Introduction
تمزق في الرباط الصليبي الأمامي (ACL) هي واحدة من معظم إصابات الرباط مشتركة في الركبة 1. لأن تمزق في الرباط الصليبي الأمامي غير قادر على شفاء دون تدخل جراحي، والقيود المفروضة على أنشطة الحياة اليومية، وكذلك المشاركة في الألعاب الرياضية بالسيارة أكثر من 175،000 المرضى لإجراء عملية جراحية سنويا 2، بتكلفة تقديرية تبلغ مليار دولار سنويا 3. حاليا، يتم استخدام إما الطعم الذاتي أو المزروع وتر لإعادة الإعمار الرباط. على الرغم من معدلات نجاح عالية لا يمكن أن يتحقق مع كل من الطعم الذاتي والمزروع الاستبدال، وترتبط مضاعفات خطيرة مع خيارات إعادة الإعمار هذه 4. ويرتبط الأنسجة الطعم الذاتي مع الموقع المانحة الاعتلال ويقتصر في العرض، خصوصا في حالات إعادة تمزق أو إصابة متعددة الرباطية. من ناحية أخرى، يرتبط النسيج المزروع مع التكامل تأخر الكسب غير المشروع، والاستجابة الالتهابية الضارة ومخاطر المعدية النظري، والملحق محدودلاي 5. وقد وضعت الطعوم غير القابلة للتحلل الاصطناعية في 1970s و 1980s ولكن تم تعيق من السابق لأوانه تمزق الكسب غير المشروع، وردود الفعل جسم غريب، وعظام النهايات، وداء التهاب الغشاء المفصلي 6. ونتيجة لهذه المخاوف الخطيرة، وهناك حاليا أي الطعوم الاصطناعية متاحة للاستخدام السريري في الولايات المتحدة.
بسبب هذه القيود مع خيارات الكسب غير المشروع القائمة والتطورات الأخيرة في علم الأحياء والهندسة والطب التجديدي، كان هناك اهتمام كبير في حل الأنسجة المهندسة لACL التطعيم. استراتيجيات هندسة الأنسجة الحالية تستخدم المواد البيولوجية والاصطناعية القابلة للتحلل للسماح نشوب الأنسجة المضيف مع تجنب القيود المرتبطة المواد الاصطناعية الدائمة زرع 7.
Polycaprolactone (PCL) هو بوليمر قابلة للتحلل هذا هو FDA وافقت لعدد من التطبيقات الطبية بما في ذلك الحاجز التصاق وتضميد الجرح 8، التي كانت شالحوار الاقتصادي الاستراتيجي في مجموعة واسعة من التطبيقات بما في ذلك الأوعية الدموية والعظام والغضاريف والأعصاب والجلد وهندسة الأنسجة المريء 5،9-16. توافق مع الحياة مواتية، لفترة طويلة نسبيا في الجسم الحي نصف الحياة، والقوة الميكانيكية الكافية، ومرونة عالية تساهم في شعبية هذا البوليمر في هندسة الأنسجة. في نموذج القوارض من التئام الجروح، وقد تبين مزروع PCL electrospun أن تكون غير مناعة وعلى الاندماج في النسيج المحلية دون ردود فعل سلبية 13. ويظهر صورة SEM من electrospun PCL في الشكل 1.
مع الحالية FDA التنظيمية المعايير وفعالية وسلامة في كل النماذج الحيوانية الصغيرة والكبيرة ستكون هناك حاجة لPCL أو أي ACL الكسب غير المشروع هندسيا آخر للانتقال إلى التجارب السريرية في الولايات المتحدة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن الظروف في الجسم الحي في كثير من الأحيان تزيد خصائص من ACL الكسب غير المشروع الأنسجة في المختبر هندسيا. نموذج الفئران من إعادة الإعمار ACL ذاتي مع المثنية digitorأم إبهام اليد وتر وقد وصفت سابقا، والذي كان قطعت ACL الأصلي، الفخذ وتم حفر أنفاق عظام الساق، وصدر الكسب غير المشروع والمضمون في مكان مع خياطة 17-22. في هذه الورقة، فإننا سوف تصف تعديل هذا النموذج لتقييم بدائل ACL هندسيا وليس من أجل إعادة البناء القائم على الطعم الذاتي (الشكل 2).
على الرغم من أن العديد من نماذج حيوانية موجودة لهندسة الأنسجة الرباط، والفئران هو مفيد بالمقارنة مع النماذج الكبيرة لعدد من الأسباب. وتشمل هذه المزايا أسهل تربية والمناولة، والاعتبارات الأخلاقية أقل، وانخفاض 17،23 التكلفة. وبالإضافة إلى ذلك، تم استخدام نموذج الفئران على نطاق واسع نموذجا لتجديد الأنسجة العظمية، بما في ذلك الغضاريف والأوتار، وهندسة الأنسجة العظام 24. على وجه الخصوص، تم اختيار الفئران عارية athymic بسبب افتقارها إلى الخلية بوساطة استجابة مناعية 25، والسماح للفي نهاية المطاف زرع سالخلايا المانحة xenogeneic و في هذا النموذج لزيادة تعزيز الكسب غير المشروع هندسيا في المستقبل. في هذه الورقة الأساليب، وصفنا تصنيع وزرع جراحية لاخلوي، البوليمر الكسب غير المشروع القابلة للتحلل في نموذج الفئران athymic إعادة الإعمار ACL.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: تمت الموافقة على جميع العمليات الجراحية الحيوان من قبل الموظفين والحيوان البيطرية جنة استخدام المحلية قبل بدء التجارب.
