Introduction
A ruptura do ligamento cruzado anterior (LCA) é uma das mais comuns de lesões ligamentares do joelho 1. Porque a ruptura do LCA é incapaz de curar sem intervenção cirúrgica, as limitações nas atividades da vida diária, bem como a participação em esportes de carro mais de 175.000 pacientes submetidos à cirurgia a cada ano 2, com um custo estimado de um bilhão de dólares por ano 3. Atualmente, qualquer auto-enxerto ou enxerto de tendão é usado para a reconstrução do ligamento. Embora altas taxas de sucesso pode ser alcançado com tanto auto-enxerto e enxerto de substituição, complicações graves estão associados com estas opções de reconstrução 4. Tecido auto-enxerto é associado com área doadora morbidade e é limitado em oferta, especialmente em casos de re-ruptura ou lesão multi-ligamentar. Por outro lado, o tecido do enxerto está ligada com a integração do enxerto retardada, a resposta inflamatória adverso, o risco infeccioso teórica, e supp limitadoly 5. Enxertos não degradáveis sintéticos foram desenvolvidos na década de 1970 e 1980, mas foram prejudicados pela ruptura prematura do enxerto, reações de corpo estranho, osteólise, e sinovite 6. Como resultado dessas preocupações sérias, não existem actualmente enxertos sintéticos disponíveis para uso clínico nos Estados Unidos.
Devido a essas limitações com opções de enxerto existentes e aos desenvolvimentos recentes em biologia, engenharia e medicina regenerativa, tem havido grande interesse em uma solução de engenharia de tecidos para ACL enxertia. Estratégias de engenharia de tecidos actuais empregam materiais biológicos e sintéticos biodegradáveis para permitir o crescimento interno de tecido do hospedeiro, evitando as limitações associadas com o implante de material sintético permanente 7.
Policaprolactona (PCL) é um polímero biodegradável que é aprovado pela FDA para um número de aplicações médicas, incluindo barreira de adesão e curativos 8, que tem sido used em uma ampla variedade de aplicações, incluindo vasculares, osso, cartilagem, nervo, pele, tecido esofágico e engenharia 5,9-16. Biocompatibilidade favorável, relativamente longa in vivo meia-vida, a força mecânica adequada, e uma elevada elasticidade contribuir para a popularidade deste polímero em engenharia de tecidos. Em um modelo de roedor de cicatrização de feridas, implantado PCL electrospun foi demonstrado ser não imunogénico e para integrar no tecido local, sem reacções adversas 13. Uma imagem SEM de electrospun PCL é mostrado na Figura 1.
Com atual FDA regulamentar normas, eficácia e segurança em ambos os pequenos e grandes modelos animais seria necessário para um PCL ou qualquer outra ACL enxerto projetado para mover-se em ensaios clínicos nos Estados Unidos. Além disso, condições in vivo pode muitas vezes aumentar as propriedades de um ACL enxerto de tecido in vitro engenharia. Um modelo de rato de reconstrução do LCA autólogo com flexor digitorhum longus tendão foi descrito anteriormente, em que o ACL nativa foi cortada, femorais e tibiais túneis foram perfurados, e o enxerto foi aprovada e fixada no local com sutura 17-22. Neste artigo, iremos descrever uma modificação deste modelo para a avaliação de substituições ACL engenharia em vez de para a reconstrução à base de auto-enxerto (Figura 2).
Apesar de existirem muitos modelos animais para a engenharia de tecidos ligamento, o rato é vantajosa em relação aos modelos maiores para um número de razões. Essas vantagens incluem mais fácil criação e manipulação, menos considerações éticas, e reduziu 17,23 custo. Além disso, o modelo do rato tem sido utilizada extensivamente como um modelo para a regeneração do tecido ortopédico, incluindo cartilagem, tendão, e engenharia de tecidos ósseos 24. Em particular, os ratos nus atímicos foram escolhidos devido à sua falta de resposta mediada por células imunes de 25, permitindo a eventual implantação océlulas dadoras xenogénicas f neste modelo para aumentar ainda mais o enxerto engenharia no futuro. Neste trabalho métodos, descrevemos a fabricação e implantação cirúrgica de um acelular, enxerto polímero biodegradável em um modelo de rato atímica de reconstrução do LCA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTA: Todas as cirurgias animais foram aprovados pela equipe e animal veterinário comitê de uso local, antes do início dos experimentos.
1. Preparação de electrospun Policaprolactona Andaimes
- Pesar e dissolver de grau médico de poli éster terminado (ε-caprolactona) em forma de grânulo em 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol, para criar uma 10% w / w solução do polímero PCL. Deixe a solução agitar utilizando uma placa de agitação durante pelo menos 3 h para assegurar uma solução homogénea.
