Abstract
Eksponering for kjemiske stoffer (herunder alkylerende kjemiske stridsmidler som svovel og nitrogensenneps) føre til en mengde av kliniske symptomer inkludert sårtilheling lidelse. Den fysiologisk prosess leging av sår er meget kompleks. Dannelsen av granulasjonsvev er et viktig steg i denne prosessen resulterer i en foreløpig lukking av sår, og som gir et nett av nye kapillære blodkar - enten gjennom vaskulogenese (roman dannelse) eller angiogenese (sprouting av eksisterende fartøy). Både vasculo- og angiogenese krever funksjonelle, rettet migrasjon av endotelceller. Således er undersøkelse av tidlig endotelceller (EEC) migrering viktig å forstå patofysiologien av kjemisk induserte forstyrrelser sårheling og for å identifisere potensielt nye strategier for terapeutisk intervensjon.
Vi vurderes nedsatt sårtilheling etter alkyleringsmiddelet eksponering og testet potensielle kandidat forbindelser for treatment. Vi brukte et sett av teknikker som er skissert i denne protokollen. En modifisert Boyden kammer til kvantitativt undersøke chemokinesis av EEC er beskrevet. Videre er bruken av sårheling analyse i kombinasjon med spor analyse for å vurdere kvalitativt migrasjon illustrert. Endelig, viser vi bruken av fluorescerende fargestoff TMRM for undersøkelse av mitokondriell membranpotensiale for å identifisere underliggende mekanismene for forstyrrede celle migrasjon. Følgende protokoll beskriver grunnleggende teknikker som er tilpasset for etterforskningen av EEC.
Introduction
Celle migrasjon er viktig i mange fysiologiske og patofysiologiske prosesser, inkludert utvikling, ulike sykdommer og sårtilheling etter hud skade.
Etter hud skade, fjerner betennelse skadede eller nekrotiske vev og korning stasjoner foreløpig lukking av sår og tillater dannelsen av et nettverk av nye kapillærer gjennom vaskulogenese (roman formasjon) eller angiogenese (spirende av eksisterende vesikler) 1-3. Både vasculo- og angiogenese krever migrering av endotelceller. Den voksende nettverk av blodkar er nødvendig for å transportere oksygen og næringsstoffer til prolifererende keratinocytter som til slutt gjennomgår keratinization, danne et nytt epitel og gir lukking av sår.
Svekket migrering av endotelceller er en underliggende årsak til sårheling uorden 4,5. Derfor, for å vurdere fremgangsmåter migrering av tidlige endotelceller er nødvendig for å utforske pathophysiollogi celle migrasjon lidelser og å identifisere nye strategier for terapeutisk intervensjon.
Hudkontakt med alkylerende midler (f.eks svovel og nitrogensenneps) fører sårtilheling lidelse 6. Slike forbindelser ble brukt som kjemiske stridsmidler i flere konflikter i det 20. århundre og er fortsatt grunn til sterk bekymring på grunn av eksisterende lagre i politisk ustabile regioner og den relativt enkle syntese. Selv om sennepsgass først ble syntetisert i 1822, er den molekylære og klinisk patologi SM eksponering ikke forstått i detalj og ingen motgift for SM eksponering har blitt identifisert.
Flere studier har blitt gjennomført for å forstå og å modellere nedsatt sårtilheling etter SM eksponering og for å teste for potensielle kandidatforbindelser som kan reservere den effekten. Schmidt et al. (2009) testet effekten av klorambucil, et alkylerende forbindelse med egenskaper som ligner på SM i mouSE embryoid kropps modeller og funnet en dramatisk, noen ganger mer enn 99% reduksjon i fartøy dannelse 7. Denne uheldige virkning er mest uttalt i et utviklingstrinn som under fysiologiske betingelser, er dominert av proliferasjonen og migreringen av vaskulære endoteliale forløperceller. Således ble disse cellene funnet å være spesielt følsomme for alkyleringsmidler. Steinritz et al. (2010) testet scavengers av reaktive oksygenarter (ROS), spesielt N-acetylcystein (NAC), og a-linolensyre (ALA) for deres evne til å redusere SM toksisitet hos mus embryoid kroppsmodeller og særlig for å gjenopprette fartøy dannelse 8. Midlertidige beskyttende effekt ble observert, noe som indikerer at overdreven ROS formasjonen var trolig bidra til negative effekter av SM på sårtilheling. Disse effektene var ikke permanent, og de to kandidatforbindelser kan ikke være i stand til å gjenopprette fartøy dannelse og sårheling på lang sikt 8. However, ble de eksperimentene utført i en kompleks 3D-modell som tillot undersøkelse av cellemigrasjon. Dermed har vi i ettertid testet NAC og ALA for gunstige effekter på cellemigrasjon av EEC som har en nøkkelrolle i prosessen med fartøy dannelse 9.