1. إعداد Electrospun Polycaprolactone السقالات
- تزن وحل استر الصف الطبية بولي إنهاء (ε-caprolactone) في شكل حبيبات في 1،1،1،3،3،3-hexafluoro-2-بروبانول لإنشاء 10٪ ث / ث حل البوليمر PCL. السماح للضجة الحل باستخدام لوحة ضجة لا يقل عن 3 ساعة لضمان حل متجانس.
- Electrospin الحل PCL لخلق صفعة من الألياف PCL الانحياز للغاية لسقالة تلفيق.
- تحضير الإعداد غزل كهربائي في غطاء الدخان الكيميائية مع مروحة في جميع الأوقات. هذا يتكون من مربع الاكريليك كبيرة من شأنها أن تكون بمثابة وسيلة فراغ معزول لعملية غزل كهربائي ولها نقاط الدخول من أجل حل PCL المصدر مدفوعا مصدر التيار الكهربائي، وجمع مغزل التي تعمل بالطاقة الحركية، ومنفذ فراغ. تنظيف الأكريليكج مربع تماما مع الإيثانول وتغطي جميع الأسطح مع أوراق بارافيلم لإزالة أي الشوائب التي قد تؤثر سلبا على جودة المنتج electrospun.
- الحمل حوالي 3 مل من محلول أعلاه في حقنة 10 مل مع كليلة انتهت 18 G، 1 ½ بوصة إبرة. إزالة أي فقاعات الهواء عن طريق دفع ما يصل حقنة. حل القفل إلى ضخ حقنة للبرمجة. أدخل الإبرة من خلال ثقب صغير في مربع الاكريليك مع ترك حوالي ½ بوصة من الإبرة من خارج منطقة الجزاء الاكريليك لمرفق من السلك مصدر الجهد.
- استخدام 30 ملم الدورية مغزل مخرطة باسم جامع للألياف PCL الانحياز للغاية. تغطية مغزل بإحكام بشريط رقيقة من رقائق الألومنيوم. قفل مغزل في السيارات على الجانب الآخر من مربع حوالي 15 سم بعيدا عن إبرة حقنة.
- إدراج خرطوم البلاستيكية في منفذ فراغ والاتصال بمصدر فراغ غطاء الدخان. بدوره على مصدر فراغ وتغطية الاكريليك مربع مع غطاء.
- Sوآخرون معدل ضخ ضخ حقنة للبرمجة إلى 2.5 مل / ساعة. تشغيل المحرك لتشغيل مغزل في 3،450 دورة في الدقيقة وإرفاق قيادة إيجابية من مصدر الجهد لطرف الإبرة من خارج منطقة الجزاء باستخدام مقطع التمساح.
- مرة واحدة وقد بدأت ضخ الحل PCL، بدوره على مصدر الجهد وتعيين إلى الجهد التشغيل 20 كيلو فولت.
- يبث الحل لمدة 12 دقيقة إلى إنشاء صفعة متجانسة من 0.5 مل من محلول PCL.
ملاحظة: في المتوسط، كل صفعة لديها ما يكفي من المواد electrospun لخلق ورقتين ستة الشريط، والتي يمكن استخدامها لخلق ما مجموعه ثلاثة السقالات أربعة الطبقات.
- قطع الليزر الكفة PCL لتشكيل ورقة صغيرة متعددة على VersaLaser كتر 2.3 تعمل على إعداد منخفض فراغ، 10.0 كيلو هبوط الجهد، 6.4 ملم العمل عن بعد، وقطر التحقيق من 3.0.
ملاحظة: في هذا المثال، تم استخدام التصميم بمساعدة الكمبيوتر لإرشاد القاطع لانتاج صفائح متعددة من 1.5 مم × 35 مم × 150 ميكرون السقالات معوزعت بالتساوي 150 ميكرون ثقوب قطرها في منطقة المسام بنسبة 15٪. - البلازما حفر السقالات PCL باستخدام نظافة البلازما للحث على hydrophilicity من سطح PCL مع أيون التسارع. تعيين فراغ إلى 450 mTorr وعلاج السقالات لمدة 30 ثانية على قوة عالية (29.6 W).
- يستحم السقالات في 70٪ من الإيثانول في بيئة معقمة.
- معطف السقالات الفردية مع الكولاجين لتسهيل التصاق الخلايا وانتشارها في الجسم الحي.
- إيجاد حل الكولاجين الطلاء عن طريق تمييع ل8: 1: 2.5 محلول معقم من Purecol الكولاجين 3 ملغ / مل حل القياسية، 10X PBS و 0.1 N هيدروكسيد الصوديوم 1: 9 في برنامج تلفزيوني 1X في 4 درجات مئوية. مزيج دقيق لضمان حل التجانس.
- معطف الفردي 1.5 مم × 35 مم × 150 ميكرون السقالات مع فيلم طبقة رقيقة من الحل الكولاجين أعلاه. السماح ليجف لمدة 24 ساعة في بيئة معقمة.
- باستخدام الخيوط الجراحية 5-0 Vicryl، مكدس ويضعوا أربعة الفردي 1.5 مم × 35 مم × 150 ميكرون السقالاتباستخدام Krackow غرزة لخلق النهائية 0.6 مم، متعددة الطبقات، المغلفة الكولاجين سقالة التي هي على استعداد لزرع.
