TMRM) in DMSO. Beschermen tegen licht. Opmerking: De voorraadoplossing kan bij -20 ° C worden bewaard.
- Verdun de voorraadoplossing in celkweekmedium naar de oplossing met een concentratie van 10 pM (1: 1000 verdunning). Beschermen tegen lichten gebruik zo spoedig mogelijk. Opmerking: De werkende oplossing kan bij kamertemperatuur worden bewaard gedurende enige tijd (> 1 uur), echter de bereiding van een verse werkoplossing wordt sterk aanbevolen.
- Voeg 2 ul van de werkoplossing 1 ml vers celkweekmedium (beladingsoplossing).
- Laad de cellen door vervangen van het celkweekmedium met de beladingsoplossing. Incubeer gedurende 15 minuten bij 37 ° C, 5% CO 2 en bevochtigde atmosfeer (incubator). Let op: Bijna alle fluorescentie-indicatoren worden geëxporteerd door levende cellen in de tijd; daarom niet te lang laden of vertraagde analyse.
- Zonder wassen, plaats de schotel onder een microscoop geschikt voor live-cell imaging. Belangrijk: fluorescentie-indicatoren zijn zeer gevoelig voor licht, dus onnodige blootstelling aan licht.
- Acquire beelden zonder dat de acquisitie parameters om de vergelijkbaarheid tussen de verschillende beelden te garanderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dermale blootstelling aan alkylerende agentia veroorzaakt erytheem, blaarvorming en huidzweren die is gekoppeld aan een wondgenezende stoornis. Wondgenezing vereist angio en vasculogenese die zijn gebaseerd op de migratie van endotheelcellen. Kwantitatieve migratie kan worden beoordeeld door het gebruik van de Boyden kamer assay. Zoals getoond in figuur 1C blootstelling van EEG de alkyleringsmiddel chloorambucil resulteerde in een significante afname van celmigratie 9. Toevoeging van de ROS scavenger-alfa linoleenzuur (ALA) onmiddellijk na blootstelling aan chloorambucil voor 24 uur significant redde dit fenotype, bijna tot controleniveaus.
De Boyden kamer assay is een geschikt instrument om het aantal (hoeveelheid) van gemigreerde cellen te beoordelen. Echter, de test geen informatie over het migratiegedrag van de cellen. Figuur 2 toont dat onbelichte EEG kunnen de kloof in de wond en genezing kontay binnen 24 uur 9. Daarentegen EEG blootgesteld aan het alkyleringsmiddel chloorambucil Fout bij achterstand bij de wondgenezing assay 9. Bovendien cell tracking single EEG gebleken dat onder invloed van chloorambucil gerichte beweging niet waargenomen 9. Behandeling van EEG met ROS-aaseters was in staat om gericht celmigratie 9 herstellen.
Mitochondriale ROS vorming is geassocieerd met verminderde celmigratie 12. Zoals getoond in figuur 3 blootstelling van EEG chloorambucil resulteerde in de afbraak van mitochondriale membraanpotentiaal 9. Behandeling van EEG met ROS-scavenger voorkomen mitochondriale schade en onderhouden van de mitochondriale membraanpotentiaal.
Kortom, alle methoden in het protocol beschreven geschikt gereedschap om celmigratie te beoordelen. Bevindingen over het verlies of behoud van de mitochondriale membraanpotentiaal kan v biedenaluable hints met betrekking tot de onderliggende moleculaire mechanismen van verminderde cel migratie.