Videre er det bevis på at celle polaritet er nødvendig for cellemigrasjon. Mitokondriell dysfunksjon fører til ROS formasjonen ble vist seg å svekke celle polaritet og kan dermed påvirke cellemigrasjon. Derfor ble levende celle avbildning med hensyn til mitokondriefunksjonen utføres og effektene av ROS-oppfangere ble undersøkt. Den følgende protokollen beskriver generelle krav til dyrking av EEC, Boyden kammer assay sårhelingsprosessen analysen inkludert celle sporing analyse og bruk av TMRM for vurdering av mitokondriell funksjon i detalj. Viktige aspekter av eksperimentelle protokoller for EEC dyrking og migrasjon er uthevet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den følgende protokollen beskriver teknikker for undersøkelse av tidlig endotelial cellemigrering. Den riktige dyrking av vaskulære endotelceller krever pre-belegning av cellekulturflasker med gelatin for å sikre riktig spredning og vedlikehold av en endothelial fenotype.
1. Pre-belegg av cellekulturflasker
- Oppløs gelatin i 0,1 M PBS til en sluttkonsentrasjon på 0,1%.
- Autoklaver løsningen med parametere for flytende autoclaving (for mer informasjon se instruksjoner av den spesifikke autoklaven).
- Tilsett tilstrekkelig volum av autoklavert gelatinløsning til en steril cellekulturflaske (for eksempel minst 5 ml av en T25 cellekulturflaske).
- Overfør kolbene i en inkubator (37 ° C, 5% CO 2 ikke nødvendig, men forstyrrer ikke) i minst 30 min.
- Fjern det gjenværende gelatinoppløsning. Bruk forbelagte kolber senere (se celledyrking) eller store under sterile forhold inntil bruk.
2. Cell Dyrking av Tidlige endotelceller
Merk: embryonale stamceller avledet tidlige endotelceller (EEC) ble oppnådd fra differensierte murine embryoide legemer av magnetisk aktivert cellesortering av de PECAM-1-positive cellefraksjon som beskrevet tidligere 10,11.
- Culture EEC på gelatin-belagte cellekulturskåler i DMEM supplementert med 15% FCS, 50 U / ml penicillin, 50 U / ml streptomycin, 200 mM L-glutamin, 100 mM P-merkaptoetanol og 1% ikke-essensielle aminosyrer. Håndtak celler under sterile betingelser. Dyrke cellene med 5% CO2 ved 37 ° C og 95% fuktighet inntil sub-konfluens (maks. 80%).
- At sub-samløpet, splitte cellene i 1: 5-forhold. Merk: Løsgjøring av endoteliale celler er et kritisk trinn.
- Høste celler med RT accutase. Fjern media, skyll med PBS og tilsett 1 ml accutase per 25 cm
- Inkuber i kolben ved romtemperatur i 2-10 min inntil cellene er frittliggende. Spre cellene og overføre dem til ønsket program. Merk: En kjemisk nøytralisering av accutase er ikke nødvendig, da det finner sted når seeded cellene blir lagret i inkubator ved 37 ° C. Imidlertid kan accutase aktivitet også reduseres ved å legge DMEM inneholder FCS.
- Høste celler med RT accutase. Fjern media, skyll med PBS og tilsett 1 ml accutase per 25 cm
3. Boyden Chamber
Merk: Boyden kammer forsøk ble utført ved å bruke lys-gjennomsiktig polyetylentereftalat-insert-systemer med 8 um porestørrelse.