2. بروتوكول جراحة الجرذ
- لحث التخدير عن طريق وضع الفئران في غرفة الاستنشاق وتقديم 2٪ الأيزوفلورين مع 2 لتر / دقيقة الأوكسجين. تأكيد الفئران هو تخدير كاف عن طريق الضغط على هند القدم وتقييم لأي رد.
- على الطاولة الخلفي غير معقمة، حقن تحت الجلد 25 ملغ / كغ الأمبيسلين و 0.03 ملغم / كغم البوبرينورفين.
- تطبيق مرهم للعين للعيون. كليب الفراء من أطرافهم هند المنطوق والإعدادية موقع الجراحية مع ثلاثة الدعك بالتناوب من الكلورهيكسيدين والايثانول 70٪.
- نقل الفئران على طاولة العمليات، على وسادة ساخنة لمنع انخفاض حرارة الجسم. آمن مخروط الأنف، والحفاظ على التخدير من خلال الإجراء مع 2٪ الأيزوفلورين في 2 L / الأكسجين دقيقة، ألقى مخروط الأنف. ثنى بطريقة معقمة، وترك الطرف المنطوق عرضة للخطر.
- جعل 2 سم طويلة وسطي شق عمودي إلى الركبة، وتركزت على مستوى الرضفة. التراجع الجلد أفقيا حتى يتركز شق على الركبة.
- استخدام مشرط لجعل بضع المفصل المحيط بالرضفة وسطي عن طريق خفض مجرد وسطي لالرضفة وتوسيع نطاق قريب إلى مستوى تقاطع العضلي الوتري للعضلات الفخذ وبشكل أقصى إلى مستوى الإدراج الوتر الرضفي على tubercule عظام الساق. والحرص على عدم قطع الرضفي أو عضلات الفخذ الأوتار.
- الرضفة الإفراج أفقيا من خلال جعل شق عمودي 1 سم من خلال كبسولة الركبة فقط الجانبية لوتر الرضفة.
- ضمان تمديد الركبة. خذ مقصا الجميلة وتمر تحت الرضفة من الأفقي إلى وسطي. نشر مقص بضع مرات بحيث يمكن ترجمة آلية الباسطة إلى أي من الجانبين.
- في حين الثناء روقال انه في الركبة، وترجمة الرضفة أفقيا لفضح داخل مفصل الركبة. ضمان التصور واضحا لالثلمة بين واللقم الفخذ. باستخدام مشرط، المسح الشامل للACL وPCL في الدرجة الأولى.
- تحميل الحفر السلطة مع 1.6 ملم ك-السلك. وضع ك-الأسلاك طرف على الأصل ACL في الثلمة بين. حفر علوي وحشي وتصور نقطة الخروج على الجانب الوحشي من عظم الفخذ، وإزالة أي نوع من الأنسجة الناعمة ضرورية كما هو الحال مع مشرط. تمرير ك سلك الدخول والخروج عدة مرات لضمان مرور واضح للالكسب غير المشروع.
- ضع ك-السلك على البصمة ACL على هضبة عظام الساق. حفر anterolaterally وتصور نقطة الخروج على الساق القريبة أمامي جانبي. استخدام مشرط لمسح الأنسجة اللينة حسب الضرورة بحيث النقطة حيث ك سلك يخرج الساق هو تصور تماما.
- تمرير تقصير كيث إبرة (مثالي لا يزيد عن 2 بوصة طويلة) من خلال نفق عظم الفخذ. كاتب الموضوع طرفي الخيط من طرف واحد من الكسب غير المشروع من خلال عين Kإييث الإبرة. استخدام إبرة لسحب واحدة من نهاية الكسب غير المشروع من خلال النفق الفخذ.
- كرر الخطوة السابقة لتمرير الطرف الآخر من الكسب غير المشروع من خلال النفق قصبي.
- استخدام 4-0 Vicryl خياطة ليضعوا نهاية الفخذ من الكسب غير المشروع لالمحيطة السمحاق أو الأنسجة الرخوة الأخرى مع غرزة الرقم من بين ثمانية. يدويا التوتر الكسب غير المشروع مع الركبة في التمديد. يضعوا نهاية عظام الساق من الكسب غير المشروع لالمحيطة السمحاق أو الأنسجة الرخوة الأخرى مع غرزة الرقم من بين ثمانية.
- استخدام مقص لقطع الكسب غير المشروع الزائد على طرفي، وترك 1-2 ملم في نهاية كل الماضي غرزة الرقم من بين ثمانية.
- تمديد الركبة والحد من الرضفة. باستخدام 4-0 vicryl، ضع الرقم من بين ثمانية غرزة واحدة لإغلاق كبسولة مشتركة وسطي، ومنع خلع جزئي الجانبي للالرضفة.
- إغلاق الجلد مع تشغيل تحت البشرة 5-0 Monocryl أو Vicryl خياطة، مع الحرص على عدم خياطة العضلات الأساسية أو لديك أي خياطة مرئية مرة واحدة يتم إغلاق الجلد.