Figuur 1. Boyden kamer assay. (A) EEG werden gezaaid op Boyden kamer filter inserts, gedurende 8 uur, gefixeerd en gekleurd met DAPI. Sterretjes geven gemigreerd EEG. In de gepresenteerde beeld in totaal 19 cellen kunnen worden geteld (Figuur 1B). Red pijlpunten wijzen cellen die niet over het inzetstuk volledig zijn gemigreerd of die niet volledig in het gezichtsveld en daardoor werden uitgesloten van celtellingen. (B) De poriën (8 um) in het membraan zichtbaar als lange belichtingstijden voor beeldacquisitie. Verwar ze niet met gemigreerde cellen. (C) onder controleomstandigheden gemiddeld 212 cellen gemigreerd door het membraan. Blootstelling chloorambucil slechts resulteerde in 128 gemigreerde cellen. Behandeling van chlorambucil blootgesteld EEG met de ROS-scavenger alfa-linoleenzuur (ALA) aanzienlijk gered cel migratie. Symbolen vertegenwoordigen individuele resultaten van het ene filter insert. Zwarte horizontale balken geven middelen (n = 4), fout balken geven SD en sterretjes geven significante verschillen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. wondgenezing assay / cell tracking. EEG waren sham-behandelde (uitwisseling van gemiddeld) of blootgesteld aan 12,5 ug / ml chlorambucil. Na krabben, cellen were onderzocht gedurende 24 uur. (A) EEG konden de achterstand bij de wondgenezing assay binnen 24 uur terwijl chloorambucil blootgesteld EEG Fout bij dichten. Behandeling met ALA resulteerde in een significante verbetering van celmigratie. (B) Gemiddelde waarden van 3 onafhankelijke experimenten, elk met 5 technische replicaten per groep (n = 15 per groep) getoond. Foutbalken standaardafwijkingen en sterretjes geven statistisch significante verschillen (One-way ANOVA, p <0,05). Gewijzigd ten opzichte van Steinritz et al. (2014) 9. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Beoordeling van de mitochondriale membraanpotentiaal. EEG waren sham-behandelde, blootgesteld aan chloorambucil (12,5 ug / ml) of chlorambUCIL belicht en ALA (15 ng / ml) behandeld. 24 uur na blootstelling werden de cellen beladen met TMRM gedurende 15 minuten en onmiddellijk afgebeeld. (A) onbelichte EEG onthulde een duidelijk signaal na TMRM etikettering aangeeft dat er een intact mitochondriaal membraanpotentiaal. Blootstelling (B) chloorambucil in een significante afname van de TMRM signaal. (C) Behandeling van-chlorambucil blootgesteld EEG met de ROS-scavenger alfa-linoleenzuur herstelde het mitochondriale membraanpotentiaal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dermale blootstelling aan giftige chemische stoffen resulteert vaak in ernstige wondgenezing stoornis. De onderliggende mechanismen zijn grotendeels onbekend. Wondgenezing is een complex proces dat uit verschillende fasen (hemostase, inflammatie, proliferatie en hermodellering). Celmigratie is betrokken bij elke fase, is het echter van het grootste belang voor de vorming van granulatieweefsel. Hier worden nieuwe bloedvaten ofwel gevormd door angio of vasculogenese.
Beide werkwijzen vereisen beïnvloed migratie van precursor en vroege endotheelcellen. Beoordeling van de celmigratie en verduidelijking van de onderliggende mechanismen voor de verstoorde celmigratie is zeer relevant om nieuwe therapeutische strategieën tegen giftige stof veroorzaakte wondgenezing stoornissen te ontwikkelen.
Celmigratie kan worden bepaald door verschillende benaderingen. Een veelgebruikte techniek is de Boyden kamer assay die oorspronkelijk werd ingevoerd om antilichaam-antig analyserenen veroorzaakt chemotaxis op leukocyten 13. Deze test is een kwantitatieve eindpunt test die de invasie capaciteit van cellen uit het bovenste compartiment van een transwell inzetstuk aan het onderste compartiment in respons op een chemoattractant weerspiegelt. In de hierin beschreven techniek werd geen chemoattractant toegevoegd aan de onderste kamer. Zo chemokinesis (random migratie zonder specifieke chemoattractant) van de EEG onder controle conditie of in antwoord op chlorambucil werd onderzocht.