- Electrospin a solução PCL para criar um manguito de fibras PCL altamente alinhadas para a fabricação de andaime.
- Prepare a configuração electrospinning em um exaustor química com o ventilador ligado em todos os momentos. Este consiste em uma grande caixa de acrílico, que servirá como um meio isolado a vácuo para o processo de electrospinning e tem pontos de entrada para a solução de fonte PCL impulsionado por uma fonte de tensão, o mandril coletando a motor, e uma porta de vácuo. Limpe o acrylicaixa c cuidadosamente com etanol e cobrir todas as superfícies com folhas de Parafilm para remover quaisquer impurezas que podem comprometer a qualidade do produto electrospun.
- Carga de aproximadamente 3 ml da solução anterior em uma seringa de 10 ml com um rombo 18 L, 1 ½ polegada agulha. Remova as bolhas de ar, empurrando a seringa para cima. Solução de bloqueio em uma bomba de seringa programável. Insira a agulha através de um pequeno buraco na caixa de acrílico, deixando cerca de ½ polegada da agulha fora da caixa de acrílico para fixação do fio de fonte de tensão.
- Use a 30 milímetros girando mandril Torno como o coletor para as fibras do LCP altamente alinhados; cobrir o mandril firmemente com uma fina tira de papel alumínio. Bloquear o mandril no interior do motor, no lado oposto da caixa de cerca de 15 cm de distância a partir da agulha de uma seringa.
- Insira a mangueira de plástico na porta de vácuo e se conectar à fonte de vácuo coifa. Ligar a fonte de vácuo e cobrir a caixa de acrílico com uma tampa.
- Set a velocidade da bomba de seringa programável de 2,5 ml / h de infusão. Ligue o motor para operar o mandril a 3.450 rpm e anexar o fio positivo da fonte de tensão para a ponta da agulha fora da caixa usando um jacaré.
- Uma vez que a infusão da solução PCL começou, ligue a fonte de tensão e definir a tensão de operação de 20 kV.
- Infundir a solução durante 12 minutos para criar uma braçadeira homogénea a partir de 0,5 ml da solução de PCL.
NOTA: Em média, cada canhão tem material de electrospun suficiente para criar duas folhas de seis lâminas, que podem ser utilizados para criar um total de três suportes de quatro camadas.
- Laser cortar o manguito PCL para formar várias pequenas folhas em um VersaLaser Cortador 2.3 operado a configuração de baixa vácuo, tensão pouso 10,0 keV, 6,4 mm de distância de trabalho, e diâmetro da sonda de 3,0.
NOTA: Neste exemplo, um desenho assistido por computador foi utilizado para instruir o cortador para produzir várias folhas de 1,5 mm x 35 mm x 150 mm com andaimesuniformemente distribuídos 150 mm de diâmetro nos 15% de área de poros. - Plasma gravar os scaffolds PCL usando um aspirador de plasma para induzir a hidrofilicidade da superfície PCL com aceleração de íons. Defina a vácuo para 450 mTorr e o deleite dos andaimes para 30 segundos a alta potência (29,6 W).
- Banhe os andaimes em etanol a 70% em um ambiente estéril.
- Brasão os andaimes individuais com colágeno para facilitar a adesão e proliferação celular in vivo.
- Criar uma solução de revestimento de colagénio por diluição de um 8: solução estéril de 2,5 Purecol colagénio de 3 mg / ml de solução-padrão, 10x PBS e NaOH 0,1 N 1:: 1 9 em 1x PBS a 4 ° C. Misturar bem com a solução de assegurar homogeneidade.
- Casaco indivíduo 1,5 milímetros x 35 mm x 150 mm andaimes com uma película de camada fina da solução de colagénio acima. Deixa-se secar durante 24 horas em um ambiente estéril.
- Usando 5-0 Vicryl, empilhar e apor quatro indivíduo 1,5 milímetros x 35 mm x 150 mm scaffoldsusando um Krackow pontos para criar uma final 0,6 milímetros multi-camadas, andaime de espessura, revestido de colágeno, que está pronto para a implantação.
2. Rat Cirurgia Protocol
- Induzir a anestesia, colocando rato na câmara de inalação e entrega de 2% de isoflurano com 2 L / min de oxigênio. Confirme o rato está devidamente anestesiados pela aplicação de pressão a pata traseira e avaliação para qualquer resposta.
- Na mesa de volta não estéril, subcutaneamente injectar 25 mg / kg de ampicilina e 0,03 mg / kg de buprenorfina.
- Aplicar pomada oftálmica para os olhos. Clipe da pele do membro posterior operatório e preparar o sítio cirúrgico com três esfrega alternadas de clorexidina e etanol 70%.