- Injeالفئران المقطعية تحت الجلد مع البوبرينورفين كل 12 ساعة ليصبح المجموع ثلاثة أيام بعد العمل الجراحي. تحقق من موقع الجراحية لأي الصرف أو تفزر الجرح في وقت الحقن. العرج وبعض التورم طبيعية في الأيام القليلة الأولى بعد الجراحة، ولكن على الفور معالجة أي مخاوف ما بعد الجراحة بالتعاون مع موظفي البيطري. ويمكن إرجاع الحيوان في السكن الاجتماعي في 2 أسابيع بعد العمل الجراحي، وعندما تلتئم الشقوق الجراحية تماما.
3. بروتوكول جمع البيانات
- في وقت التضحية، خنق الفئران بشكل فردي في غرفة مغلقة CO 2 تليها بضع الصدر.
- حصاد كل من أطرافه إعادة بنائها جراحيا والمقابل عن طريق فصل في مفصل الورك.
- لأطرافه أعيد بناؤها، وإزالة جميع الأنسجة اللينة، بما في ذلك الرباط الصليبي الخلفي وبقايا من ACL الأصلي تعطلت جراحيا، من خلال تشريح غرامة لعزل فقط عظم الفخذ، الساق، والكسب غير المشروع. <لى> للأطرافه المقابل، وإزالة جميع الأنسجة اللينة عدا ACL الأصلي وكذلك عظم الفخذ والساق عن طريق تشريح غرامة.
- استخدام أداة دوارة مثل دريميل، لإزالة كافة ولكن ¾ إلى 1 سم من العظام من كل طرف من مجمع عظم الفخذ-الطعم الساق.
- خلال هذه العملية وطوال اختبار النشاط الحيوي، بشكل منتظم ومتكرر رش المناطق الرباطية مع محلول ملحي لمنع جفاف الركبة تحصد الأمر الذي قد يغير زورا النتائج.
- تأمين عظم الفخذ والساق بلف 28 G أسلاك الفولاذ المجلفن حول الكردوس من كل العظام بشكل منفصل. وهذا لمنع غير دقيقة البيانات اختبار النشاط الحيوي من فشل الشد من السابق لأوانه من العينة في العظام وليس في الرباط من الفائدة.
- وعاء عظم الفخذ في خليط من الاسمنت polymethylmethacrylate (PMMA) العظام. للقيام بذلك، ومزيج مكونات الاسمنت اثنين واستخدامها على الفور خليط لزج لتأمين عظم الفخذ في المعادن، والتغليف تماما diaphysis من العظام في وعاء ملاطي مع الكردوس والرباط المرفقة جاحظ بحرية. السماح عفوية بلمرة الجذور الحرة لتحويل تدريجيا مكونات لزجة مختلطة لمادة دوغي ونهاية المطاف إلى مصفوفة صلابة الصلبة.
ملاحظة: هذه العملية تستغرق عدة دقائق ويمكن رصدها من خلال تقييم درجة حرارة بلعة مصنوعة من يدوياالاسمنت المتبقية. درجة الحرارة ينبغي أن تزيد بشكل عابر خلال رد فعل البلمرة الطاردة للحرارة وتهدأ لRT بعد يتصلب المادية. - كرر نفس العملية أعلاه لتدعيم الساق، إلا مع الحفاظ على أربطة الركبة عند 20 درجة انثناء للاختبار الميكانيكية المثالي.
- جبل مجمع عظم الفخذ-الطعم الساق ملاطي على جهاز اختبار الشد، والاستعداد لتحميل سجل والتشريد بوصفها وظيفة من الزمن من بداية التوتر إلى الفشل. في هذا المثال، استخدمنا نموذج INSTRON 5564 مع تحميل خلية 1 كيلو نيوتن.
- قبل التوتر الكسب غير المشروع إلى 2 N بمعدل المنحدر من 0.5 N / دقيقة ومن ثم اختبار الكسب غير المشروع للفشل بمعدل سلالة من 0.5 ملم / ثانية. وخلال هذه العملية، تأكد من أن الرباط هو الفشل في منتصف مادة وأن عظم الفخذ والساق عظمي وآمن وليس الفشل قبل الأوان، والتي قد تقييم غير دقيق خصائص النشاط الحيوي في الرباط اختبارها.
- استخدام لدت التحميل النزوحمنحنيات لحساب الحمل الفشل وصلابة من الرباط اختبارها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في تجربتنا من 92 عملية جراحية الفئران من قبل جراح واحد، يعني الوقت المنطوق من شق إلى الانتهاء من الجرح كان 16.9 دقيقة، مع انحراف معياري 4.7 دقيقة. في وقت التضحية، وزن الفئران 356 ± 23 ز. جميع الفئران تسامحت الجراحة بشكل جيد، وشهدت أي مضاعفات. مباشرة بعد الجراحة، لوحظت الفئران لتحمل الوزن على أقصى المنطوق، ولكن عرضت يعرج طفيف. قبل أسبوع واحد بعد العملية، وجميع الفئران التجول مع أي يعرج ملموس. اكتسبت الحيوانات عن الوزن بشكل مطرد خلال الدراسة، مع عدم وجود تشوهات الملحوظة في عادات التغذية، التبول، أو التغوط. سريريا، لا تفزر الجرح الإجمالي، حمامي، وقد لوحظ تورم، والانصباب، أو الصرف بعد العمل الجراحي.