Het inzetstuk omvat een poreus membraan dat driedimensionale celmigratie door de poriën van het membraan mogelijk maakt. De poriëngrootte van het membraan met betrekking tot de celgrootte te kiezen: poriën die te klein celmigratie volledig te voorkomen zijn poriën die te groot zal onbelemmerd passeren van alle cellen mogelijk zijn. Voor de vroege endotheelcellen, is een poriegrootte van 8 pm aanbevolen. Het gebruik van een ongeschikt poriëngrootte leidt tot reproduceerbare resultaten. In order om het protocol om cellen met verschillende eigenschappen als EEG aan te passen, raden we beginnen met een poriegrootte groter dan de kernen en het verhogen van de poriegrootte stap-voor-stap als dat nodig is. Bijvoorbeeld, kleine cellen zoals leukocyten een poriegrootte van 3 urn wordt aanbevolen.
Een kritiek probleem is het bepalen van de incubatietijd tot de analyse. Na verloop van tijd zullen celproliferatie (althans in controlegroepen) plaatsvinden. Dit zal het aantal cellen die kunnen binnendringen door het membraan mogelijk de gevoeligheid van de gebruikte reducerende amplificeren: zelfs lichtjes verminderde trekkende vermogen, kunnen cellen kunnen migreren over lange tijdsperioden. Daarom worden langdurig (bijvoorbeeld 24 uur) niet geschikt voor endotheelcellen. Anderzijds, indien de incubatie te kort na zaaien van cellen, slechts kleine hoeveelheden cellen zijn gepasseerd het membraan. Een 8 uur incubatie werd gevonden optimaal. Na elke gedefinieerde incubatietijd van 8 uur, cellen eenopnieuw vast, gekleurd en met de hand geteld.
Er zijn drie mogelijke benaderingen voor analyse: (1) Cellen boven het membraan (die niet zijn gemigreerd) worden verwijderd met een wattenstaafje. Toen de cellen op de onderzijde van het membraan (gemigreerde cellen) gekleurd met hetzij een cytologische (bijv hematoxyline) of een fluorescente kleurstof (bijvoorbeeld DAPI) en geteld. (2) Als alternatief cellen aan de onderzijde kan worden gekleurd met een fluorescente kleurstof eerste en worden daarna losgemaakt (bijvoorbeeld door het gebruik van trypsine). Fluorescentie wordt vervolgens gekwantificeerd door toepassing van een fluorescentie reader. (3) wordt aangeraden donker gekleurde poreuze membranen die lichttransmissie waardoor differentiatie van niet-gemigreerde cellen (cellen bovenop het membraan) en gemigreerde cellen (aan de onderzijde van het membraan) blokkeren. Na fluorescentie kleuring (cytologische kleurstoffen kunnen niet worden gebruikt) cellen aan de onderzijde worden geteld met behulp van een fluorescentiemicroscoop. Het is belangrijk om confound het membraan oriëntatie. Met een ondoorzichtige membraan vermijdt de noodzaak om niet-gemigreerde cellen te verwijderen. Het gebruik van opake membranen, fluorescente kleuring en handmatige celtelling bleek beter dan de andere methoden.
In het algemeen, de Boyden kamer assay is een assay die gemakkelijk te hanteren en daarom is een veel gebruikte test voor het beoordelen van celmigratie. Er zijn echter twee grote nadelen: (1) De Boyden kamer assay is een eindpunt assay. Dat betekent, indien de tijdstip van onjuist is, kan het resultaat misleidend zijn. (2) De test is niet eenvoudig te automatiseren. Niettemin, deze test is een van de meest waardevolle instrumenten voor de bepaling van celmigratie.
