Introduction
קרע של הרצועה הצולבת הקדמית (ACL) הוא אחד מרוב הפציעות נפוצות רצועה של הברך 1. בגלל ACL של הקרע אינו יכול לרפא ללא התערבות כירורגית, המגבלות בפעולות יומיומיות, כמו גם השתתפות בספורט לנסוע על 175,000 חולים לעבור ניתוח בכל שנה 2, עם עלות משוערת של מליארד דולרים בשנה 3. נכון לעכשיו, או autograft או גיד שתל משמש לשחזור רצועה. למרות שניתן להשיג אחוזי הצלחה גבוהה בשתי החלפת autograft ושתל, סיבוכים רציניים קשורים לאפשרויות שחזור אלה 4. רקמת autograft קשורה בתחלואת אתר תורם ומוגבלת באספקה, במיוחד במקרים של קרע מחדש או פגיעה רב-ligamentous. מצד השני, רקמת שתל מקושרת עם שילוב מושהה שתל, תגובה דלקתית שלילית, תיאורטי זיהומיות סיכון, וsupp המוגבלly 5. שתלים שאינם מתכלים סינטטיים שפותחו בשנתי ה -1970 ו -1980 אך הקשו על ידי קרע מוקדם שתל, תגובות גוף זר, osteolysis, וקרום מוח 6. כתוצאה מהחששות כבדים אלה, אין כיום שתלים סינטטיים זמינים לשימוש קליני בארצות הברית.
בשל מגבלות אלה עם אפשרויות שתל קיימות והתפתחויות האחרונות בביולוגיה, הנדסה, ורפואת רגנרטיבית, חלה התעניינות רבה בפתרון רקמות מהונדס להשתלת ACL. אסטרטגיות הנדסת רקמות הנוכחיות להעסיק חומרים ביולוגיים וסינטטיים מתכלים כדי לאפשר ingrowth רקמות מארח, תוך הימנעות מהמגבלות הקשורות להשתלת חומר סינטטי קבוע 7.
Polycaprolactone (PCL) הוא פולימר מתכלה כי הוא ה- FDA אישר למספר היישומים הרפואיים כוללים מחסום הידבקות ופצע הלבשת 8, שהיה used במגוון רחב של יישומים, כולל כלי דם, עצמות, סחוס, עצבים, עור, והנדסת רקמות הוושט 5,9-16. biocompatibility החיובי, יחסית ארוך מחצית חיים, חוזק מכאני נאות, וגמישות גבוהה לתרום ב- vivo לפופולריות של פולימר זה בהנדסת רקמות. במודל מכרסם של ריפוי פצעים, PCL electrospun המושתל הוצג להיות לא-חיסוני ולהשתלב ברקמה מקומית ללא תופעות לוואי 13. תמונת SEM של PCL electrospun מוצגת באיור 1.
עם נוכחי סטנדרטים, יעילות FDA רגולציה ובטיחות בשני מודלים של בעלי החיים הקטנים וגדולים שהיה נדרש לPCL או כל שתל ACL מהונדס אחר לעבור לניסויים קליניים בארצות הברית. בנוסף, תנאי in vivo יכולים לעתים להגדיל את המאפיינים של שתל ACL במבחנה רקמה מהונדס. מודל עכברים של שחזור ACL אוטולוגי עם digitor המכופףאממ גיד longus כבר תואר קודם לכן, שבי ACL האם נותק, הירך ושוקת מנהרות שנקדחו, והשתל עבר ומאובטח במקום עם תפר 17-22. במאמר זה, נתאר שינוי של מודל זה להערכת תחליפי ACL מהונדס ולא לשיקום מבוסס autograft (איור 2).
למרות שמודלים של בעלי חיים רבים קיימים עבור הנדסת רקמות רצועה, העכברוש הוא יתרון בהשוואה לדגמים גדולים יותר עבור מספר הסיבות. יתרונות אלה כוללים גידול קל יותר וטיפול, שיקולים אתיים פחות, ו17,23 עלות מופחתת. בנוסף, מודל החולדה כבר בשימוש נרחב כמודל להתחדשות רקמות אורתופדים, כוללים סחוס, גידים, והנדסת רקמות עצם 24. בפרט, חולדות בעירום athymic נבחרו בשל חוסר התגובה חיסונית תא 25, ומאפשרות לo השתלת סופו של הדברתאי תורם xenogeneic f במודל זה כדי לשפר עוד יותר את השתל המהונדס בעתיד. במאמר שיטות זה, אנו מתארים את הייצור והשתלה כירורגית של acellular, שתל פולימרים מתכלה במודל עכברים athymic של שחזור ACL.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: כל הניתוחים בבעלי החיים אושרו על ידי הוועדה המקומית וטרינרי צוות ובעלי חי השימוש לפני תחילת הניסויים.
1. הכנת פיגומים Polycaprolactone electrospun
- לשקול ולפזר פולי אסתר כיתה הרפואית הופסקו (ε-caprolactone) בצורת גרגר ב1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol ליצור 10% w / w הפתרון של פולימר PCL. בואו מערבבים הפתרון באמצעות צלחת ומערבבים במשך לפחות 3 שעות כדי להבטיח פתרון הומוגני.