العمليات الجراحية الفئران 92 المذكورة أعلاه فلم يتم القيام في المقام الأول لأغراض هذه المخطوطة الأساليب. بدلا من ذلك، كانت تستخدم لاختبار مختلف الظروف الكسب غير المشروع الهندسة. في حين أن detaileاختبار الميكانيكية د والنتائج النسيجية هم خارج نطاق هذه الورقة، مزيد من التفاصيل يمكن العثور عليها في ورقة كتبها ليونغ وآخرون. 26. باختصار، في 16 أسابيع في أعقاب إعادة الإعمار، أظهر التحليل النسيجي للركبة مقطوع أن المصفوفة سقالة أصبحت مخترقة إلى حد كبير من الخلايا الليفية إفراز الكولاجين اليوزيني مع التكامل جيدة في الأنفاق العظام (الشكل 3). في هذا الوقت، تم السقالة resorbed تماما وكان تصور أي دليل من البوليمر. بالإضافة إلى ذلك، المناعية للعلامة CD68 بلعم أظهرت استجابة التهابية الحد الأدنى في 16 أسبوعا بعد العملية (الشكل 4).
تم تقييم خصائص النشاط الحيوي مباشرة بعد التضحية. فشلت جميع العينات التي تم فحصها في منتصف مادة (الشكل 5). باستخدام المنحنيات التحميل النزوح الناتجة عن اختبار الشد (الشكل 6)، تحميل الفشل وصلابةحسبت لكل مجموعة. في 16 أسبوعا بعد زرع، وكان الكسب غير المشروع electrospun البوليمر تقريبا ضعف حمولة الذروة وصلابة من الكسب غير المشروع اختبار على الفور بعد زرع، ولكن كانت هذه القيم أقل من ACL الأصلي 26.
الشكل 1. SEM صورة electrospun polycaprolactone سقالة مع ألياف الانحياز. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. نموذج الفئران Athymic إعادة الإعمار ACL. (A) عزل في وتر الرضفة عن طريق وسطي المحيط بالرضفة شق الجلد. (ب) حفر tunne الفخذلتر باستخدام 1.6 ملم ك-السلك. (C) حفر نفق عظام الساق. (D) الموضع من 1.2 ملم كيث الإبرة من خلال نفق الفخذ لسحب الكسب غير المشروع من خلال. (E) Electrospun polycaprolactone الكسب غير المشروع سحب من خلال نفق الفخذ. (F) الكسب غير المشروع سحب من خلال كل من الأنفاق الفخذ وعظم الساق، قبل أن يتم قطع نهايات وخياطة لالسمحاق، ويتم تنفيذ إغلاق الطبقات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. الهيماتوكسيلين ويوزين تلطيخ من الكسب غير المشروع electrospun البوليمر (أعلى) في نفق عظام الساق العظام (يسار)، midsubstance (وسط)، ونفق عظم الفخذ (يمين). وعلى سبيل المقارنة، يظهر ACL الأصلي (القاع)، في عظام الساق الإدراج ( الأيسر)، midsubstance (مnter) والأصل الفخذ (يمين)، 10X. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. اللونية تلطيخ المناعية للCD68، وهو علامة للحصول على الضامة. نوعيا، يبدو أن هناك تلطيخ قليلا أكثر إيجابية في النفق العظام في 8 أسابيع من في المنطقة داخل المفصلية من الكسب غير المشروع أو في 16 أسابيع بعد العملية. ويبدو أن هناك الحد الأدنى من التهاب في الطعوم. جميع الصور هي 20X التكبير. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5. صور من الاختبار الميكانيكي للزرع الكسب غير المشروع electrospun، مما يدل على فشل في midsubstance من الكسب غير المشروع. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6. عينة منحنى الحمل النزوح عن الأنسجة المهندسة ACL الكسب غير المشروع في 16 أسبوعا بعد زرع في نموذج الفئران athymic. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
إصابات ACL هي حالة شائعة في جراحة العظام الرياضية، مع خيارات محدودة لإعادة الإعمار في الوقت الحاضر. من أجل تطوير الأنسجة المهندسة بديلا مناسبا للACL من شأنها أن تسمح تجديد في الجسم الحي، لا بد من نموذج حيواني مناسبة. في هذه الدراسة، وصفت تلفيق من الكسب غير المشروع المهندسة القابلة للتحلل، كما هو في زرع في الجسم الحي باستخدام نموذج استنساخه من إعادة الإعمار ACL في الفئران athymic. ويمكن استخدام هذا النموذج لتقييم مختلف الطعوم ACL الهندسة الأنسجة المكونة من مختلف المواد الحيوية، بما في ذلك الطعوم الخلوية والذين يعانون من عوامل النمو يدمج.
في هذه الدراسة معينة، ونحن اختبار على اخلوي، الكسب غير المشروع electrospun polycaprolactone مع ألياف الانحياز. وقد زرع الدراسات السابقة من الأنسجة المهندسة وإعادة الإعمار الرباط مضفر أو ترقيع مقذوف مصنوعة من مجموعة متنوعة من المواد بما في ذلك الحرير، PLLA، والبولي يوريثين 27-29. ولم تسفر أي من هذه المواد في كل من الاندماج الناجح من الكسب غير المشروع وخلاصة من الخواص الميكانيكية للACL 7. في حين أن العديد البوليمرات لديها القدرة لاستخدامها في إعادة الإعمار الرباط، حققت هذه الدراسة PCL لأنه خامل بيولوجيا، وغير سامة، ويتحلل ببطء في الجسم الحي، ويتم تصنيعها بسهولة في التشكل المطلوب 30. PCL هو أيضا قوي ميكانيكيا ويظهر التشوه القليل من البلاستيك تحت الضغط الميكانيكي 30. تم تأسيس استخدامه في الأدب هندسة الأنسجة العظمية كمستودع يمكن الاعتماد عليها لتمعدن والنوع الأول الكولاجين ترسب بسبب بنية ألياف نانوية الانحياز لها عند electrospun 31. أيضا، فقد تبين أن سطح عالية للحجم ونشرها على نطاق وطول قصيرة من الألياف قطر الصغيرة في الحصير PCL electrospun مواتية للتسليم المخدرات للرقابة واستخدامها في هندسة الأنسجة 31.
