Introduction
Ön çapraz bağ (ACL) yırtılması diz 1 en yaygın bağ yaralanmaları biridir. Rüptüre ACL'lere cerrahi müdahale olmadan iyileşmek mümkün olduğundan, günlük yaşam yanı sıra spora katılım faaliyetlerine sınırlamalar yılda bir milyar dolar 3 tahmini maliyeti, her yıl 2 ameliyat 175,000 üzerinde hasta götürmek. Şu anda, otogreft veya allogreft tendon ya bağ rekonstrüksiyonu için kullanılır. Yüksek başarı oranları hem otogreft ve allogreft replasmanı ile elde edilebilir olsa da, ciddi komplikasyonlar bu rekonstrüksiyon seçenekleri 4 ile ilişkilidir. Otogreft dokusu, özellikle yeniden rüptür veya çok bağ yaralanma durumlarda, donör sitesi morbidite ile ilişkilidir ve arz sınırlıdır. Öte yandan, alograft doku gecikmeli aşı entegrasyonu, yan inflamatuar yanıtı, teorik enfeksiyon riski, ve sınırlı Supp ile bağlantılıdırly 5. Sentetik olmayan parçalanabilir greftler 1970 ve 1980'lerde geliştirilen, ancak erken greft rüptürü, yabancı cisim reaksiyonu, osteoliz ve sinovit 6 engel edildi. Bu ciddi kaygılar sonucunda, Amerika Birleşik Devletleri'nde klinik kullanıma sentetik greftler şu anda.
Nedeniyle mevcut greft seçenekleri ile ve biyoloji, mühendislik ve rejeneratif tıp son gelişmeler bu sınırlamaları, ACL aşılama için bir doku mühendisliği çözeltide büyük ilgi olmuştur. Güncel doku mühendisliği stratejileri kalıcı sentetik malzeme implantasyonu 7 ile ilgili sınırlamaları kaçınarak konak doku gelişimine izin vermek için parçalanabilir biyolojik ve sentetik malzemeler kullanır.
Polikaprolakton (PCL), FDA yapışma bariyer dahil olmak üzere tıbbi uygulamalarda bir dizi için onaylanmış ve 8 pansumanla olan biyolojik olarak parçalanabilir bir polimer, bu u olmuşturvasküler, kemik, kıkırdak, sinir, deri ve özofagus doku mühendisliği 5,9-16 olmak üzere geniş bir uygulama çeşitli sed. Uygun biyolojik uyumluluk, nispeten uzun bir in vivo yarı-ömrü, uygun bir mekanik mukavemet ve yüksek elastikiyet doku mühendisliği Bu polimerin popülerlik katkıda bulunur. Yara iyileşmesinin bir kemirgen modelinde, implante electrospun PCL olmayan immünojenik olduğu ve yan etkileri 13, yerel doku içine entegre olduğu gösterilmiştir. Electrospun PCL bir SEM görüntüsü, Şekil 1 'de gösterilmiştir.
Hem küçük hem de büyük hayvan modellerinde geçerli FDA düzenleyici standartlar, etkinliği ve güvenliği ile Amerika Birleşik Devletleri'nde klinik çalışmalarda içine taşımak için PCL veya başka herhangi bir mühendislik ACL grefti için gerekli olacaktır. Ayrıca, in vivo koşullar genellikle in vitro doku mühendisliği ACL greft özelliklerini artırabilir. Fleksör digitor ile otolog Rekonstrüksiyon bir sıçan modelium longus tendonu daha önce yerel bir ACL, kesilmiş Femoral ve tibial tünel delinmiştir ve aşı geçirildi ve ameliyat dikiş ipliğinin 17-22 ile yerine tespit edildi ki, tarif edilmiştir. Bu yazıda, mühendislik ACL değiştirmeleri değerlendirilmesi için yerine otogreft-tabanlı yeniden (Şekil 2) için bu modelin bir değişiklik anlatacağız.
Birçok hayvan modelleri bağ doku mühendisliği için mevcut olmasına rağmen, sıçan nedenlerle bir dizi için büyük modellere göre avantajlıdır. Bu avantajlar kolay hayvancılığı ve kullanım, daha az etik hususlar ve düşük maliyet 17,23 içerir. Buna ek olarak, fare modeli kıkırdak, tendon ve kemik doku mühendisliği 24 de dahil olmak üzere ortopedik doku rejenerasyonu için bir model olarak yaygın bir şekilde kullanılmaktadır. Özel olarak, atimik çıplak sıçan nihai implantasyon o sağlayan, hücre-aracılı bağışıklık karşılığının 25 kendi eksikliği nedeniyle seçilmiştirBu modelde f ksenogeneik donör hücreleri gelecekte daha da mühendislik greft geliştirmek için. Bu yöntemler yazıda ACL rekonstrüksiyonu bir atimik sıçan modelinde imalat ve acellular implantasyonu, biyolojik olarak parçalanabilen polimer greft tarif.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Tüm hayvan deneyleri ameliyatları başlamadan önce yerel veteriner personeli ve hayvan kullanımı komitesi tarafından onaylanmıştır.