- Electrospin פתרון PCL כדי ליצור שרוול של סיבי PCL מיושרים מאוד לייצור פיגום.
- הכן את התקנת electrospinning במנדף הכימי עם אוהד בכל העת. זה מורכב מתיבת אקריליק גדולה שתשמש כמדיום ואקום מבודד לתהליך electrospinning ויש נקודות כניסה לפתרון PCL המקור מונע על ידי מקור מתח, mandrel האיסוף מופעל על המנוע, ויציאת ואקום. נקה את acryliביסודיות עם אתנול ותיבת ג לכסות את כל משטחים עם גיליונות Parafilm כדי להסיר כל זיהומים שעלולות לפגוע באיכות מוצר electrospun.
- טען 3 מיליליטר כ מהפתרון מעל לתוך מזרק 10 מיליליטר עם בוטה הסתיים 18 G, ½ 1 מחט אינץ '. הסר את כל בועות אוויר על ידי לחיצה על המזרק עד. פתרון נעילה לתוך משאבת מזרק לתכנות. הכנס את המחט דרך חור קטן לתוך תיבת אקריליק תוך השארה על ½ אינץ 'של המחט מחוץ לקופסא אקריליק עבור התקשרות של תיל מקור מתח.
- השתמש mandrel מחרטה מסתובב 30 מ"מ כאספן לסיבי PCL מיושרים מאוד; לכסות את mandrel הדוק עם רצועה דקה של נייר אלומיניום. לנעול את mandrel לתוך המנוע בצד השני של התיבה כ -15 סנטימטרים ממחט המזרק.
- הכנס את צינור הפלסטיק ליציאת הוואקום ולהתחבר למקור ואקום מנדף. הפעל את מקור הוואקום ולכסות את תיבת אקריליק עם מכסה.
- Set קצב העירוי של משאבת מזרק לתכנות לרמה של 2.5 מיליליטר / שעה. הפעל את המנוע לפעול mandrel ב3,450 סל"ד ולצרף את ההובלה החיובית של מקור המתח לקצה המחט מחוץ לקופסה באמצעות קליפ תנין.
- ברגע שהעירוי של פתרון PCL החל, להפעיל את מקור המתח ומוגדר למתח הפעלה 20 קילו וולט.
- להשרות פתרון דקות 12 כדי ליצור שרוול הומוגנית מ0.5 מיליליטר של פתרון PCL.
הערה: בממוצע, לכל שרוול חומר electrospun מספיק כדי ליצור שני גיליונות שישה-פס, אשר יכול לשמש ליצירה כוללת של שלושה פיגומים ארבעה-שכבתיים.
- לייזר לחתוך את שרוול PCL כדי ליצור גיליונות קטנים מרובים בVersaLaser Cutter 2.3 פעלו בהגדרה נמוך ואקום, מתח נחיתה 10.0 קאב, מרחק עבודה 6.4 מ"מ, וקוטר של 3.0 בדיקה.
הערה: בדוגמא זו, תכנון בעזרת מחשב שימש להורות לחותך להניב מספר גיליונות של 1.5 מ"מ x 35 מ"מ x 150 מיקרומטר פיגומים עםמופץ באופן שווה 150 מיקרומטר חורים בקוטר של 15% באזור נקבובית. - פלזמה לחרוט פיגומי PCL באמצעות שואב פלזמה כדי לגרום hydrophilicity של פני השטח PCL עם האצת יון. הגדר את הוואקום 450 mTorr ופינוק הפיגומים במשך 30 שניות בעצמה גבוהה (29.6 W).
- להתרחץ הפיגומים באתנול 70% בסביבת סטרילית.
- מעיל הפיגומים הבודדים עם קולגן כדי להקל על הדבקה סלולרית ושגשוג in vivo.
- ליצור פתרון ציפוי קולגן על ידי דילול 8: פתרון סטרילי 2.5 של Purecol מ"ג קולגן 3 / פתרון סטנדרטי מיליליטר, 10x PBS ו -0.1 N NaOH 1: 1 9 ב1x PBS ב 4 מעלות צלזיוס. מערבבים היטב כדי להבטיח אחידות פתרון.
- 1.5 מ"מ x 35 מ"מ x 150 מעיל בודד מיקרומטר פיגומים עם סרט שכבה דק של פתרון קולגן לעיל. לאפשר לו להתייבש במשך 24 שעות בסביבה סטרילית.
- שימוש 5-0 תפרי Vicryl, מחסנית ולהדביק ארבעה 1.5 מ"מ x 35 מ"מ x 150 מיקרומטר פרט פיגומיםבאמצעות Krackow לתפור ליצור 0.6 מ"מ סופי פיגום עבה, רב-שכבתי, מצופה קולגן כי הוא מוכן להשתלה.
2. פרוטוקול ניתוח עכברוש
- לגרום להרדמה על ידי הצבת עכבר בתא שאיפה ואספקת isoflurane 2% עם חמצן 2 L / min. לאשר את העכברוש הוא מורדם כראוי על ידי הפעלת לחץ על אחורי רגל והערכה לכל תגובה.