وقد تبين أنكانت الطعوم المزروعة حيويا على أساس عدم وجود رد فعل سلبي السريري، وسهلت تسلل خلية الأصلي كما رأينا تشريحيا في 16 أسابيع بعد العملية. نحن تستخدم نموذج حيواني athymic في هذه الدراسة كما هو المرحلة الأولى من مشروع المرحلة الثانية التي سوف تستخدم في نهاية المطاف الخلايا البشرية المزروعة مع الكسب غير المشروع، وسيكون نموذجا athymic تقليل المخاوف بشأن رفض الخلايا البشرية. السقالة electrospun البوليمر سهلت كل من الخلية ومصفوفة المحاذاة في ACL مجدد. كما رأينا في المقطع العرضي من الكسب غير المشروع، والانحياز الغالبية العظمى من الخلايا في اتجاه الألياف. الطعوم مزروع أظهرت زيادة الخواص الميكانيكية مع مرور الوقت. تحميل لفشل الطعوم البوليمر الضعف بالمقارنة مع ACL أعيد بناؤها على الفور بعد العمل الجراحي. في حين حمل الذروة وصلابة من الكسب غير المشروع PCL قد تبدو منخفضة بالمقارنة مع ACL الأصلي، من المهم أن نتذكر أن هذه النتائج ينبغي أن ينظر إليه في ضوء والعمل أنه حتى معيار الذهب الحالي، طعم ذاتي أو المغايرة، ليست قادرة على تحقيق القوة الميكانيكية للACL صحي بنسبة 16 أسابيع بعد العمل الجراحي. على سبيل المثال، كان شو وآخرون. وذكرت على الطعم الذاتي ACL في نموذج أرنب، حيث كان الذروة 20٪ -35٪ وصلابة بنسبة 23٪ -36٪ أن من ACL الأصلي صحي من خلال 6 أشهر بعد العمل الجراحي 32. بالإضافة إلى ذلك، أظهرت دراسة المزروع في نموذج الكلاب ما يقرب من 30٪ من الذروة و 40٪ صلابة من ACL الأصلي بنسبة 30 أسابيع بعد العمل الجراحي 33.
بينما هو خارج نطاق هذه الورقة، قد يتم تنفيذ العديد من التحليلات الأخرى لتقييم جودة الكسب غير المشروع بعد استخدام هذا النموذج الحيواني. وهذا يشمل لكن لا يقتصر على التصوير إضاءة الحيوية أو الأشعة السينية والأشعة المقطعية في الجسم الحي، وعدد كبير من البقع والمقايسات المناعية مثل لعلامات الكولاجين أو علامات للالتهابات. على سبيل المثال، نشرنا سابقا النتائج على القياس الكمي المشترك تجانب وسطيالألياف llagen باستخدام picrosirius تلطيخ الأحمر بعد زرع السقالات PCL electrospun مزروع في هذا النموذج الحيواني 26.
وتشمل القيود المحتملة لهذه الدراسة اختيار نموذج الحيوان نفسه. الخلافات المتأصلة في علم التشريح ومشية في الفئران الرباعي مقارنة مع البشر ذو قدمين يعني أن الميكانيكا الحيوية من ACL لا تختلف، وينبغي القيام به أن الترجمة من المعلمات السريرية بين النماذج مع معرفة هذه القيود. ومع ذلك، هذه المشكلة الشائعة في الدراسات الحيوانية ولا ينفي أهمية أو المحتملة متعدية لهذا البحث.
لم يكن هناك بحوث مثيرة للاهتمام على البروتوكولات اللاحقة للعمليات الجراحية لإعادة الإعمار ACL الفئران باستخدام الطعم الذاتي التي يمكن تطبيقها لدينا نموذج لاستبدال ACL هندسيا في المستقبل. وقد استخدمت أجهزة التثبيت الخارجي لشل حركة الفئران بعد العملية من أجل السماح للتحسين الشفاء وتر العظم في نموذج الطعم الذاتي وتر19. بالإضافة إلى ذلك، فقد تبين أن تأخر تحميل دوري، مثل مع الجهاز انثناء والإرشاد وصفها ستاسياك وآخرون 34، قد تزيد من تعزيز الطعم الذاتي التأسيس 20. ومع ذلك، كما تبين أن مدة قصيرة حجم منخفض تحميل دوري يمكن أيضا أن يسبب زيادة الالتهاب وانخفض تكوين العظام في واجهة العظام وتر 35. يجب إجراء مزيد من التحقيقات لتقييم مدى انطباق هذه النتائج إلى electrospun، القائم على البوليمر استبدال ACL، ومثل هذا الكسب غير المشروع سيكون له الخصائص الميكانيكية الأولية أضعف من المزروع وتر.