Electrospun Polikaprolakton iskelelerinin hazırlanması 1.
- A% 10 oluşturmak için 1,1,1,3,3,3-heksafluoro-2-propanol içinde granül halinde tıbbi sınıf esteri sona poli (ε-kaprolakton) tartılır ve çözünmesi PCL polimer çözeltisi ağırlık /. Homojen bir çözelti sağlamak için, en az 3 saat süreyle bir karıştırma plakası kullanılarak çözelti kaynamaya bırakılır.
- PCL çözüm Electrospin iskele imalatı için son derece uyumlu PCL liflerin bir manşet oluşturmak için.
- Her zaman üzerinde fan ile bir kimyasal davlumbaz elektrospinning kurulum hazırlayın. Bu, bir gerilim kaynağı, motorlu toplama mandrel ve bir vakum portu tarafından tahrik edilen bir kaynak, PCL çözeltisi için giriş noktaları elektro işlemi için izole edilmiş bir vakum ortamı olarak hizmet etmek ve var olan büyük bir akrilik bir kutudan kutudan oluşmaktadır. Akrilik temizleyinc kutusu iyice etanol ile ve electrospun ürünün kalitesini bozabilir herhangi kirleri çıkarmak için Parafilm levhalar ile tüm yüzeyleri örtün.
- Bir küt bir 10 ml şırınga yukardaki çözelti yük, yaklaşık 3 mi 18 g, 1 ½ inç iğne sona erdi. Şırınga yukarı iterek hava kabarcıklarını çıkarın. Programlanabilir şırınga pompası içine Kilit çözüm. Gerilim kaynağı tel takılması için akrilik kutunun dışında ½ iğne inç bırakarak akrilik kutuya küçük bir delikten iğne takın.
- Çok hizalanmış PCL elyaflar için toplayıcı olarak 30 mm dönen torna mandrelini kullanın; alüminyum folyodan oluşan ince bir şerit ile sıkıca mandrel kapsamaktadır. Yaklaşık 15 cm uzakta şırınga iğnesi kutusunun karşı tarafında motora mandrel kilitleyin.
- Vakum portuna plastik hortum takın ve davlumbaz vakum kaynağına bağlayın. Vakum kaynağı açın ve bir kapak ile akrilik kutusu kapağı.
- Sve 2.5 ml / saat programlanabilir şırınga pompa infüzyon hızı. 3,450 rpm'de mandrel işletmek ve bir timsah klibi kullanarak kutunun dışında iğne ucu gerilim kaynağının pozitif kurşun takmak için motorun açın.
- PCL çözümünün infüzyon başladıktan sonra, gerilim kaynağı açmak ve bir 20 kV çalışma gerilimi ayarlanır.
- PCL çözeltisi, 0.5 ml, homojen bir manşet oluşturmak için 12 dakika boyunca solüsyon infüzyonu.
Not: Ortalama olarak, her bir kol ağzı üç ya da dört-katmanlı yapı iskeleleri bir toplam oluşturmak için kullanılabilecek iki altı şerit levha oluşturmak için yeterli electrospun malzemesine sahiptir.
- Lazer düşük vakum ayarı, 10.0 keV iniş gerilimi, 6.4 mm çalışma mesafesi ve 3.0 prob çapında işletilen bir VersaLaser Kesici 2.3 birden fazla küçük yaprak oluşturmak için PCL manşet kesti.
NOT: Bu örnekte, bir bilgisayar destekli tasarım x 35 mm x 150 mm iskeleleri ile 1.5 mm arasında birden fazla yaprak elde etmek için kesici talimat için kullanılaneşit% 15 gözenek alanı 150 mikron çaplı delikler dağıttı. - Plazma iyon ivme ile PCL yüzeyinin hidrofilikliğinin ikna etmek için bir plazma temizleyici kullanarak PCL iskeleleri etch. 450 mTor ve tedavi yüksek güç (29.6 W) 30 saniye iskeleleri vakum ayarlayın.
- Steril bir ortamda% 70 etanol içinde iskeleleri batırın.
- Coat kollajen ile bireysel iskeleleri in vivo hücre yapışmasını ve çoğalmasını kolaylaştırmak için.
- 4 ° C'de 1x PBS, 9: 1: Purecol kollajen 3 mg / mL standart solüsyon, 10x PBS ve 0.1 N NaOH 1 2.5 steril çözelti 8 seyreltilmesiyle kollajen kaplama çözeltisi oluşturur. Çözelti homojenliği sağlamak için iyice karıştırın.
- Kaplama tek 1,5 mm x 35 mm x, yukarıdaki kolajen çözeltisi, bir ince tabaka filmi ile 150 um iskeleleri. Steril bir ortamda 24 saat kurumasını bekleyin.
- 5-0 Vicryl sütür kullanarak, yığın ve dört ayrı 1,5 mm x 35 mm x 150 mm iskeleler tutturmakBir Krackow implantasyon için hazır bir son 0.6 mm kalınlığında, çok katmanlı, kolajen kaplı iskele oluşturmak için dikiş kullanılmıştır.