- על השולחן האחורי שאינו סטרילי, תת עורי להזריק 25 מ"ג / קילוגרם אמפיצילין ו0.03 מ"ג / קילוגרם עצירות.
- החל משחה העיניים לעיניים. קליפ הפרווה מהגפיים האחורי האופרטיביים ומכין את האתר כירורגית עם שלוש סקראבס לסירוגין של chlorhexidine ואתנול 70%.
- העבר את העכבר לשולחן הניתוחים, על משטח מחומם כדי למנוע היפותרמיה. חרטום מאובטח, ולשמור על הרדמה בהליך עם 2% isoflurane ב 2 L / חמצן דקות, חרטומו נמסר. לעטוף באופן סטרילי, שעזב את האיבר האופרטיבי החשוף.
- הפוך המדיאלי ארוך 2 סנטימטר אנכי חתך בברך, במרכז ברמה של פיקת הברך. לחזור בו העור רוחבי עד החתך במרכז מעל הברך.
- השתמש באזמל לעשות arthrotomy parapatellar המדיאלי על ידי חיתוך רק המדיאלי לפיקת הברך והארכת proximally לרמה של צומת musculotendinous של השריר הארבעה הראשיים וdistally לרמה של הכנסת גיד הפיקה בtubercule השוקה. יש להיזהר שלא לחתוך את גידי פיקה או ארבע ראשי.
- פיקת שחרור רוחבי על ידי ביצוע חתך אנכי 1 סנטימטר באמצעות הקפסולה הברך רק לרוחב לגיד הפיקה.
- ודא הברך מורחבת. קח זוג המספריים קנס ולעבור מתחת לפיקת הברך מהרוחב המדיאלי. מורחים את המספריים כמה פעמים, כך שמנגנון פושטי יכול להיות מתורגם לשני צדדים.
- בעוד כיפוף tהוא ברך, לתרגם הפיקה רוחבית כדי לחשוף את החלק הפנימי של מפרק הברך. ודא הדמיה ברורה של חריץ intercondylar וcondyles הירך. באמצעות אזמל, תחצה ACL ו- PCL בחריץ.
- כוח תרגיל עומס עם k-חוט 1.6 מ"מ. הנח קצה k-תיל במקור ACL בחריץ intercondylar. לקדוח superolaterally ולדמיין את נקודת היציאה בצד הלטרלי של הירך, הסרת כל רקמה רכה במידת צורך עם אזמל. להעביר את k-התיל וביצא כמה פעמים, כדי להבטיח מעבר ברור לשתל.
- הנח את k-החוט על טביעת רגל ACL על רמת השוקה. לקדוח anterolaterally ולדמיין נקודת יציאה בשוקה הפרוקסימלי anterolateral. השתמש באזמל כדי לנקות רקמות רכות במידת צורך, כך שהנקודה שבה k-החוט יוצא השוקה היא דמיינה באופן מלא.
- לעבור מחט קית מקוצרת (באופן אידיאלי לא יותר מ -2 סנטימטרים) דרך מנהרת עצם הירך. אשכול שני קצות התפר מקצה אחד של השתל דרך העין של Kמחט eith. השתמש במחט למשוך קצה אחד של השתל דרך מנהרת הירך.
- חזור על השלב הקודם כדי להעביר את הקצה השני של השתל דרך מנהרת השוקה.
- השתמש תפר 4-0 Vicryl לצרף את סוף הירך של השתל למקיף periosteum או רקמות רכות אחרות עם תפר דמות-of-שמונה. מתח באופן ידני את השתל עם הברך בהארכה. הצמד את סוף השוקה של השתל למקיף periosteum או רקמות רכות אחרות עם תפר דמות-of-שמונה.
- השתמש מספריים לחתוך את שתל עודף בשני הקצוות, משאיר 1-2 מ"מ בכל קצה האחרון תפר הדמות-of-שמונה.
- להאריך את הברך ולהפחית את פיקת הברך. באמצעות 4-0 vicryl, מקום תפר הדמות של שמונה אחת כדי לסגור את הקפסולה המשותפת המדיאלי, מניעה תת תזוזות רוחב של פיקת הברך.
- סגור את העור עם תפר Monocryl או Vicryl פועל subcuticular 5-0, בזהירות שלא תפר את השריר הבסיסי או אם יש לי תפר גלוי פעם העור סגור.
- Injeחולדות ct תת עורי עם עצירות בכל 12 שעות עבור הסכום כולל של שלושה ימים לאחר הניתוח. בדוק את האתר כירורגית לכל ניקוז או בקיעת פצע בזמן ההזרקה. צליעה ונפיחות הן נורמלים בימים הראשונים שלאחר ניתוח, אך מייד לענות על כל חששות לאחר ניתוח בשיתוף עם צוות וטרינרים. בעלי החיים עשויים להיות לחזור לדיור ציבורי ב -2 שבועות לאחר הניתוח, כאשר חתכים ניתוחיים נרפאים לחלוטין.