- Pre-coat filterinnsatser (som passer inne i cellekulturbrønner og dermed skape en Boyden kammer) ved tilsetning av 500 ul 0,1% gelatin oppløst i 0,1 M PBS i minst 30 min.
- Når celler skal utsettes for giftige kjemikalier, utsettes i henhold til den spesifikke eksperimentell design før cellehøstings. Note: Celler ble eksponert til 12,5 ug klorambucil / ml DMEMi 24 timer. Med hensyn til den spesifikke eksperimentell design, kan instruksjoner variere.
- Innhøsting EEC og bestemme celle nummer ved hjelp av en tellekammeret. Merk: Automatisk telling enheter kan brukes, men bør brukes med forsiktighet: manuell celle telling er mer nøyaktig og er sterkt anbefalt.
- Legg 500 pl cellekulturmedium inn i det nedre kammer rommet i Boyden kammer.
- Legg nøyaktig 10 4 EEC i 500 pl cellekulturmedium pr filterinnsats i det øvre kammer rommet. Eliminere bobler.
- Inkuber filterinnsatser i inkubatoren for nøyaktig 8 timer.
- Skyll med PBS gang og erstatte mediet med 0,5 ml 4% paraformaldehyde i begge kamrene i 25 min for celle fiksering. Vask filter omfattende, men i det minste tre ganger med 0,1 M PBS.
- Eksisere membraner med en skalpell.
- Monter membran mellom to glass dekkglass med monteringsmedium som inneholder DAPI for atom staining. Ta hensyn til orientering. Sikre at bare celler som har migrert mot det nedre kammeret side av membranen telles.
- Antall celler som har migrert mot det nedre kammeret av membranen med et fluorescens mikroskop ved 400X forstørrelse. Ikke forveksle membranporene med migrerte celler (Figur 1a, 1b). Forske et rimelig antall biologiske replikater (minst tre biologiske replikater per tilstand).
4. Wound Healing analysen
- Avhengig av tilgjengelig utstyr, velge cellekulturskåler eller plater nøye: Ved bruk av DIC mikroskopi, unngå plast overflatebasert kultur retter eller vel plater, men bruker glass baserte enheter i stedet.
Merk: Hvis du bruker fasekontrastmikroskopi, kan plastbaserte retter også brukes. - Dyrke EEC i en passende cellekulturenhet (f.eks 4 cm glassbunn petriskål egnet for live cell imaging) Inntil 80% samløpet. Viktig: ikke dyrke cellene til å fullføre samløpet.
- Skrap monosjiktene med sterile 10 mL pipette tips. Skyve spissen skånsomt uten for mye press på skåloverflaten og beveger det i en rett linje jevnt fra den ene side til den other.Wash cellene to ganger med 0.1 M PBS for å fjerne frigjorte celler.
- Legg et tilstrekkelig volum av medium til kultur fatet. Hvis det er aktuelt, legger forbindelser som bør undersøkes.
Merk: 1,5 ml medium inneholdende 15 ng / ml alfa-linolensyre ble tilsatt. - Monter dyrkningsskålen under et mikroskop kan levende celle bildebehandling. Sikre 5% CO2, 37 ° C og en fuktig atmosfære.
Merk: Humidification er spesielt viktig å unngå medium fordampning. - Tilegne tid-lapse bilder over 24 timer ved 10 min intervaller. Plan for store filstørrelser. Merk: En oppløsning på 512 x 512 piksler er som regel tilstrekkelig; Vi anbefaler imidlertid å bruke bilder på minst 1024 x 1,024.
- Måle gapet bredden ved t = 0 time og ved t = 24 timer ved hjelp av lengden verktøyet av programvaren som følger med mikroskop eller bruk av åpen kildekode programvare (f.eks ImageJ). Merk: Generelt bestemt bilde innsamling og analyse programvaren er levert av produsenten. Derfor, for tekniske detaljer om bruk av programvaren, se i manualen.
5. Cell Tracking
- Avhengig av tilgjengelig utstyr, velge cellekulturskåler eller plater nøye: Ved bruk av DIC mikroskopi, unngå plast overflatebasert kultur retter eller vel plater, men bruker glass baserte enheter i stedet.