2. Sıçan Cerrahi Protokolü
- Inhalasyon odasında sıçan yerleştirerek ve 2 L / dk oksijen ile% 2 izofluran sunarak anestezi neden olur. Sıçan onaylayın yeterince ayak hind basınç uygulayarak ve herhangi bir yanıt değerlendirilmesi anestezi uygulandı.
- Non-steril arka masada, deri 25 mg / kg ampisilin ve 0.03 mg / kg buprenorfin enjekte.
- Gözleri oftalmik merhem sürün. Operatif arka bacak kürk Klip ve üç klorheksidin alternatif scrubs ve% 70 etanol ile cerrahi siteyi hazırlık.
- Hipotermi önlemek için ısıtılmış bir pad üzerinde, ameliyat masasına sıçan aktarın. Güvenli burun konisi ve 2 L / dk oksijen içinde% 2 izofluran ile prosedür aracılığıyla teslim burun konisi anestezi korumak. Maruz kalan ameliyat uzvu bırakarak, steril bir şekilde örter.
- Patella düzeyinde merkezli diz 2 cm uzunluğunda dikey kesi medial, emin olun. Kesi diz üzerine merkezli kadar yanal cildi geri çekin.
- Sadece patella medial kesme ve kuadriseps ve distal tibia tubercule üzerinde patellar tendon ekleme seviyesine Musculotendinous kavşak seviyesine proksimale uzanan bir medial parapatellar artrotomi yapmak için bir neşter kullanın. Patellar veya kuadriseps tendon kesmek için değil dikkat edin.
- Patellar tendon sadece lateral diz kapsülü ile 1 cm dikey kesi yaparak yanal Yayın patella.
- Diz uzatılmış olduğundan emin olun. İnce bir makas alın ve lateralden mediale doğru patella altında geçmektedir. Ekstansör mekanizması iki tarafında tercüme edilebilir, böylece makas birkaç kez yayıldı.
- T esneme sırasındaO diz, diz ekleminin iç maruz yanal Patellayı çevirmek. Interkondiler çentik ve femur kondillerin açık görselleştirme olun. Bir neşter kullanarak, çentik ACL ve PCL transect.
- 1.6 mm'lik K-teli ile yük güç matkap. Interkondiler çentik ACL kökeni k-tel ucunu yerleştirin. Superolaterally delmek ve bir neşter gibi gerekli her türlü yumuşak doku çıkarılması, femur lateral üzerindeki çıkış noktasını görselleştirmek. Greft için açık geçiş sağlamak için ve bir kaç kez dışarı k-teli geçirin.
- Tibia plato ACL ayak izi k-teli yerleştirin. Anterolateralinde Matkap ve anterolateral proksimal tibia üzerindeki çıkış noktasını görselleştirmek. K-telli tibia çıkar nokta tam görüntülenmiştir böylece gerekli yumuşak doku temizlemek için neşter kullanın.
- Femur kemik tünelden (ideal olarak en fazla 2 santim uzunluğunda) kısaltılmış Keith iğne geçirin. K gözünden greft bir ucundan iki ameliyat dikiş ipliği ucu Konueith iğne. Femoral tünelden greft bir ucunu çekin iğne kullanın.
- Tibia tünelden greft diğer ucunu geçmek önce adımı tekrarlayın.
- Bir figür sekiz-dikiş ile periost veya diğer yumuşak doku çevreleyen greft femur ucunu tutturmak için 4-0 Vicryl dikiş kullanın. Manuel gerginlik uzantısı diz greft. Bir figür sekiz-dikiş ile periost veya diğer yumuşak doku çevreleyen greft tibia ucunu yapıştırın.
- Figür sekiz-dikiş geçmişte her ucunda 1-2 mm bırakarak, her iki ucunda aşırı greft kesmek için bir makas kullanın.
- Diz uzatın ve patellanın azaltır. 4-0 vicryl kullanarak, patellanın lateral subluksasyon önlenmesi, medial eklem kapsülü kapatmak için tek bir figür sekiz-dikiş yerleştirin.
- Altta yatan kas dikiş değil özenle, bir çalışan subkütiküler 5-0 monocryl veya Vicryl dikiş ile cilt kapatın veya deri kapatıldıktan sonra herhangi bir görünür dikiş var.
- Injederi altından buprenorfin ile ct sıçanlar ameliyat sonrası üç günlük bir toplam için her 12 saat. Enjeksiyon sırasında herhangi bir drenaj cerrahi sitesini veya yaranın yarılması edin. Aksama ve bazı şişme ameliyat sonrası ilk birkaç gün içinde normal, ama derhal veteriner kadrosu ile birlikte herhangi bir postoperatif endişeleri gidermek. Cerrahi kesiler tamamen iyileşmiş zaman hayvan, ameliyat sonrası 2 hafta sosyal konut dönmek olabilir.