3. איסוף נתונים Protocol
- בעת ההקרבה, חנקו חולדות בנפרד בCO 2 תא סגור ואחרי פתיחת בית החזה.
- למסוק שני הגפיים בניתוח שוחזרו ונגדיים על ידי הפרדה במפרק הירך.
- לגפיים המשוחזרים, להסיר את כל הרקמות הרכות, כוללים הרצועה הצולבת האחורית והשרידים מACL האם ניתוח שיבש, על ידי נתיחת קנס לבודד רק את עצם הירך, שוקה, ושתל. <li> לגפיים נגדי, להסיר את כל הרקמות רכות מלבד ACL הילידים, כמו גם את עצם הירך ועצם שוק על ידי נתיחת קנס.
- השתמש בכלי סיבובי כגון Dremel, כדי להסיר את כל אבל ¾ עד 1 סנטימטר של עצם מכל קצה של עצם ירך מורכבת-שתל-שוקה.
- במהלך תהליך זה ובכל רחבי בדיקות ביו-מכאניות, באופן קבוע, ולעתים קרובות לרסס את אזורי ligamentous עם מלח רגיל כדי למנוע התייבשות של הברך שנקטפו שעשויים לשנות את תוצאות באופן כוזב.
- אבטח את עצם הירך ועצם שוק על ידי לפפה 28 תיל פלדת מגולוון G סביב epiphysis של כל עצם בנפרד. זאת על מנת למנוע את נתוני בדיקות ביו-מכאניים מדויקים מכשל מתיחה המוקדם של המדגם בעצמות ולא ברצועה של עניין.
- סיר עצם הירך לתערובת של מלט polymethylmethacrylate עצם (PMMA). כדי לעשות זאת, לערבב את שני רכיבי הבטון ולהשתמש באופן מיידי את התערובת צמיגה כדי לאבטח את עצם הירך למתכת, עוטף לחלוטין diaphysis של העצם בסיר ביצרו עם epiphysis ורצועות מצורפים הבולט באופן חופשי. לאפשר פילמור הרדיקלי החופשי הספונטני להפוך את הרכיבים צמיגים המעורבים בהדרגה לחומר בצקים וסופו של דבר לתוך מטריצה קשוחה מוצקה.
הערה: תהליך זה אורך מספר דקות וניתן לנטר על ידי בחינה של הטמפרטורה של בולוס עשוי ידניהמלט שנותר; הטמפרטורה צריכה להגדיל זמנית במהלך תגובת פילמור הפולטת החומה ושככה לRT לאחר מתמצק החומר. - חזור על אותו התהליך שמעל לחיזוק עצם השוק, למעט תוך שמירה על רצועות הברך ב 20 ° כיפוף לבדיקות מכאניות אידיאליים.
- הר מורכב ירך-שתל-השוקה ביצרו על מנגנון בדיקת מתיחה, ולהכין לעומס שיא ועקירה כפונקציה של זמן מההתחלה של מתח לכישלון. בדוגמא זו, השתמשנו דגם Instron 5564 עם תא עומס kN 1.
- Pre-מתח השתל עד 2 N בקצב רמפה של 0.5 N / דקות ולאחר מכן לבדוק את השתל לכישלון בשיעור מתח של 0.5 מ"מ / sec. במהלך התהליך, להיות בטוחים שהרצועה נכשלה באמצע החומר-ושעצם הירך ועצם השוק הגרמי מאובטחים ולא בטרם עת כושלת, אשר עשוי לא מדויק להעריך את המאפיינים ביו-מכאניים של הרצועה נבדקה.
- השתמש בעומס שנוצר העקירהעקומות כדי לחשב את עומס הכישלון וקשיחות של הרצועה נבדקה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בניסיון של 92 ניתוחי חולדה על ידי מנתח יחיד שלנו, אומר זמן ניתוח מחתך להשלמת הפצע היה 16.9 דקות, עם סטיית תקן של 4.7 דקות. בעת ההקרבה, חולדות שקלו 356 ± 23 גר '. גם כל החולדות נסבלות הניתוח, ולא חוו סיבוכים. מייד לאחר ניתוח, החולדות ציינו לשאת משקל על הגפיים האופרטיביים, אבל הציגו צליעה קלה. בשבוע אחד לאחר ניתוח, כל חולדות ambulating ללא צליעה ניכרת. בעלי החיים כל עלו במשקל בהדרגה במהלך המחקר, ללא חריגות שנצפו בהרגלי אכילה, הטלת שתן, או עשיית הצרכים. מבחינה קלינית, לא בקיעת פצע ברוטו, אודם, נפיחות, השתפכות, או ניקוז נצפתה לאחר הניתוח.