Merk: Hvis du bruker fasekontrastmikroskopi, kan plastbaserte retter også brukes. - Seed 5 x 10 4 EEC i DMEM supplert i en egnet cellekulturenhet (f.eks 24 flere brønner plate) og dyrke cellene med 5% CO2 ved 37 ° C og 95% fuktighet i 1-2 dager.
- Når cellene har vokst opp til en 80% Samløpet, fjerner media og kultur cellene med nye medier i nærvær av de respektive test stoffer (f.eks 12,5 mikrogram chlorambucil / ml DMEM). Alltid inkludere kontrollceller (behandlet med løsningsmidlet, for eksempel etanol) ved 37 ° C for en viss tid (24 timer, avhengig av den enkelte analysesystemet).
- Monter kulturskålen under et mikroskop i stand til levende celle imaging (37 ° C, 5% CO2 og 95% fuktighet). Tilegne tid-lapse bilder over 24 timer ved forhåndsdefinerte intervaller. Hente bilder på 10 min intervaller.
- Utføre manuelt sporing av EEC ved bruk av ImageJ plugin MTrackJ. Velg 10 celler tilfeldig fra synsfeltet og spore deres bevegelser ved å legge til et datapunkt per tidspunkt ved hjelp av "Add" kommandoen over MTrackJ.
Merk: MTrackJ er tilgjengelig gratis på og ImageJ er tilgjengelig på [Meijering, Mtrackj "http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/".]le på [Rasband, ImageJ. "http://rsbweb.nih.gov/ij/"]. En detaljert manual om MTrackJ plugin er tilgjengelig på "http://www.imagescience.org".
6. Levende Cell Imaging / Vurdering av mitokondriemembranen Potential
- Dyrke EEC i en passende cellekulturenhet (f.eks 4 cm glassbunn petriskål egnet for live cell imaging) opp til en 80% samløpet.
Viktig: Ikke dyrke cellene til å fullføre samløpet. - Hvis det er aktuelt, utsette cellene for kjemikalier. Note: Celler ble eksponert til 12,5 ug / ml klorambucil i 24 timer. Med hensyn til den spesifikke eksperimentell design, kan instruksjoner variere.
- Forbered en 10 mM stamløsning av tetramethylrhodamine (TMRM) i DMSO. Beskytt mot lys. Merk: Stamoppløsningen kan oppbevares ved -20 ° C.
- Fortynn stamløsning i cellekulturmedium til en arbeidsløsning med en konsentrasjon på 10 pM (1: 1000 fortynning). Beskytt mot lysog bruk så snart som mulig. Merk: Arbeidsoppløsningen kan oppbevares ved romtemperatur i noen tid (> 1 time), men fremstillingen av en ny arbeidsoppløsning er sterkt anbefalt.
- Tilsett 2 mL av arbeidsløsningen til 1 ml frisk cellekulturmedium (lasting løsning).
- Laster cellene ved å erstatte cellekulturmediet med lasting løsningen. Inkuber i 15 minutter ved 37 ° C, 5% CO2 og fuktig atmosfære (inkubator). Forsiktig: Nesten alle fluorescens indikatorer eksporteres av levende celler over tid; derfor unngå langvarig lasting eller forsinket analyse.
- Uten å vaske, sett formen under et mikroskop egnet for live cell imaging. Viktig: fluorescens indikatorer er svært følsom for lys, derfor unngå unødvendig lyseksponering.
- Hente bilder uten å endre oppkjøps parametere for å sikre sammenlignbarhet mellom forskjellige bilder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dermal eksponering for alkyleringsmidler provoserer erytem, blæredannelse og dermal sårdannelse som er forbundet med en sårtilheling lidelse. Sårtilheling krever angio- og vaskulogenese som er basert på migrasjon av endotelceller. Kvantitativ migrasjon kan vurderes ved bruk av det Boyden kammer analysen. Som vist på figur 1C eksponering av EEC til alkyleringsmidlet klorambucil resulterte i en signifikant reduksjon i cellemigrering 9. Tilsetning av ROS-scavenger alfa-linolensyre (ALA) direkte etter eksponering for klorambucil i 24 timer vesentlig reddet denne fenotype, nesten til kontrollnivåer.