3. Veri Toplama Protokolü
- Hayvanlar öldürüldükten hemen sonra, torakotomi ve ardından kapalı bir CO2 odası içinde tek tek fareleri boğmak.
- Kalça ekleminde ayırarak cerrahi yeniden ve kontralateral bacaklarda hem Hasat.
- Yeniden bacaklarda için, sadece femur, tibia ve greft izole ince diseksiyon ile, arka çapraz bağ ve cerrahi kesintiye yerli ACL'DEN kalıntıları da dahil olmak üzere, tüm yumuşak doku kaldırmak. <li> kontralateral bacaklarda için, yerli ACL dışındaki tüm yumuşak doku yanı sıra ince diseksiyon ile femur ve tibia çıkarın.
- Femur graft kaval kemiği kompleksinin her bir ucundan kemik ¾'ünü 1 cm, ancak kaldırmak için, bu tür Dremel gibi bir döner alet kullanın.
- Bu süreçte ve biyomekanik test boyunca, düzenli ve sık sık yanlış sonuçlara değiştirebilir hasat diz kuruma önlemek için normal tuzlu su ile bağ bölgeleri sprey.
- Ayrı ayrı kemiğin epifiz yaklaşık 28 G galvanizli çelik tel sararak femur ve tibia sabitleyin. Bu kemikte ziyade ilgi bağın numunenin erken çekme hatasından yanlış biyomekanik test verileri önlemektir.
- Karışım polimetilmetakrilat (PMMA), kemik çimentosunun karışımı içine femur. Bunu yapmak için, iki çimento bileşenleri karıştırmak ve hemen tamamen serbestçe çıkıntılı epifiz ve ekli ligaman ile çimentolu tencerede kemik gövdesini saran, metal içine femur sabitlemek için viskoz karışımı kullanın. Spontan serbest radikal polimerizasyon yavaş yavaş bir hamur malzeme ve sonunda bir katı sertleştirilmiş matris içine karışık viskoz bileşenleri dönüştürmek için izin ver.
NOT: Bu işlem birkaç dakika sürer ve el ile yapılan bir bolus sıcaklığının değerlendirerek izlenebilirGeri kalan çimento; Sıcaklık geçici ekzotermik polimerizasyon reaksiyonu sırasında artırmak ve malzeme katılaşır sonra RT azalır gerekir. - İdeal mekanik test için 20 ° fleksiyonda diz bağı korurken dışında, tibia çimentolama yukarıdaki işlemi tekrarlayın.
- Bir gerilme test cihazının üzerine çimentolu femur graft tibia kompleksi monte edin ve başarısızlığa gerilim başlangıcından, zamanın bir fonksiyonu olarak kayıt yükü ve yer değiştirme için hazırlar. Bu örnekte, bir 1 kN yük hücreli bir Instron Model 5564 kullanılır.
- Ön gerilimi, 0.5 N / dk'lık bir rampa oranında 2 N aşı ve daha sonra 0.5 mm / sn arasında bir gerilme oranında başarısızlığa greft test edin. Sürecinde, bağ orta-madde de başarısız olduğunu ve kemik femur ve tibia güvenli olduğunu ve erken yanlış test bağın biyomekanik özelliklerini değerlendirmek olabilir, başarısız değil emin olun.
- Oluşturulan yük deplasman kullanıneğrileri test ligament yetersizliği yükünü ve sertliği hesaplamak için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tek bir cerrah tarafından 92 sıçan ameliyatları bizim deneyim, yara tamamlanmasına kesiden ameliyat süresi ortalama 4.7 dakika bir standart sapma ile, 16.9 dakika idi. Hayvanlar öldürüldükten hemen sonra, fareler 356 ± 23 g ağırlığında. Tüm sıçanlar iyi cerrahi tolere, ve hiçbir komplikasyon yaşadı. Ameliyattan hemen sonra, sıçanlar operatif ekstremitede ağırlık vermeye kaydetti, ama hafif bir topallama sergilendi. Bir hafta sonrası ameliyat, tüm sıçanlar kayda değer topallayarak yürüyebilen. Bütün hayvanların beslenme, idrar, dışkılama alışkanlıkları veya herhangi gözlenen anormallikler, çalışma sırasında sürekli ağırlık kazandı. Klinik, hiçbir brüt yara açılması, eritem, şişme, efüzyon, ya da drenaj postoperatif gözlendi.
Yukarıda belirtilen 92 sıçan ameliyatları bu yöntemler yazının amacı öncelikle yapılmamıştır. Bunun yerine, çeşitli mühendislik yardımıyla aşı koşulları test etmek için kullanıldı. Ayrıntılı açıklamalar dad mekanik test ve histolojik sonuçlar bu çalışmanın kapsamı dışında, daha fazla ayrıntı Leong ve ark. 26 tarafından kağıt bulunabilir. Yeniden izleyen 16 haftada, kısaca, kesitli diz histolojik analiz iskele matrisi ölçüde kemik tünellere iyi entegrasyon (Şekil 3) ile eozinofilik kollajen salgılayan fibroblastlar tarafından sızmış oldu göstermiştir. Şu anda, iskele olarak tamamen yeniden emilir edilmiş ve polimerin bir kanıt görselleştirildi. Ayrıca, makrofaj işaretleyici CD68 için immunohistokimyası ameliyat sonrası 16 hafta (Şekil 4) minimal inflamatuar yanıtı göstermiştir.