92 ניתוחי העכברוש שהוזכרו לעיל לא בוצעו בעיקר לצורך של כתב יד שיטות זה. במקום זאת, הם משמשים לבדיקת תנאי שתל מהונדסים שונים. בעוד detaileבדיקות מכאניות ד ותוצאות היסטולוגית הן מחוץ להיקף של מאמר זה, ניתן למצוא פרטים נוספים בנייר על ידי et al Leong. 26. בקיצור, בגיל 16 שבועות הבאים השחזור, ניתוח היסטולוגית של הברך מחולק הוכיח כי מטריצת הפיגום הפכה הסתננה במידה רבה על ידי fibroblasts מפריש קולגן eosinophilic עם אינטגרציה טובה למנהרות העצם (איור 3). בשלב זה, הפיגום כבר resorbed לחלוטין ואין שום עדות של הפולימר הייתה דמיינה. בנוסף, אימונוהיסטוכימיה לCD68 סמן מקרופאג הפגינה תגובה דלקתית מינימאלית בגיל 16 שבועות לאחר ניתוח (איור 4).
מאפיינים ביו-מכאניים הוערכו מייד לאחר הקרבה. כל הדגימות שנבדקו נכשלו באמצע החומר (איור 5). באמצעות עקומות עומס עקירה נוצרו מבדיקות מתיחה (איור 6), עומס כישלון וקשיחותחושבו עבור כל קבוצה. בגיל 16 שבועות לאחר השתלה, שתל פולימרי electrospun היה כ כפול עומס השיא וקשיחות של השתל נבדק מייד לאחר השתלה, אבל הערכים אלה היו נמוכים מACL יליד 26.
איור 1. תמונת SEM של פיגום polycaprolactone electrospun עם סיבים מיושרים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. מודל athymic עכברוש של שחזור ACL. בידוד (א) לגיד הפיקה באמצעות חתך בעור parapatellar המדיאלי. (ב) קידוח tunne הירךl באמצעות k-חוט 1.6 מ"מ. קידוחים (C) של מנהרת השוקה. (ד) מיקום של מחט קית 1.2 מ"מ דרך מנהרת הירך למשוך שתל דרך. שתל polycaprolactone (E) electrospun משך דרך מנהרת הירך. (F) שתל נמשך דרך שני מנהרות הירך ושוקה, לפני התום הם גזומים ונתפרו לperiosteum, וסגר בשכבות מתבצע. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור Hematoxylin 3. וצביעת eosin של שתל פולימרי electrospun (למעלה) במנהרת עצם השוקה (משמאל), midsubstance (במרכז), ומנהרת עצם הירך (מימין). לשם השוואה, ACL ילידים מוצג (תחתון), בהכנסת השוקה ( משמאל), midsubstance (center) ומקור הירך (מימין), 10X. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. מכתים אימונוהיסטוכימיה Colorimetric לCD68, סמן למקרופאגים. איכותי, נראה שיש כתמים מעט יותר חיוביים במנהרת העצם בשעה 8 שבועות מאשר באזור הפנים-מפרק של השתל או בגיל 16 שבועות לאחר ניתוח. נראה שיש דלקת מינימאלית בשתלים. כל התמונות הן ההגדלה 20X. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5. תמונות של בדיקות מכאניות של שתל electrospun מושתל, מדגימות כישלון בmidsubstance של שתל. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור עקומת עומס עקירה 6. דוגמא לשתל ACL רקמות מהונדסות בגיל 16 שבועות לאחר ההשתלה במודל העכברים athymic. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פציעות ACL הן מצב שכיח בניתוח אורתופדי ספורט, עם אפשרויות מוגבלות לשיקום בעת הנוכחית. על מנת לפתח תחליף רקמות מהונדסות מתאים לACL שיאפשר התחדשות in vivo, נדרש מודל חיה מתאים. במחקר זה, הייצור של שתל מהונדס מתכלה מתואר, כפי שהשתלתה בvivo תוך שימוש במודל לשחזור של שחזור ACL בחולדת athymic. מודל זה יכול להיות מנוצל כדי להעריך שתלי ACL שונים רקמות מהונדסות מורכבים מחומרים ביולוגיים שונים, ובכלל זה שתלים סלולריים ואלה עם גורמי גדילת Incorporated.
במחקר המסוים הזה, שבדקנו acellular, שתל polycaprolactone electrospun עם סיבים מיושרים. מחקרים קודמים של שחזור רצועת רקמה מהונדסת מושתלים קלועים או שתלי extruded עשויים מגוון חומרים, כולל משי, PLLA, ופוליאוריטן 27-29. אף אחד מחומרים אלה גרם לשניהם שילוב מוצלח של השתל והסיכום של התכונות מכאניות של 7 ACL. אמנם יש לי פולימרים רבים את הפוטנציאל לשימוש בשחזור רצועה, מחקר זה נחקר PCL כי זה אינרטי מבחינה ביולוגית, שאינו רעיל, מדרדרת לאט in vivo, והוא מיוצר בקלות לקונפורמציה רצויה 30. PCL הוא גם מכאני חזק ומראה דפורמציה פלסטית קטנה תחת לחץ מכאני 30. השימוש בו כבר נקבע בספרות הנדסת רקמת העצם כמאגר אמין למינרליזציה וסוג אני קולגן תצהיר בשל מבנה nanofiber המיושר כאשר electrospun 31. כמו כן, הוא הוכיח כי פני השטח הגבוהים לנפח והיקף אורך דיפוזיה הקצרה של הסיבים בקוטר הקטנים במחצלות PCL electrospun נוחים עבור משלוח סמים מבוקר ולהשתמש בהנדסת רקמות 31.