Boyden kammeret analysen er et egnet verktøy for å vurdere antall (mengde) av migrerte celler. Imidlertid ikke analysen ikke gi informasjon om migrering oppførselen til cellene. Figur 2 viser at ueksponert EEC er i stand til å lukke gapet i såret og helbredende assay innen 24 timer 9. I kontrast, EEC utsatt for alkyleringsmiddelet chlorambucil klarte ikke å tette gapet i sårheling analysen 9. Videre celle sporing av enkelt EEC viste at under påvirkning av klorambucil rettet bevegelse ikke ble observert 9. Behandling av EEC med ROS-åtseletere var i stand til å gjenopprette rettet celle migrasjon 9.
Mitokondrielle ROS formasjonen har blitt assosiert med redusert celle migrasjon 12. Som vist i figur 3 eksponering av EEC til klorambucil resulterte i nedbryting av mitokondriemembranpotensialet 9. Behandling av EEC med ROS-åtseldyr forhindret mitokondrieskade og vedlikeholdes mitokondrie membran potensial.
I sammendrag, alle metoder som er beskrevet i protokollen seksjon er egnet verktøy til å vurdere cellemigrering. Funn på tap eller bevaring av mitokondriemembranen potensialet kan gi valuable hint om de underliggende molekylære mekanismene for svekket celle migrasjon.
Figur 1. Boyden kammer assay. (A) EEC ble sådd på Boyden kammer-filterinnsatser, inkubert i 8 timer, fiksert og farget med DAPI. Stjernene indikerer migrert EEC. I presenterte bildet totalt 19 celler kan telles (figur 1B). Røde piler viser celler som ikke har migrert over innsatsen helt eller som ikke er helt i synsfeltet og dermed ble ekskludert fra celle telling. (B) Porene (8 mikrometer) i membranen blir synlig når du bruker lange eksponeringstider for bildeopptak. Ikke forveksle dem med migrerte celler. (C) Under kontrollbetingelser et gjennomsnitt på 212 celler migrert gjennom membranen. Klorambucil eksponering førte til bare 128 migrerte celler. Behandling av klorambucil eksponert EEC med ROS-åtseldyr alpha linolensyre (ALA) betydelig reddet celle migrasjon. Symboler representerer individuelle resultater fra en filterinnsats. Sorte horisontale linjene viser middel (n = 4), feilfelt indikerer SD og stjernene indikerer signifikante forskjeller. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. sårtilheling analysen / celle sporing. EEC var humbug-behandlet (utveksling av medium) eller utsatt for 12,5 mikrogram / ml klorambucil. Etter skrape, celler were undersøkt i 24 timer. (A) EEC var i stand til å lukke gapet i sårheling analysen innen 24 timer, mens chlorambucil utsatt EEC ikke var i stand til å lukke gapet. Behandling med ALA resulterte i en betydelig forbedring av cellemigrering. (B) Gjennomsnittsverdier fra tre uavhengige eksperimenter hver med 5 tekniske replikater per gruppe (n = 15 per gruppe) er vist. Feilfelt representerer standardavvik og stjernetegn indikere statistisk signifikante forskjeller (Enveis ANOVA, p <0,05). Modifisert fra Steinritz et al. (2014) 9. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Vurdering av mitokondriemembranen potensial. EEC var humbug-behandlet, utsatt for klorambucil (12,5 mikrogram / ml) eller chlorambUcil eksponert og ALA (15 ng / ml) som ble behandlet. 24 timer etter eksponering, ble cellene ladet med TMRM i 15 minutter og umiddelbart avbildes. (A) Ueksponert EEC avdekket et tydelig signal etter TMRM merking som indikerer en usvekket mitokondrie membran potensial. (B) Klorambucil eksponering resulterte i en betydelig reduksjon av TMRM signal. (C) Behandling av klorambucil eksponert EEC med ROS-åtseldyr alpha linolensyre restaurert mitokondrie membran potensial. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dermal eksponering for giftige kjemikalier ofte resulterer i alvorlig sårtilheling lidelse. De underliggende mekanismene er i stor grad ukjent. Sårheling er en kompleks prosess som består av ulike faser (hemostase, betennelse, spredning og ombygging). Cellemigrering er involvert i hver fase, er det imidlertid av største betydning for dannelsen av granulasjonsvev. Her er nye blodkar dannes enten ved angio- eller vaskulogenese.