In tegenstelling tot de statische Boyden kamer assay, wondgenezing assay (ook wel gap closure assay of scratch test) is een dynamische test in real time. Het is een twee-dimensionale migratie assay zonder driedimensionale celinvasie bewegingen. Na "verwonden" van de cel lagen met een pipet tip, cellen migreren in het gat. De test is eenvoudig uit te voeren en vermijdt de problemen van statische eindpunt assay. De assay heeft een aantal problemen: (1) a live cell imaging microscopische systeem (37 ° C, 5% CO 2 met bevochtigde atmosfeer) vereist. Zorg ervoor dat de celkweek gerechten niet uitdrogen. (2) Time-lapse beeldacquisitie zal resulteren in grote databestanden, afhankelijk van de parameters (resolutie, interval) gebruikt. (3) Krassen op het cellaag met een pipet tip is niet zo eenvoudig als het kan in eerste instantie lijkt. Te veel druk zal het schaaloppervlak wat kan resulteren in artefacten beschadigen. Bovendien kan de spleetbreedte verschillen vertonen in de kras en kunnen verschillen tussen verschillende onderzoekers. Een ervaren onderzoeker wordt aanbevolen. (4) het aantal monsters dat gelijktijdig kan worden uitgevoerd is beperkt door de apparatuur. Niettemin wondgenezing assay is een ander waardevol instrument voor de kwantitatieve en kwaitative beoordeling van de cel migratie. Informatie over migratie snelheid, migratie afstand, kan gerichte migratie worden verzameld in een experimentele opstelling. Cell tracking in een tweedimensionaal systeem is niet erg moeilijk en kan worden uitgevoerd met open source software (bijvoorbeeld ImageJ en MTrackJ).
Coating van de celcultuurschalen is niet alleen belangrijk voor celhechting, maar heeft een significante invloed op cellulaire functie ten aanzien van migratie. Endotheliale cellen worden routinematig gekweekt op 0,1% gelatine beklede oppervlakken. Het gebruik van niet-gecoate opgedoken voor endotheelcellen teelt resulteerde in een verminderde proliferatie 14. Andere coatings (bijv fibronectine) bleken ook geschikt voor de korte termijn de teelt echter gelatine coatings toonde superieure prestaties op de lange termijn de teelt experimenten 15.
Er zijn tal van fluorescentie kleurstoffen op de markt live cell imaging. We hebben choTMRM sen de mitochondriale membraanpotentiaal te onderzoeken. Veel andere kleurstoffen (bv JC-1, TMRE) vertonen vergelijkbare prestatie. In tegenstelling tot monochromatische probes (TMRM, TMRE), JC-1 fluorescentie verandert van groen naar rood na accumulatie in de mitochondria. Hierdoor kan een ratiometrische semi-kwantitatieve analyse van de mitochondriale polarisatietoestand maar belemmert dubbele kleuring experimenten (bijvoorbeeld met behulp tracker kleurstoffen te identificeren mitochondria) 16. In onze ervaring de kleurstof zelf is minder kritisch voor het experiment, terwijl de experimentele opzet, mobiele handling en overname is uitdagend en vergt veel meer aandacht. Bijna alle fluorescerende kleurstoffen zijn lichtgevoelig. Daarom moet celbelading gebeurt in het donker. Celbelading nodig 15-30 min. Langdurige laadtijd niet leidt tot verhoogde signalen en wordt afgeraden. Hoewel specifieke signalen kunnen worden gedetecteerd na lange periodes laden, kan de kleurstof zich ophopen in subcellulaire Compartmenten of misschien zelfs worden afgevoerd uit de cel. Dientengevolge moeten de cellen worden geplaatst net vóór de analyse en niet noodzakelijkerwijs aan het begin van het experiment. De kleurstof loading concentratie ligt gewoonlijk in het traject van 10 uM. Echter, met TMRM veel lagere concentraties (20 nM) waren voldoende voor de etikettering gevonden en nog steeds redelijk resultaat gaf. Zoals getoond in figuur 3 labeling 24 uur na blootstelling chloorambucil resulteerde in een duidelijk verlies van mitochondriale membraanpotentiaal. Behandeling van chlorambucil blootgesteld EEG met ROS-aaseters was in staat om mitochondriale membraanpotentiaal op 24 uur te behouden na de eerste blootstelling.