נמצא כיהשתלים שהושתלו היו ביולוגית המבוססים על חוסר התגובה שלילית קלינית, והקלו על חדירת תא ילידים כפי שניתן לראות בהיסטולוגיה ב 16 שבועות לאחר הניתוח. אנו מנוצלים מודל חיה athymic במחקר זה כפי שהוא בשלב הראשון של פרויקט דו-שלבים שסופו של דבר יהיה לנצל תאים אנושיים שהושתלו עם השתל, ומודל athymic יפחית חששות לגבי דחייה של התאים האנושיים. פיגום פולימרי electrospun הקל שני יישור התא והמטריצה בACL מחדש. כפי שניתן לראות בחתך של השתל, רוב התאים היו מיושרים לכיוון הסיבים. השתלים שהושתלו הראו גדילת תכונות מכאניות לאורך זמן. טען לכישלון של שתלי הפולימר הוכפלו בהשוואה לACL המשוחזר מייד לאחר הניתוח. בעוד עומס השיא וקשיחות של שתל PCL אולי נראה נמוך בהשוואה לילידי ACL, חשוב לזכור כי תוצאות אלו יש לראות באור של fלפעול שגם את תקן הזהב הנוכחי, autografts או allografts, אינם מסוגל להשיג את החוזק המכני של ACL הבריא על ידי 16 שבועות לאחר הניתוח. לדוגמא, אל שו et. דיווח על autograft ACL במודל ארנב, שבו עומס השיא היה 20% -35% וקשיחות היה 23% -36% של ACL ילידים הבריא על ידי 6 חודשים לאחר הניתוח 32. בנוסף, מחקר של שתל במודל כלבים הפגין כ -30% עומס השיא ו -40% את הנוקשות של ACL ילידים על ידי 30 שבועות לאחר הניתוח 33.
בזמן שהוא מחוץ להיקף של מאמר זה, רב ניתוחים אחרים ניתן לבצע כדי להעריך את איכות שתל לאחר שימוש במודל חיה זו. זה כולל אך אינו מוגבל להדמית bioluminescent או צילומי רנטגן וסריקות CT in vivo, ומספר רב של כתמים ומבחנים כגון אימונוהיסטוכימיה לסמני קולגן או סמנים דלקתיים. למשל, פרסמנו בעבר תוצאות על הכימות של שיתוף מיושרסיבי llagen באמצעות מכתים אדום picrosirius לאחר ההשתלה של פיגומי PCL electrospun הושתלו במודל חיה זה 26.
מגבלות אפשריות של מחקר זה כוללות את הבחירה של מודל החיה עצמה. ההבדלים הטבועים באנטומיה והליכה בחולדה הארבע הרגליים בהשוואה לבני אדם הולכים על שניים אומר שביומכניקה של ACL לעשות להשתנות ותרגום של פרמטרים קליניים בין דגמים צריך להיעשות עם ידע של מגבלות אלה. עם זאת, בעיה זו היא נפוצה במחקרים בבעלי חיים ואינה שוללת את החשיבות או פוטנציאל translational של מחקר זה.
יש כבר מחקר מעניין על פרוטוקולים שלאחר ניתוח לשחזור ACL העכברוש באמצעות autograft שניתן להחיל את המודל שלנו להחלפת ACL מהונדסת בעתיד. התקני קיבוע חיצוניים היו בשימוש כדי לשתק חולדות שלאחר ניתוח, על מנת לאפשר ריפוי גיד-עצם משופר במודל autograft גיד19. בנוסף, הוכח שעכב את ההעמסה מחזורית, כמו עם מכשיר כיפוף-ההארכה שתואר על ידי Stasiak et al. 34, עשוי לשפר עוד יותר את שילוב autograft 20. עם זאת, יש לו גם הראה כי העמסה מחזורית גודל נמוך זמן קצר גם יכולה לגרום לדלקת מוגברת וירידת היווצרות עצם בממשק עצם-גיד 35. חקירה נוספת חייבת להתנהל על מנת להעריך את הישימות של ממצאים אלה לelectrospun, החלפת ACL מבוסס פולימרים, כמו שתל כזה יש תכונות מכאניות ראשוניות חלשות יותר משתל גיד.