Begge prosesser krever upåvirket migrasjon av forløperen og tidlige endotelceller. Vurdering av cellemigrasjon og klargjøre de underliggende mekanismene for forstyrret cellemigrasjon er svært relevant for å utvikle nye terapeutiske strategier mot giftstoffet indusert sårheling lidelser.
Cellemigrasjon kan vurderes ved ulike tilnærminger. En vanlig brukt teknikk er Boyden kammer analysen som opprinnelig ble innført for å analysere antistoff-antigno forårsaket kjemotaksi på leukocytter 13. Denne analysen er en kvantitativ analyse som reflekterer endepunkt invasjonen kapasiteten av celler fra det øvre kammeret av en Transwell innsats til det nedre kammer under påvirkning av et kjemotiltrekkende. I den teknikk som er beskrevet her, ble ingen kjemotiltrekkende tilsatt til det nedre kammer. Således chemokinesis (tilfeldig migrering uten en spesifikk kjemotiltrekkende) av EEC under kontroll tilstand eller i respons til klorambucil ble undersøkt.
Innsatsen består av en porøs membran som gjør det mulig for tredimensjonal cellemigrering gjennom porene i membranen. Porestørrelsen av membranen må velges i forhold til cellestørrelsen: porer som er for små vil forhindre cellemigrering helt, porer som er for store vil tillate uhindret passering av alle celler. For tidlige endotelceller, er en porestørrelse på 8 um anbefalt. Bruken av en upassende porestørrelse vil resultere i uforklarlige resultater. I order å tilpasse protokollen til celler med forskjellige egenskaper som EEC, anbefales det å starte med en porestørrelse større enn kjernene og øke porestørrelsen trinn-for-trinn om nødvendig. For eksempel, for små celler som leukocytter en porestørrelse på 3 um anbefales.
Et kritisk problem er bestemmelse av inkubasjonstiden inntil analyse. Over tid vil celledeling (i hvert fall i kontrollgruppene) finner sted. Dette i sin tur vil forsterke antall celler som kan trenge gjennom membranen, potensielt reduserer sensitiviteten av metoden: selv med litt nedsatt trekkende egenskaper, kan celler være i stand til å migrere over lange tidsperioder. Derfor blir lange perioder (f.eks 24-timers) anbefales ikke for endotelceller. På den annen side, hvis den er for kort inkubasjon etter celle såing, bare små mengder av celler vil ha passert membranen. En 8 timers inkubasjon ble funnet optimal. Etter den angitte inkubasjonstid på 8 timer, cellene are fast, farget og manuelt telles.
Det er tre mulige metoder for analyse: (1) celler på toppen av membranen (som ikke har migrert) fjernes ved en vattpinne. Da cellene på undersiden av membranen (migrerte celler) er farget enten med et cytologisk (f.eks hematoxylin) eller et fluorescerende fargestoff (f.eks DAPI) og telles. (2) Alternativt kan cellene på undersiden være farget med et fluorescerende fargestoff først og løsnes deretter (for eksempel ved bruk av trypsin). Fluorescens blir deretter kvantifisert ved anvendelse av en fluorescens-leser. (3) Det anbefales å bruke mørke porøse membraner som blokkerer lysoverføring for derved å tillate differensiering av ikke-migrerte celler (celler på toppen av membranen) og migrerte celler (på undersiden av membranen). Etter fluorescens farging (cytologiske fargestoffer kan ikke benyttes) celler på den nedre side telles ved hjelp av et fluorescens mikroskop. Det er viktig å ikke confound membranen orientering. Ved hjelp av en ugjennomsiktig membran unngår behovet for å fjerne ikke-migrerte celler. Bruken av opake membraner, fluorescerende farging og celle manuell telling har vist seg overlegne i forhold til de andre tilnærminger.
Generelt er det Boyden kammer analysen en metode som er enkel å håndtere, og dermed er det en ofte brukt assay for vurdering av cellemigrering. Det er imidlertid to store ulemper: (1) Boyden kammer analysen er et endepunkt assay. Det betyr at hvis det tidspunkt analysen er feil, kan resultatet bli misvisende. (2) assay er ikke lett å automatisere. Ikke desto mindre er denne analysen en av de mest verdifulle verktøy for vurdering av cellemigrering.