Samengevat, Boyden kamer assay, wondgenezing assay in combinatie met enkele cel spoor analyse zijn waardevolle instrumenten om de migratie gedrag te beoordelen met betrekking tot de kwalitatieve en kwantitatieve aspecten. Etikettering van mitochondriale potentieel met TMRM kan helpen om de onderliggende mechanismen te identificeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Boyden Chamber | |||
| Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 3 µm | Corning Incorporated | #351151 | |
| Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 8 µm | Life Sciences | #351152 | |
| (for use with Falcon Insert 24 well Companion Plate (353504) | |||
| Wound healing assay | |||
| Glass bottom dishes | Word Precision Instruments, Inc. | #FD35-100 | |
| Assessment of mitochondrial potential | |||
| TMRM (tetramethylrhodamine methyl ester) | Life Technologies | #T669 | |
| Cell culture | |||
| Accutase | PAA, Pasching, Austria | # L11-007 | |
| α-Linolenic acid | Fluka (Sigma), Steinheim, Germany | # L2376 | |
| Chlorambucil | Fluka (Sigma), Steinheim, Germany | # 23125 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany | # G2500-100G |
References
- Bauer, S. M., Bauer, R. J., Velazquez, O. C. Angiogenesis, vasculogenesis, and induction of healing in chronic wounds. Vascular and Endovascular Surgery. 39, 293-306 (2005).
- Reinke, J. M., Sorg, H. Wound repair and regeneration. European Surgical Research. Europaische Chirurgische Forschung. Recherches Chirurgicales Europeennes. 49, 35-43 (2012).
- Hart, J. Inflammation. 1: Its role in the healing of acute wounds. Journal of Wound Care. 11, 205-209 (2002).
- Liu, Z. J., Hyperoxia Velazquez, O. C. endothelial progenitor cell mobilization, and diabetic wound healing. Antioxidants & Redox Signaling. 10, 1869-1882 (2008).
- Gallagher, K. A., Goldstein, L. J., Thom, S. R., Velazquez, O. C. Hyperbaric oxygen and bone marrow-derived endothelial progenitor cells in diabetic wound healing. Vascular. 14, 328-337 (2006).
- Kehe, K., Balszuweit, F., Steinritz, D., Thiermann, H. Molecular toxicology of sulfur mustard-induced cutaneous inflammation and blistering. Toxicology. 263, 12-19 (2009).
- Schmidt, A., et al. Nitrogen mustard (Chlorambucil) has a negative influence on early vascular development. Toxicology. 263, 32-40 (2009).
- Steinritz, D., et al. Effect of N-acetyl cysteine and alpha-linolenic acid on sulfur mustard caused impairment of in vitro endothelial tube formation. Toxicological Sciences. 118, 521-529 (2010).
- Steinritz, D., et al. Chlorambucil (nitrogen mustard) induced impairment of early vascular endothelial cell migration - Effects of alpha-linolenic acid and N-acetylcysteine. Chemico-biological Interactions. 219C, 143-150 (2014).
- Schmidt, A., et al. Influence of endostatin on embryonic vasculo- and angiogenesis. Developmental Dynamics : an Official Publication of the American Association of Anatomists. 230, 468-480 (2004).
- Dainiak, M. B., Kumar, A., Galaev, I. Y., Mattiasson, B. Methods in cell separations. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 106, 1-18 (2007).
- Wang, Y., et al. Regulation of VEGF-induced endothelial cell migration by mitochondrial reactive oxygen species. American Journal of Physiology. Cell physiology. 301, C695-C704 (2011).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
- Relou, I. A., Damen, C. A., van der Schaft, D. W., Groenewegen, G., Griffioen, A. W. Effect of culture conditions on endothelial cell growth and responsiveness. Tissue & Cell. 30, 525-530 (1998).
- Smeets, E. F., von Asmuth, E. J., vander Linden, C. J., Leeuwenberg, J. F., Buurman, W. A. A comparison of substrates for human umbilical vein endothelial cell culture. Biotechnic & Histochemistry : Official Publication of the Biological Stain Commission. 67, 241-250 (1992).
- Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. BioTechniques. 50, 98-115 (2011).