وقد وضعت هذه الدراسة نموذجا لإعادة الإعمار ACL مع الكسب غير المشروع electrospun لا خلوي في الفئران athymic، القائم قبالة التعديلات من الفئران الطعم الذاتي نموذج الموصوفة سابقا 17-22. أثبتنا وضع الكولاجين كثيفة المنحازة في جميع أنحاء الكسب غير المشروع مع تحسن المتزامنة من الحمل إلى فشلمن الكسب غير المشروع مع مرور الوقت. تقدم هذه الدراسة أيضا دليلا على مفهوم لتوظيف هذا النموذج في المستقبل لتقييم مختلف الطعوم الأنسجة المهندسة لإعادة الإعمار ACL. على وجه الخصوص، والفئران athymic يسمح لزرع البذور من الخلايا المانحة xenogeneic.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر غابرييل أروم ومايكل Yeranosian للمساهمات التقنية لتكرار السابقة من هذا المشروع. وقد تم تمويل هذا المشروع من قبل الطبيب السريري OREF عالم التدريب غرانت (NL)، سمو لي الجراحية بحوث غرانت (NL)، وقدامى المحاربين إدارة BLR & D مراجعة الاستحقاق 1 I01 BX00012601 (DM) والعضلات والعظام زرع جائزة الباحث الشاب مؤسسة (FP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medical grade ester terminated poly (ε-caprolactone), granule form (MW = 110,000) |  Lactel Absorbable Polymers |
Custom synthesized polymer to desired molecular weight | |
| 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol | Sigma-Aldrich | 105228 | Solvent for PCL polymer |
| 18 G x 1½" bevel needle | BD Medical | 305196 | |
| Remote Infuse/Withdraw Programmable Syringe Pump | Harvard Apparatus | 702101 | |
| VersaLaser VLS2.30 Laser Engraver | Microgeo USA | VLS2.30 | |
| Expanded Plasma Cleaner 115 V | Harrick Plasma | PDC-001 | Plasma etch just prior to collagen coating for surface modification |
| PureCol Collagen Standard Solution, 3 mg/ml | Advanced Biomatrix | 5015-A | Mix 8:1:2.5 solution of PureCol, 10x PBS, 0.1 N NaOH 1:9 in 1x PBS |
| Suture, 5-0 Vicryl | Henry Schein | 1086471 | |
| Suture, 4-0 Vicryl | Henry Schein | 6540072 | |
| Sharp-pointed Dissecting Scissors (Straight; 4.5 inch) | Fisher Scientific | 8940 | |
| Buphrenorphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | B9275 | Use 0.03 mg/kg for both intra- and post-operatively for pain control |
| Ampicillin, injectable | Henry Schein | 1185678 | Use 25 mg/kg subcutaneously during the procedure |
| K-wire, 1.6 mm | Spectrum Surgical | SI040062 | |
| Keith Needle, Straight 1½" | Delasco Dermatology Lab & Supply | KE-112 | |
| Immunocal Decalcifying Solution | Fisher Scientific | NC9491030 | |
| Opticryl Acrylic Resin Bone Cement (PMMA) (Monomer and polymer) | US Dental Depot | OPTICRYL 100410 | |
| Instron Model 5564 Tensile Testing Machine | Instron | 5564 | Any comparable tensile testing apparatus is suitable |
References
- Fetto, J. F., Marshall, J. L. The natural history and diagnosis of anterior cruciate ligament insufficiency. Clin Orthop Relat Res. (147), 29-38 (1980).
- Kim, Y. M., Lee, C. A., Matava, M. J. Clinical results of arthroscopic single-bundle transtibial posterior cruciate ligament reconstruction: a systematic review. Am J Sports Med. 39 (2), 425-434 (2011).
- Andersson, C., Odensten, M., Gillquist, J. Knee function after surgical or nonsurgical treatment of acute rupture of the anterior cruciate ligament: a randomized study with a long-term follow-up period. Clin Orthop Relat Res. (264), 255-263 (1991).
- Klimkiewicz, J. J., Petrie, R. S., Harner, C. D. Surgical treatment of combined injury to anterior cruciate ligament, posterior cruciate ligament, and medial structures. Clin Sports Med. 19 (3), 479-492 (2000).
- Petrigliano, F. A., McAllister, D. R., Wu, B. M. Tissue engineering for anterior cruciate ligament reconstruction: a review of current strategies. Arthroscopy. 22 (4), 441-451 (2006).
- Groot, J. H., et al. Use of porous polyurethanes for meniscal reconstruction and meniscal prostheses. Biomaterials. 17 (2), 163-173 (1996).
- Leong, N. L., Petrigliano, F. A., McAllister, D. R. Current tissue engineering strategies in anterior cruciate ligament reconstruction. J Biomed Mater Res A. 102 (5), 1614-1624 (2014).
- Duling, R. R., Dupaix, R. B., Katsube, N., Lannutti, J. Mechanical characterization of electrospun polycaprolactone (PCL): a potential scaffold for tissue engineering. J Biomech Eng. 130 (1), 011006 (2008).
- Shao, Z., et al. Polycaprolactone electrospun mesh conjugated with an MSC affinity peptide for MSC homing in vivo. Biomaterials. 33 (12), 3375-3387 (2012).
- Tillman, B. W., et al. The in vivo stability of electrospun polycaprolactone-collagen scaffolds in vascular reconstruction. Biomaterials. 30 (4), 583-588 (2009).
- Wise, S. G., et al. A multilayered synthetic human elastin/polycaprolactone hybrid vascular graft with tailored mechanical properties. Acta Biomater. 7 (1), 295-303 (2011).