I motsetning til den statiske Boyden kammer assay sårhelingsprosessen analysen (også referert til som gap lukking assay eller riper assay) er et dynamisk analyse i sann tid. Det er en todimensjonal migrasjon analysen uten tredimensjonale celle invasjon bevegelser. Etter «såret» av cellelag med en pipettespiss, cellene migrerer inn i gapet. Analysen er enkel å utføre og unngår problemene med statisk endepunkt assay. Imidlertid har analysen noen utfordringer: (1) en levende celle mikroskopisk avbildningssystem (37 ° C, 5% CO2 fuktet atmosfære med) er påkrevd. Pass på at cellekultur retter ikke tørker ut. (2) Time-lapse image oppkjøpet vil føre til store datafiler avhengig av parametrene (oppløsning, intervall) som brukes. (3) risser i cellelaget med en pipette tips er ikke så lett som det kan i utgangspunktet se ut. For høyt trykk vil skade den skåloverflaten som kan resultere i gjenstander. Videre kan spaltebredden variere innenfor bunnen av og kan variere mellom forskjellige undersøkere. En erfaren etterforsker anbefales. (4) antall prøver som kan kjøres i parallell er begrenset av utstyret. Likevel, sårheling analysen er et annet verdifullt verktøy for kvantitativ og qualitative vurdering av cellemigrasjon. Informasjon om migrasjon hastighet, migrasjon avstand, kan rettes migrasjon samles i ett eksperimentelt oppsett. Cell-sporing i et todimensjonalt system er ikke veldig vanskelig, og kan utføres med åpen kildekode (f.eks ImageJ og MTrackJ).
Belegg av cellekulturskåler er ikke bare viktig for celle vedlegg, men har en betydelig innflytelse på cellular funksjon med hensyn til migrasjon. Endotelceller blir rutinemessig dyrket i 0,1% gelatin-belagte overflater. Bruk av ikke-belagt overflate til endotelial celledyrking resulterte i redusert spredning 14. Andre belegg (f.eks fibronektinet) ble også funnet egnet for kortsiktig dyrking imidlertid gelatin belegg viste overlegen ytelse i langsiktige dyrkingsforsøk 15.
Det er mange fluorescens fargestoffer på markedet for levende celle bildebehandling. Vi har chosen TMRM å undersøke mitokondriemembranen potensial. Mange andre fargestoffer (f.eks JC-1, TMRE) utviser sammenlignbare resultater. I motsetning til monokromatiske sonder (TMRM, TMRE), JC-en fluorescens skifter fra grønt til rødt etter akkumulering i mitokondriene. Dette gjør at en proporsjonal semi-kvantitativ analyse av mitokondrie polarisasjonstilstanden men hemmer to flekker eksperimenter (for eksempel til å bruke tracker fargestoffer identifisere mitokondrier) 16. I vår erfaring fargestoff i seg selv er mindre kritisk for eksperimentet mens eksperimentell design, celle håndtering og oppkjøp er utfordrende og krever mye mer oppmerksomhet. Nesten alle fluorescerende fargestoffer er lysfølsom. Derfor bør celle lasting utføres i mørket. Cell lasting krever 15-30 min. Langvarig lasting tid ikke resulterer i økte signaler og er ikke anbefalt. Selv om spesifikke signaler kunne påvises etter lange laste perioder, kan fargestoff akkumuleres i subcellulær Compartmenter eller kanskje til og med bli utskrevet fra cellen. Som en følge av dette bør celler lastes like før analyse, og ikke nødvendigvis ved begynnelsen av forsøket. Fargestoffet lasting konsentrasjonen er vanligvis i størrelsesorden 10 uM. Men med TMRM mye lavere konsentrasjoner (20 nm) ble funnet å være tilstrekkelig for merking og fortsatt ga rimelige resultater. Som vist i figur 3 merking 24 timer etter eksponering klorambucil resulterte i en tydelig tap av mitokondriemembranpotensialet. Behandling av klorambucil utsatt EEC med ROS-åtseletere var i stand til å opprettholde mitokondriemembranpotensiale på 24 timer etter den første eksponeringen.