- Transfira o rato para a mesa de operação, em uma almofada de aquecimento para evitar a hipotermia. Nariz cone seguro e manter a anestesia através do procedimento com 2% de isoflurano em 2 L / min de oxigênio, entregue cone do nariz. Drapejá de uma forma estéril, deixando o membro operativo exposta.
- Adicione uma 2 cm de comprimento incisão média vertical para o joelho, centrado no nível da rótula. Retirar a pele lateralmente até a incisão é centrado sobre o joelho.
- Usar um bisturi para fazer uma artrotomia parapatelar medial cortando apenas medial para a patela e estendendo-se proximalmente para o nível da junção músculo do quadríceps e distal ao nível da inserção do tendão patelar sobre o tubérculo tibial. Tome cuidado para não cortar os patelares ou quadríceps tendões.
- Patela libertação lateralmente através de uma incisão vertical 1 cm para dentro da cápsula do joelho imediatamente lateral do tendão patelar.
- Verifique se o joelho é estendido. Pegue um par de tesouras finas e passar sob a patela de lateral para medial. Espalhe a tesoura algumas vezes para que o mecanismo extensor pode ser traduzido para ambos os lados.
- Enquanto flexionando tele joelho, traduzir a patela lateralmente para expor o interior da articulação do joelho. Certifique-se de clara visualização da fossa intercondilar e côndilos do fêmur. Usando um bisturi, transecto a ACL e PCL no entalhe.
- Carga furadeira com uma k-wire 1,6 milímetros. Coloque ponta k-fio no ACL origem na fossa intercondilar. Broca superolaterally e visualizar o ponto de saída na face lateral do fêmur, a remoção de todo o tecido macio, se necessário com um bisturi. Passe o fio k dentro e fora algumas vezes para garantir a passagem livre para o enxerto.
- Coloque o fio k sobre a pegada ACL no platô tibial. Broca anterolateralmente e visualizar ponto de saída na tíbia proximal ântero-lateral. Use bisturi para limpar tecidos moles como necessário de modo que o ponto onde o fio de k-sai da tíbia é completamente visualizada.
- Passe uma agulha encurtado Keith (o ideal é não mais do que 2 centímetros de comprimento) através do túnel do osso femoral. Passe as duas pontas de sutura de uma extremidade do enxerto através do olho da Kagulha eith. Usar a agulha para puxar uma extremidade do enxerto através do túnel femoral.
- Repetir o passo anterior para passar a outra extremidade do enxerto através do túnel tibial.
- Use 4-0 Vicryl sutura para fixar o fim femoral do enxerto ao redor periósteo ou outros tecidos moles com um ponto a figura de oito. Tensão manualmente o enxerto com o joelho em extensão. Apor o fim tibial do enxerto de periósteo circundante ou outro tecido mole com um ponto figura em forma de oito.
- Utilize uma tesoura para cortar o excesso de enxerto em ambas as extremidades, deixando 1-2 mm em cada extremidade passado o ponto figura em forma de oito.
- Estenda o joelho e reduzir a patela. Usando 4-0 vicryl, coloque um ponto único figura de oito para fechar a cápsula articular medial, impedindo subluxação lateral da patela.
- Feche a pele com um subcuticular 5-0 Monocryl ou Vicryl sutura contínua, com cuidado para não suturar o músculo subjacente ou ter qualquer sutura visível uma vez que a pele é fechada.
- Inject ratos por via subcutânea com buprenorfina cada 12 horas para um total de três dias de pós-operatório. Verificar local cirúrgico para a drenagem ou deiscência da ferida no momento da injecção. Mancando e algum inchaço é normal nos primeiros dias após a cirurgia, mas prontamente quaisquer preocupações pós-operatórias em conjunto com o pessoal veterinário. O animal pode ser retornar à habitação social em 2 semanas de pós-operatório, quando incisões cirúrgicas são completamente curado.
3. Protocolo de Coleta de Dados
- No momento do sacrifício, asfixiar ratos individualmente numa câmara fechada de CO 2, seguida por toracotomia.
- Colha os dois membros cirurgicamente reconstruídos e contralateral, separando na articulação do quadril.
- Para os membros reconstruídos, remover todo o tecido mole, incluindo o ligamento cruzado posterior e os remanescentes da ACL nativa interrompido cirurgicamente, por dissecção fina para isolar apenas o fêmur, tíbia, e enxerto. <li> Para os membros contralaterais, remover todo o tecido mole, exceto o ACL nativa assim como o fêmur ea tíbia por dissecção bem.
- Utilize uma ferramenta rotativa, tais como Dremel, para remover todos, mas ¾ de 1 cm de osso a partir de cada extremidade do fémur complexo tíbia-enxerto.