המחקר הנוכחי פיתח מודל של שיקום ACL עם שתל electrospun acellular בחולדת athymic, מבוסס על הנחה של שינויי מודל autograft עכברוש שתואר לעיל 17-22. אנחנו הוכיחו את הפירוט של קולגן המיושר הצפוף לאורך כל השתל עם שיפור במקביל של עומס לכישלוןשל השתל לאורך זמן. מחקר זה מספק גם הוכחה של קונספט להעסקת מודל זה בעתיד כדי להעריך שתלי רקמות מהונדסות שונים לשיקום ACL. בפרט, החולדה athymic מאפשרת לזריעה של תאי תורם xenogeneic.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות לגבריאל ירום ומיכאל Yeranosian על תרומתם לחזרות הטכנית קודמות של הפרויקט הזה. פרויקט זה מומן על ידי OREF מטפל מדען ההדרכה גרנט (NL), HH לי כירורגי מענק מחקר (NL), ותיקי המינהל BLR & D סקירת הצטיינות I01 1 BX00012601 (DM) ושלד ושרירי השתלת קרן פרס חוקר צעיר (FP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medical grade ester terminated poly (ε-caprolactone), granule form (MW = 110,000) |  Lactel Absorbable Polymers |
Custom synthesized polymer to desired molecular weight | |
| 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol | Sigma-Aldrich | 105228 | Solvent for PCL polymer |
| 18 G x 1½" bevel needle | BD Medical | 305196 | |
| Remote Infuse/Withdraw Programmable Syringe Pump | Harvard Apparatus | 702101 | |
| VersaLaser VLS2.30 Laser Engraver | Microgeo USA | VLS2.30 | |
| Expanded Plasma Cleaner 115 V | Harrick Plasma | PDC-001 | Plasma etch just prior to collagen coating for surface modification |
| PureCol Collagen Standard Solution, 3 mg/ml | Advanced Biomatrix | 5015-A | Mix 8:1:2.5 solution of PureCol, 10x PBS, 0.1 N NaOH 1:9 in 1x PBS |
| Suture, 5-0 Vicryl | Henry Schein | 1086471 | |
| Suture, 4-0 Vicryl | Henry Schein | 6540072 | |
| Sharp-pointed Dissecting Scissors (Straight; 4.5 inch) | Fisher Scientific | 8940 | |
| Buphrenorphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | B9275 | Use 0.03 mg/kg for both intra- and post-operatively for pain control |
| Ampicillin, injectable | Henry Schein | 1185678 | Use 25 mg/kg subcutaneously during the procedure |
| K-wire, 1.6 mm | Spectrum Surgical | SI040062 | |
| Keith Needle, Straight 1½" | Delasco Dermatology Lab & Supply | KE-112 | |
| Immunocal Decalcifying Solution | Fisher Scientific | NC9491030 | |
| Opticryl Acrylic Resin Bone Cement (PMMA) (Monomer and polymer) | US Dental Depot | OPTICRYL 100410 | |
| Instron Model 5564 Tensile Testing Machine | Instron | 5564 | Any comparable tensile testing apparatus is suitable |
References
- Fetto, J. F., Marshall, J. L. The natural history and diagnosis of anterior cruciate ligament insufficiency. Clin Orthop Relat Res. (147), 29-38 (1980).
- Kim, Y. M., Lee, C. A., Matava, M. J. Clinical results of arthroscopic single-bundle transtibial posterior cruciate ligament reconstruction: a systematic review. Am J Sports Med. 39 (2), 425-434 (2011).
- Andersson, C., Odensten, M., Gillquist, J. Knee function after surgical or nonsurgical treatment of acute rupture of the anterior cruciate ligament: a randomized study with a long-term follow-up period. Clin Orthop Relat Res. (264), 255-263 (1991).
- Klimkiewicz, J. J., Petrie, R. S., Harner, C. D. Surgical treatment of combined injury to anterior cruciate ligament, posterior cruciate ligament, and medial structures. Clin Sports Med. 19 (3), 479-492 (2000).
- Petrigliano, F. A., McAllister, D. R., Wu, B. M. Tissue engineering for anterior cruciate ligament reconstruction: a review of current strategies. Arthroscopy. 22 (4), 441-451 (2006).
- Groot, J. H., et al. Use of porous polyurethanes for meniscal reconstruction and meniscal prostheses. Biomaterials. 17 (2), 163-173 (1996).
- Leong, N. L., Petrigliano, F. A., McAllister, D. R. Current tissue engineering strategies in anterior cruciate ligament reconstruction. J Biomed Mater Res A. 102 (5), 1614-1624 (2014).
- Duling, R. R., Dupaix, R. B., Katsube, N., Lannutti, J. Mechanical characterization of electrospun polycaprolactone (PCL): a potential scaffold for tissue engineering. J Biomech Eng. 130 (1), 011006 (2008).
- Shao, Z., et al. Polycaprolactone electrospun mesh conjugated with an MSC affinity peptide for MSC homing in vivo. Biomaterials. 33 (12), 3375-3387 (2012).
- Tillman, B. W., et al. The in vivo stability of electrospun polycaprolactone-collagen scaffolds in vascular reconstruction. Biomaterials. 30 (4), 583-588 (2009).
- Wise, S. G., et al. A multilayered synthetic human elastin/polycaprolactone hybrid vascular graft with tailored mechanical properties. Acta Biomater. 7 (1), 295-303 (2011).
- Vargel, I., Korkusuz, P., Menceloğlu, Y. Z., Pişkin, E. In vivo performance of antibiotic embedded electrospun PCL membranes for prevention of abdominal adhesions. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 81 (2), 530-543 (2007).