Biyomekanik özellikler kurban hemen sonra değerlendirildi. Tüm test numuneleri orta madde (Şekil 5) başarısız. Çekme test üretilen yük-deplasman eğrileri (Şekil 6), başarısızlık yükü ve sertliği kullanmaher grup için hesaplandı. 16 hafta sonrası implantasyon anda, electrospun polimer greft hemen sonrası implantasyon test greft yaklaşık iki kat pik yük ve sertlik vardı, ama bu değerler yerli ACL 26 daha düşüktü.
Şekil 1. hizalanmış lifleri ile electrospun polikaprolakton iskele SEM görüntüsü. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
ACL rekonstrüksiyon Şekil 2. Atimik sıçan modeli. Medial parapatellar cilt kesi ile patellar tendon (A) İzolasyon. Femoral Tunne (B) Delme1.6 mm k-teli kullanılarak l. Tibial tünele (C) Delme. Femoral tünelden 1.2 mm Keith iğne (D) Yerleştirme ile greft çekin. (E) electrospun polikaprolakton greft femur tünelden çekti. Uçları kesilmiş ve periost dikilir ve bir katmanlı kapatma yapılır önce (F) Greft, hem femoral ve tibial tüneller aracılığıyla çekti. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Tibia takıldığında Şekil 3. Hematoksilen ve tibia kemik tünelin (solda), midsubstance (merkez), ve femur kemik tünelin (sağda) ile electrospun polimer greft (üst) eozin boyama. Karşılaştırma için, yerli ACL gösterilir (alt), ( ) sol, midsubstance (center) ve femur kökenli (sağda), 10X. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
CD68, makrofajlar için bir marker için Şekil 4. kolorimetrik immünohistokimya lekelenmesi. Kalitatif olarak, post-op greft eklem içi bölgede daha veya 16 hafta, 8 hafta kemik tünelinde biraz daha pozitif boyanma var gibi görünmektedir. Greft minimal inflamasyon olduğu görülmektedir. Tüm görüntüler 20X büyütme vardır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Greft midsubstance de başarısızlığı gösteren implante electrospun greft mekanik test, 5. Görüntüler Şekil. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Atimik sıçan modelinde implantasyon sonrası 16 hafta doku mühendisliği ACL grefti için Şekil 6. Örnek yük-deplasman eğrisi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ACL yaralanmaları şu anda yeniden inşası için sınırlı seçenekler ile ortopedik spor cerrahisinde sık görülen bir durum vardır. In vivo olarak yeniden oluşturulmasına izin olacak ACL için uygun bir doku mühendisliği vekil geliştirmek amacıyla, uygun bir hayvan modeli gereklidir. Bir atimik sıçan ACL yeniden tekrarlanabilir bir modeli kullanarak, in vivo implantasyonu olduğu gibi bu çalışmada, biyolojik olarak parçalanabilir bir mühendislik aşı imalatı tarif edilmektedir. Bu model, hücresel greft ve anonim büyüme faktörleri de dahil olmak üzere, çeşitli biyomateryaller, oluşan farklı doku mühendisliği ACL greft değerlendirmek için kullanılabilir.
Bu özel çalışmada sıralanmış liflerden bir hücresel olmayan, electrospun polikaprolakton greft test edilmiştir. Doku mühendisliği bağ rekonstrüksiyonu Önceki çalışmalarda örgülü veya ipek, PLLA gibi malzemelerin çeşitli yapılmış çekilmiş greft implante ve poliüretan 27-29 var. Bu malzemelerin hiçbiri ACL 7'nin mekanik özellikleri greft ve tekrarlama başarılı entegrasyon, her iki ile sonuçlanmıştır. Birçok polimer bağ yeniden kullanım için bir potansiyele sahip iken, toksik olmayan, biyolojik açıdan inert olduğu için, bu çalışma PCL incelenmiştir, in vivo olarak yavaşça çözünür ve kolayca istenilen şekle 30 halinde imal edilir. PCL da mekanik sağlam ve mekanik stres altında 30 küçük plastik deformasyonu gösterir. 31 electrospun zaman onun kullanımı nedeniyle hizalanmış nanolif yapısı mineralizasyonu ve ben birikimini kollajen türü için güvenilir bir rezervuar olarak kemik doku mühendisliği literatüründe kurulmuştur. Ayrıca, electrospun PCL paspaslar küçük çaplı elyafların hacmi ve kısa difüzyon uzunluk ölçeğine yüksek yüzey kontrollü ilaç verme için uygun olan ve doku mühendisliği 31 kullanımı gösterilmiştir.