- Vargel, I., Korkusuz, P., Menceloğlu, Y. Z., Pişkin, E. In vivo performance of antibiotic embedded electrospun PCL membranes for prevention of abdominal adhesions. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 81 (2), 530-543 (2007).
- Cao, H., McHugh, K., Chew, S. Y., Anderson, J. M. The topographical effect of electrospun nanofibrous scaffolds on the in vivo and in vitro foreign body reaction. J Biomed Mater Res A. 93 (3), 1151-1159 (2010).
- Joshi, V. S., Lei, N. Y., Walthers, C. M., Wu, B., Dunn, J. C. Macroporosity enhances vascularization of electrospun scaffolds. J Surg Res. 183 (1), 18-26 (2013).
- Pham, Q. P., Sharma, U., Mikos, A. G. Electrospun poly(epsilon-caprolactone) microfiber and multilayer nanofiber/microfiber scaffolds: characterization of scaffolds and measurement of cellular infiltration. Biomacromolecules. 7 (10), 2796-2805 (2006).
- Vaz, C. M., van Tuijl, S., Bouten, C. V., Baaijens, F. P. Design of scaffolds for blood vessel tissue engineering using a multi-layering electrospinning technique. Acta Biomater. 1 (5), 575-582 (2005).
- Kawamura, S., Ying, L., Kim, H. J., Dynybil, C., Rodeo, S. A. Macrophages accumulate in the early phase of tendon-bone healing. J Orthop Res. 23 (6), 1425-1432 (2005).
- Hays, P. L., et al. The role of macrophages in early healing of a tendon graft in a bone tunnel. J Bone Joint Surg Am. 90 (3), 565-579 (2008).
- Dagher, E., et al. Immobilization modulates macrophage accumulation in tendon-bone healing. Clin Orthop Relat Res. 467 (1), 281-287 (2009).
- Bedi, A., et al. Effect of early and delayed mechanical loading on tendon-to-bone healing after anterior cruciate ligament reconstruction. J Bone Joint Surg Am. 92 (14), 2387-2401 (2010).
- Bedi, A., Kawamura, S., Ying, L., Rodeo, S. A. Differences in tendon graft healing between the intra-articular and extra-articular ends of a bone tunnel. HSS J. 5 (1), 51-57 (2009).
- Fu, S. C., et al. Effect of graft tensioning on mechanical restoration in a rat model of anterior cruciate ligament reconstruction using free tendon graft. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc. 21 (5), 1226-1233 (2013).
- Fan, H., Liu, H., Wong, E. J., Toh, S. L., Goh, J. C. In vivo study of anterior cruciate ligament regeneration using mesenchymal stem cells and silk scaffold. Biomaterials. 29 (23), 3324-3337 (2008).
- Landis, J. R., Koch, G. G. The measurement of observer agreement for categorical data. Biometrics. 33 (1), 159-174 (1977).
- Joshi, S. M., Mastrangelo, A. N., Magarian, E. M., Fleming, B. C., Murray, M. M. Collagen-platelet composite enhances biomechanical and histologic healing of the porcine anterior cruciate ligament. Am J Sports Med. 37 (12), 2401-2410 (2009).
- Leong, N. L., et al. In vitro and in vivo evaluation of heparin mediated growth factor release from tissue-engineered constructs for anterior cruciate ligament reconstruction. J Orthop Res. 10, (2014).
- Seo, Y. K., et al. Increase in cell migration and angiogenesis in a composite silk scaffold for tissue-engineered ligaments. J Orthop Res. 27 (4), 495-503 (2009).
- Freeman, J. W., Woods, M. D., Laurencin, C. T. Tissue engineering of the anterior cruciate ligament using a braid-twist scaffold design. J Biomech. 40 (9), 2029-2036 (2007).
- Bashur, C. A., Shaffer, R. D., Dahlgren, L. A., Guelcher, S. A., Goldstein, A. S. Effect of fiber diameter and alignment of electrospun polyurethane meshes on mesenchymal progenitor cells. Tissue Eng Part A. 15 (9), 2435-2445 (2009).
- Dash, T. K., Konkimalla, V. B. Poly-є-caprolactone based formulations for drug delivery and tissue engineering: A review. J Control Release. 158 (1), 15-33 (2012).
- Yoshimoto, H., Shin, Y. M., Terai, H., Vacanti, J. P. A biodegradable nanofiber scaffold by electrospinning and its potential for bone tissue engineering. Biomaterials. 24 (12), 2077-2082 (2003).
- Xu, Y., Ao, Y. F. Histological and biomechanical studies of inter-strand healing in four-strand autograft anterior cruciate ligament reconstruction in a rabbit model. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc. 17 (7), 770-777 (2009).
- Shino, K., et al. Replacement of the anterior cruciate ligament by an allogeneic tendon graft. An experimental study in the dog. J Bone Joint Surg Br. 66 (5), 672-681 (1984).
- Stasiak, M. E., et al. A novel device to apply controlled flexion and extension to the rat knee following anterior cruciate ligament reconstruction. J Biomech Eng. 134 (4), 041008 (2012).
- Brophy, R. H., et al. Effect of short-duration low-magnitude cyclic loading versus immobilization on tendon-bone healing after ACL reconstruction in a rat model. J Bone Joint Surg Am. 93 (4), 381-393 (2011).