- Cao, H., McHugh, K., Chew, S. Y., Anderson, J. M. The topographical effect of electrospun nanofibrous scaffolds on the in vivo and in vitro foreign body reaction. J Biomed Mater Res A. 93 (3), 1151-1159 (2010).
- Joshi, V. S., Lei, N. Y., Walthers, C. M., Wu, B., Dunn, J. C. Macroporosity enhances vascularization of electrospun scaffolds. J Surg Res. 183 (1), 18-26 (2013).
- Pham, Q. P., Sharma, U., Mikos, A. G. Electrospun poly(epsilon-caprolactone) microfiber and multilayer nanofiber/microfiber scaffolds: characterization of scaffolds and measurement of cellular infiltration. Biomacromolecules. 7 (10), 2796-2805 (2006).
- Vaz, C. M., van Tuijl, S., Bouten, C. V., Baaijens, F. P. Design of scaffolds for blood vessel tissue engineering using a multi-layering electrospinning technique. Acta Biomater. 1 (5), 575-582 (2005).
- Kawamura, S., Ying, L., Kim, H. J., Dynybil, C., Rodeo, S. A. Macrophages accumulate in the early phase of tendon-bone healing. J Orthop Res. 23 (6), 1425-1432 (2005).
- Hays, P. L., et al. The role of macrophages in early healing of a tendon graft in a bone tunnel. J Bone Joint Surg Am. 90 (3), 565-579 (2008).
- Dagher, E., et al. Immobilization modulates macrophage accumulation in tendon-bone healing. Clin Orthop Relat Res. 467 (1), 281-287 (2009).
- Bedi, A., et al. Effect of early and delayed mechanical loading on tendon-to-bone healing after anterior cruciate ligament reconstruction. J Bone Joint Surg Am. 92 (14), 2387-2401 (2010).
- Bedi, A., Kawamura, S., Ying, L., Rodeo, S. A. Differences in tendon graft healing between the intra-articular and extra-articular ends of a bone tunnel. HSS J. 5 (1), 51-57 (2009).
- Fu, S. C., et al. Effect of graft tensioning on mechanical restoration in a rat model of anterior cruciate ligament reconstruction using free tendon graft. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc. 21 (5), 1226-1233 (2013).
- Fan, H., Liu, H., Wong, E. J., Toh, S. L., Goh, J. C. In vivo study of anterior cruciate ligament regeneration using mesenchymal stem cells and silk scaffold. Biomaterials. 29 (23), 3324-3337 (2008).
- Landis, J. R., Koch, G. G. The measurement of observer agreement for categorical data. Biometrics. 33 (1), 159-174 (1977).
- Joshi, S. M., Mastrangelo, A. N., Magarian, E. M., Fleming, B. C., Murray, M. M. Collagen-platelet composite enhances biomechanical and histologic healing of the porcine anterior cruciate ligament. Am J Sports Med. 37 (12), 2401-2410 (2009).
- Leong, N. L., et al. In vitro and in vivo evaluation of heparin mediated growth factor release from tissue-engineered constructs for anterior cruciate ligament reconstruction. J Orthop Res. 10, (2014).
- Seo, Y. K., et al. Increase in cell migration and angiogenesis in a composite silk scaffold for tissue-engineered ligaments. J Orthop Res. 27 (4), 495-503 (2009).
- Freeman, J. W., Woods, M. D., Laurencin, C. T. Tissue engineering of the anterior cruciate ligament using a braid-twist scaffold design. J Biomech. 40 (9), 2029-2036 (2007).
- Bashur, C. A., Shaffer, R. D., Dahlgren, L. A., Guelcher, S. A., Goldstein, A. S. Effect of fiber diameter and alignment of electrospun polyurethane meshes on mesenchymal progenitor cells. Tissue Eng Part A. 15 (9), 2435-2445 (2009).
- Dash, T. K., Konkimalla, V. B. Poly-є-caprolactone based formulations for drug delivery and tissue engineering: A review. J Control Release. 158 (1), 15-33 (2012).
- Yoshimoto, H., Shin, Y. M., Terai, H., Vacanti, J. P. A biodegradable nanofiber scaffold by electrospinning and its potential for bone tissue engineering. Biomaterials. 24 (12), 2077-2082 (2003).
- Xu, Y., Ao, Y. F. Histological and biomechanical studies of inter-strand healing in four-strand autograft anterior cruciate ligament reconstruction in a rabbit model. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc. 17 (7), 770-777 (2009).
- Shino, K., et al. Replacement of the anterior cruciate ligament by an allogeneic tendon graft. An experimental study in the dog. J Bone Joint Surg Br. 66 (5), 672-681 (1984).
- Stasiak, M. E., et al. A novel device to apply controlled flexion and extension to the rat knee following anterior cruciate ligament reconstruction. J Biomech Eng. 134 (4), 041008 (2012).
- Brophy, R. H., et al. Effect of short-duration low-magnitude cyclic loading versus immobilization on tendon-bone healing after ACL reconstruction in a rat model. J Bone Joint Surg Am. 93 (4), 381-393 (2011).