Bu bulunmuşturimplante greftler klinik advers reaksiyon eksikliği dayalı biyouyumlu olduğunu ve ameliyat sonrası 16 hafta histolojik görüldüğü gibi yerli hücre infiltrasyonu kolaylaştırdı. Sonunda greft implante insan hücrelerini kullanan bir iki-aşamalı projenin ilk aşaması olan ve bir atimik bir model insan hücrelerinin reddi ile ilgili endişeleri azaltacaktır Biz bu çalışmada bir atimik hayvan modeli kullanılmıştır. electrospun polimer iskele yeniden ACL hem hücre ve matriks hizalama kolaylaştırdı. Greft enine kesitte görüldüğü gibi, hücrelerin çoğunluğunun elyafların yönünde hizalanmıştır. implante greftler zamanla mekanik özelliklere artış gösterdi. Hemen ameliyat sonrası yeniden ACL kıyasla iki katına polimer greft yetmezliği yük. Yerli ACL kıyasla düşük görünebilir PCL greft pik yük ve sertlik iken, bu sonuçlar f ışığında inceledi gerektiğini hatırlamak önemlidirbile mevcut altın standart, otogreftleri veya alograftlarını hareket, ameliyat sonrası 16 hafta sağlıklı ACL mekanik mukavemet elde etmek mümkün değildir. Örneğin, Xu ve ark. Pik yük% 20 -35% ve sertlik olan bir tavşan modelinde ACL otogrefte, bildirilen 23% 6 ay postoperatif 32 sağlıklı doğal ACL bu -36% idi. Buna ek olarak, bir köpek modelinde de organ çalışma 30 hafta ameliyat sonrası 33 ile yaklaşık% 30 oranında maksimum yük ve% 40 doğal ACL sertliği göstermiştir.
Bu çalışmanın kapsamı dışında iken, diğer birçok analizler bu hayvan modelinin kullanımdan sonra greft kalitesini değerlendirmek için yapılabilir. Bu içerir, ancak biyolojik olarak ışık veren görüntüleme ya da X-ışını ve in vivo, CT taramaları ve kollajen işaret ya da inflamatuar markerler için immünohistokimya gibi lekeler ve deneylerin bir çok sınırlı değildir. Örneğin, daha önce hizalanmış işbirliği ölçümü sonuçlarını yayınladıBu hayvan modelinde 26 implante electrospun PCL iskeleleri implantasyon sonrası picrosirius kırmızı boyama kullanarak llagen lifleri.
Bu çalışmanın potansiyel sınırlamaları hayvan modeli kendisi seçim vardır. iki ayaklı insanlara kıyasla dört ayaklı sıçan anatomi ve yürüyüşün doğasında farklılıklar ACL biyomekanik değişir yapmak ve modeller arasında klinik parametreler bu çeviri bu sınırlamalar bilgisi ile yapılması gerektiğini anlamına gelir. Ancak, bu konu hayvan çalışmalarında yaygın ve bu araştırmanın önemini ya da öteleme potansiyelini ortadan kaldırmamaktadır.
Gelecekte mühendislik ACL değiştirmeleri için bizim modele uygulanabilir grefti kullanılarak sıçan ACL rekonstrüksiyonu için post-operatif protokolleri ilginç bir araştırma olmuştur. Harici fiksasyon cihazlarının bir tendon otogreft modelinde geliştirilmiş bir tendon-kemik iyileşmesini sağlamak amacıyla ameliyat sonrası sıçan hareketsiz kılınması için kullanılmıştır19. Buna ek olarak, bu tür Stasiak ve ark. 34 tarafından tarif edilen fleksiyon uzatma düzeneğinin olduğu gibi, tekrarlı yükleme gecikmeli olduğu gösterilmiştir, bundan başka, otogreft birleşme 20 arttırabilmektedir. Ancak, aynı zamanda kısa bir süre, düşük büyüklüğü tekrarlı yükleme de artmıştır iltihabına neden olabilir ve kemik-tendon arabirimine 35 kemik oluşumunu azalma olduğunu göstermiştir. Daha fazla araştırma böyle bir greft bir tendon allogreft daha zayıf başlangıç mekanik özelliklere sahip gibi, bir electrospun, polimer esaslı ACL yerine bu bulguların uygulanabilirliğini değerlendirmek için yapılmalıdır.