Oppsummert Boyden kammeret analysen, sårheling analysen i kombinasjon med enkelt celle spor analyse er verdifulle verktøy for å vurdere migrasjon atferd med hensyn til kvalitative og kvantitative aspekter. Merking av mitokondriell potensial med TMRM kan bidra til å identifisere bakenforliggende mekanismene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Boyden Chamber | |||
| Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 3 µm | Corning Incorporated | #351151 | |
| Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 8 µm | Life Sciences | #351152 | |
| (for use with Falcon Insert 24 well Companion Plate (353504) | |||
| Wound healing assay | |||
| Glass bottom dishes | Word Precision Instruments, Inc. | #FD35-100 | |
| Assessment of mitochondrial potential | |||
| TMRM (tetramethylrhodamine methyl ester) | Life Technologies | #T669 | |
| Cell culture | |||
| Accutase | PAA, Pasching, Austria | # L11-007 | |
| α-Linolenic acid | Fluka (Sigma), Steinheim, Germany | # L2376 | |
| Chlorambucil | Fluka (Sigma), Steinheim, Germany | # 23125 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany | # G2500-100G |
References
- Bauer, S. M., Bauer, R. J., Velazquez, O. C. Angiogenesis, vasculogenesis, and induction of healing in chronic wounds. Vascular and Endovascular Surgery. 39, 293-306 (2005).
- Reinke, J. M., Sorg, H. Wound repair and regeneration. European Surgical Research. Europaische Chirurgische Forschung. Recherches Chirurgicales Europeennes. 49, 35-43 (2012).
- Hart, J. Inflammation. 1: Its role in the healing of acute wounds. Journal of Wound Care. 11, 205-209 (2002).
- Liu, Z. J., Hyperoxia Velazquez, O. C. endothelial progenitor cell mobilization, and diabetic wound healing. Antioxidants & Redox Signaling. 10, 1869-1882 (2008).
- Gallagher, K. A., Goldstein, L. J., Thom, S. R., Velazquez, O. C. Hyperbaric oxygen and bone marrow-derived endothelial progenitor cells in diabetic wound healing. Vascular. 14, 328-337 (2006).
- Kehe, K., Balszuweit, F., Steinritz, D., Thiermann, H. Molecular toxicology of sulfur mustard-induced cutaneous inflammation and blistering. Toxicology. 263, 12-19 (2009).
- Schmidt, A., et al. Nitrogen mustard (Chlorambucil) has a negative influence on early vascular development. Toxicology. 263, 32-40 (2009).
- Steinritz, D., et al. Effect of N-acetyl cysteine and alpha-linolenic acid on sulfur mustard caused impairment of in vitro endothelial tube formation. Toxicological Sciences. 118, 521-529 (2010).
- Steinritz, D., et al. Chlorambucil (nitrogen mustard) induced impairment of early vascular endothelial cell migration - Effects of alpha-linolenic acid and N-acetylcysteine. Chemico-biological Interactions. 219C, 143-150 (2014).
- Schmidt, A., et al. Influence of endostatin on embryonic vasculo- and angiogenesis. Developmental Dynamics : an Official Publication of the American Association of Anatomists. 230, 468-480 (2004).
- Dainiak, M. B., Kumar, A., Galaev, I. Y., Mattiasson, B. Methods in cell separations. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 106, 1-18 (2007).
- Wang, Y., et al. Regulation of VEGF-induced endothelial cell migration by mitochondrial reactive oxygen species. American Journal of Physiology. Cell physiology. 301, C695-C704 (2011).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
- Relou, I. A., Damen, C. A., van der Schaft, D. W., Groenewegen, G., Griffioen, A. W. Effect of culture conditions on endothelial cell growth and responsiveness. Tissue & Cell. 30, 525-530 (1998).
- Smeets, E. F., von Asmuth, E. J., vander Linden, C. J., Leeuwenberg, J. F., Buurman, W. A. A comparison of substrates for human umbilical vein endothelial cell culture. Biotechnic & Histochemistry : Official Publication of the Biological Stain Commission. 67, 241-250 (1992).
- Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. BioTechniques. 50, 98-115 (2011).