Bu çalışmada, bir atimik sıçan bir aselüler electrospun grefti ile ÖÇB rekonstrüksiyonu bir model geliştirdi önceden açıklanan sıçan otogreft modelinin 17-22 arasında değişiklik kapalı dayanır etti. Biz yetmezliği yükün bir eşzamanlı iyileşme ile greft boyunca yoğun hizalanmış kollajen hazırlanmasını gösterdizaman içinde greft. Bu çalışma aynı zamanda Rekonstrüksiyon için çeşitli doku mühendisliği greft değerlendirmek için gelecekte bu modeli istihdam için kavramının kanıtı sağlar. Özellikle, atimik sıçan ksenogeneik donör hücrelerinin tohumlama için izin verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Yazarlar, bu projenin daha önceki yineleme kendi teknik katkılarından dolayı Gabriel AROM ve Michael Yeranosian teşekkür etmek istiyorum. Bu proje OREF Klinisyen Bilim Adamı Yetiştirme Grant (NL) tarafından finanse edildi, HH Lee Cerrahi Araştırma Bursu (NL), Gaziler İdaresi BLR & Ge Merit Değerlendirme 1 I01 BX00012601 (DM) ve Kas-İskelet Nakli Vakfı Genç Araştırmacı Ödülü (FP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medical grade ester terminated poly (ε-caprolactone), granule form (MW = 110,000) |  Lactel Absorbable Polymers |
Custom synthesized polymer to desired molecular weight | |
| 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol | Sigma-Aldrich | 105228 | Solvent for PCL polymer |
| 18 G x 1½" bevel needle | BD Medical | 305196 | |
| Remote Infuse/Withdraw Programmable Syringe Pump | Harvard Apparatus | 702101 | |
| VersaLaser VLS2.30 Laser Engraver | Microgeo USA | VLS2.30 | |
| Expanded Plasma Cleaner 115 V | Harrick Plasma | PDC-001 | Plasma etch just prior to collagen coating for surface modification |
| PureCol Collagen Standard Solution, 3 mg/ml | Advanced Biomatrix | 5015-A | Mix 8:1:2.5 solution of PureCol, 10x PBS, 0.1 N NaOH 1:9 in 1x PBS |
| Suture, 5-0 Vicryl | Henry Schein | 1086471 | |
| Suture, 4-0 Vicryl | Henry Schein | 6540072 | |
| Sharp-pointed Dissecting Scissors (Straight; 4.5 inch) | Fisher Scientific | 8940 | |
| Buphrenorphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | B9275 | Use 0.03 mg/kg for both intra- and post-operatively for pain control |
| Ampicillin, injectable | Henry Schein | 1185678 | Use 25 mg/kg subcutaneously during the procedure |
| K-wire, 1.6 mm | Spectrum Surgical | SI040062 | |
| Keith Needle, Straight 1½" | Delasco Dermatology Lab & Supply | KE-112 | |
| Immunocal Decalcifying Solution | Fisher Scientific | NC9491030 | |
| Opticryl Acrylic Resin Bone Cement (PMMA) (Monomer and polymer) | US Dental Depot | OPTICRYL 100410 | |
| Instron Model 5564 Tensile Testing Machine | Instron | 5564 | Any comparable tensile testing apparatus is suitable |
References
- Fetto, J. F., Marshall, J. L. The natural history and diagnosis of anterior cruciate ligament insufficiency. Clin Orthop Relat Res. (147), 29-38 (1980).
- Kim, Y. M., Lee, C. A., Matava, M. J. Clinical results of arthroscopic single-bundle transtibial posterior cruciate ligament reconstruction: a systematic review. Am J Sports Med. 39 (2), 425-434 (2011).
- Andersson, C., Odensten, M., Gillquist, J. Knee function after surgical or nonsurgical treatment of acute rupture of the anterior cruciate ligament: a randomized study with a long-term follow-up period. Clin Orthop Relat Res. (264), 255-263 (1991).
- Klimkiewicz, J. J., Petrie, R. S., Harner, C. D. Surgical treatment of combined injury to anterior cruciate ligament, posterior cruciate ligament, and medial structures. Clin Sports Med. 19 (3), 479-492 (2000).
- Petrigliano, F. A., McAllister, D. R., Wu, B. M. Tissue engineering for anterior cruciate ligament reconstruction: a review of current strategies. Arthroscopy. 22 (4), 441-451 (2006).
- Groot, J. H., et al. Use of porous polyurethanes for meniscal reconstruction and meniscal prostheses. Biomaterials. 17 (2), 163-173 (1996).
- Leong, N. L., Petrigliano, F. A., McAllister, D. R. Current tissue engineering strategies in anterior cruciate ligament reconstruction. J Biomed Mater Res A. 102 (5), 1614-1624 (2014).
- Duling, R. R., Dupaix, R. B., Katsube, N., Lannutti, J. Mechanical characterization of electrospun polycaprolactone (PCL): a potential scaffold for tissue engineering. J Biomech Eng. 130 (1), 011006 (2008).
- Shao, Z., et al. Polycaprolactone electrospun mesh conjugated with an MSC affinity peptide for MSC homing in vivo. Biomaterials. 33 (12), 3375-3387 (2012).
- Tillman, B. W., et al. The in vivo stability of electrospun polycaprolactone-collagen scaffolds in vascular reconstruction. Biomaterials. 30 (4), 583-588 (2009).
- Wise, S. G., et al. A multilayered synthetic human elastin/polycaprolactone hybrid vascular graft with tailored mechanical properties. Acta Biomater. 7 (1), 295-303 (2011).
- Vargel, I., Korkusuz, P., Menceloğlu, Y. Z., Pişkin, E. In vivo performance of antibiotic embedded electrospun PCL membranes for prevention of abdominal adhesions. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 81 (2), 530-543 (2007).
- Cao, H., McHugh, K., Chew, S. Y., Anderson, J. M. The topographical effect of electrospun nanofibrous scaffolds on the in vivo and in vitro foreign body reaction. J Biomed Mater Res A. 93 (3), 1151-1159 (2010).
- Joshi, V. S., Lei, N. Y., Walthers, C. M., Wu, B., Dunn, J. C. Macroporosity enhances vascularization of electrospun scaffolds. J Surg Res. 183 (1), 18-26 (2013).
- Pham, Q. P., Sharma, U., Mikos, A. G. Electrospun poly(epsilon-caprolactone) microfiber and multilayer nanofiber/microfiber scaffolds: characterization of scaffolds and measurement of cellular infiltration. Biomacromolecules. 7 (10), 2796-2805 (2006).
- Vaz, C. M., van Tuijl, S., Bouten, C. V., Baaijens, F. P. Design of scaffolds for blood vessel tissue engineering using a multi-layering electrospinning technique. Acta Biomater. 1 (5), 575-582 (2005).
- Kawamura, S., Ying, L., Kim, H. J., Dynybil, C., Rodeo, S. A. Macrophages accumulate in the early phase of tendon-bone healing. J Orthop Res. 23 (6), 1425-1432 (2005).
- Hays, P. L., et al. The role of macrophages in early healing of a tendon graft in a bone tunnel. J Bone Joint Surg Am. 90 (3), 565-579 (2008).
- Dagher, E., et al. Immobilization modulates macrophage accumulation in tendon-bone healing. Clin Orthop Relat Res. 467 (1), 281-287 (2009).
- Bedi, A., et al. Effect of early and delayed mechanical loading on tendon-to-bone healing after anterior cruciate ligament reconstruction. J Bone Joint Surg Am. 92 (14), 2387-2401 (2010).
- Bedi, A., Kawamura, S., Ying, L., Rodeo, S. A. Differences in tendon graft healing between the intra-articular and extra-articular ends of a bone tunnel. HSS J. 5 (1), 51-57 (2009).
- Fu, S. C., et al. Effect of graft tensioning on mechanical restoration in a rat model of anterior cruciate ligament reconstruction using free tendon graft. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc. 21 (5), 1226-1233 (2013).
- Fan, H., Liu, H., Wong, E. J., Toh, S. L., Goh, J. C. In vivo study of anterior cruciate ligament regeneration using mesenchymal stem cells and silk scaffold. Biomaterials. 29 (23), 3324-3337 (2008).
- Landis, J. R., Koch, G. G. The measurement of observer agreement for categorical data. Biometrics. 33 (1), 159-174 (1977).
- Joshi, S. M., Mastrangelo, A. N., Magarian, E. M., Fleming, B. C., Murray, M. M. Collagen-platelet composite enhances biomechanical and histologic healing of the porcine anterior cruciate ligament. Am J Sports Med. 37 (12), 2401-2410 (2009).
- Leong, N. L., et al. In vitro and in vivo evaluation of heparin mediated growth factor release from tissue-engineered constructs for anterior cruciate ligament reconstruction. J Orthop Res. 10, (2014).
- Seo, Y. K., et al. Increase in cell migration and angiogenesis in a composite silk scaffold for tissue-engineered ligaments. J Orthop Res. 27 (4), 495-503 (2009).
- Freeman, J. W., Woods, M. D., Laurencin, C. T. Tissue engineering of the anterior cruciate ligament using a braid-twist scaffold design. J Biomech. 40 (9), 2029-2036 (2007).
- Bashur, C. A., Shaffer, R. D., Dahlgren, L. A., Guelcher, S. A., Goldstein, A. S. Effect of fiber diameter and alignment of electrospun polyurethane meshes on mesenchymal progenitor cells. Tissue Eng Part A. 15 (9), 2435-2445 (2009).
- Dash, T. K., Konkimalla, V. B. Poly-є-caprolactone based formulations for drug delivery and tissue engineering: A review. J Control Release. 158 (1), 15-33 (2012).
- Yoshimoto, H., Shin, Y. M., Terai, H., Vacanti, J. P. A biodegradable nanofiber scaffold by electrospinning and its potential for bone tissue engineering. Biomaterials. 24 (12), 2077-2082 (2003).
- Xu, Y., Ao, Y. F. Histological and biomechanical studies of inter-strand healing in four-strand autograft anterior cruciate ligament reconstruction in a rabbit model. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc. 17 (7), 770-777 (2009).
- Shino, K., et al. Replacement of the anterior cruciate ligament by an allogeneic tendon graft. An experimental study in the dog. J Bone Joint Surg Br. 66 (5), 672-681 (1984).
- Stasiak, M. E., et al. A novel device to apply controlled flexion and extension to the rat knee following anterior cruciate ligament reconstruction. J Biomech Eng. 134 (4), 041008 (2012).
- Brophy, R. H., et al. Effect of short-duration low-magnitude cyclic loading versus immobilization on tendon-bone healing after ACL reconstruction in a rat model. J Bone Joint Surg Am. 93 (4), 381-393 (2011).