- Durante este processo, e ao longo do teste biomecânico, regular e frequentemente pulverizar as regiões ligamentares com salino normal para evitar a dessecação do joelho colhidas que podem alterar os resultados falsamente.
- Prenda o fêmur ea tíbia enrolando 28 G arame de aço galvanizado em torno da epífise de cada osso em separado. Isso é para evitar que os dados de testes biomecânicos imprecisas de falha de tração prematura da amostra com o osso em vez de no ligamento de interesse.
- Pot o fêmur em uma mistura de cimento de polimetilmetacrilato (PMMA) osso. Para fazer isto, misturar os dois componentes de cimento e utilizar imediatamente a mistura viscosa para fixar o fémur no interior do metal, que encerra completamente a diáfise do osso no pote cimentada com a epífise e ligado ligamento saliente livremente. Permitir espontânea polimerização por radicais livres de transformar gradualmente os componentes viscosos misturadas a um material pastoso e, eventualmente, em uma matriz sólida endurecido.
NOTA: Este processo leva vários minutos e pode ser monitorado por avaliação manual da temperatura de um bolo feito a partir deo restante cimento; a temperatura deve aumentar transitoriamente durante a reacção de polimerização exotérmica e diminuem para a TA, depois os material solidifica. - Repita o mesmo processo acima para cimentar a tíbia, com exceção, mantendo o ligamento do joelho em 20 ° de flexão para o teste mecânico ideal.
- Monte o complexo fêmur-enxerto-tibial cimentada em um aparelho de ensaio de tração, e se preparar para carga recorde e deslocamento em função do tempo a partir do início de tensão ao fracasso. Neste exemplo, foi utilizado um modelo Instron 5564 com uma célula de carga de 1 kN.
- Pré-tensão do enxerto a 2 N a uma velocidade de rampa de 0,5 N / min e, em seguida, para testar o enxerto falha a uma velocidade de deformação de 0,5 mm / seg. Durante o processo, certifique-se que o ligamento está falhando em meados da década de substância e que o fêmur e da tíbia óssea são seguras e não prematuramente falhando, o que pode inaccurately avaliar as propriedades biomecânicas do ligamento testado.
- Use a carga-deslocamento geradocurvas para calcular a carga de ruptura e de rigidez do ligamento testado.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Em nossa experiência de 92 cirurgias de ratos por um único cirurgião, o tempo médio operatório da incisão para a conclusão da ferida foi de 16,9 min, com um desvio padrão de 4,7 min. No momento do sacrifício, os ratos pesavam 356 ± 23 g. Todos os ratos toleraram bem a cirurgia, e experiente sem complicações. Imediatamente após a cirurgia, os ratos foram anotados para suportar o peso sobre a extremidade operatório, mas exibiu um ligeiro coxear. Por uma semana de pós-operatório, todos os ratos foram deambulando sem mancar apreciável. Os animais todos ganharam peso de forma constante durante o curso do estudo, sem anormalidades observadas nos hábitos de alimentação, urinar ou defecar. Clinicamente, não deiscência da ferida bruta, eritema, inchaço, derrame, ou drenagem foi observada no pós-operatório.
Os 92 operações de rato acima mencionados não foram realizados principalmente para o propósito deste manuscrito métodos. Em vez disso, eles foram usados para testar várias condições de enxerto de engenharia. Enquanto o detailed testes mecânicos e os resultados histológicos estão fora do escopo deste artigo, mais detalhes podem ser encontrados em um artigo de Leong et al. 26. Em breve, a 16 semanas após a reconstituição, a análise histológica dos joelhos seccionado demonstraram que a matriz se tornou largamente andaime infiltrado por fibroblastos que segregam colagénio eosinofílica com boa integração óssea dos túneis (Figura 3). Neste momento, o andaime foi completamente reabsorvida e nenhuma evidência de que o polímero foi visualizado. Adicionalmente, imuno-histoquímica para o marcador de macrófagos CD68 demonstrou resposta inflamatória mínima, às 16 semanas de pós-operatório (Figura 4).
As propriedades biomecânicas foram avaliados imediatamente após o sacrifício. Todas as amostras testadas falharam em meados da década de substância (Figura 5). Usando curvas carga-deslocamento gerados a partir de testes de tração (Figura 6), carga de ruptura e rigidezforam calculados para cada grupo. Com 16 semanas de pós-implantação, o enxerto de polímero electrospun tinha aproximadamente o dobro da carga de pico e rigidez do enxerto testado imediatamente após a implantação, mas esses valores foram menores do que o ACL nativa 26.
Figura 1. Imagem SEM de andaime electrospun policaprolactone com fibras alinhadas. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. modelo de rato atímicos de reconstrução do LCA. (A) O isolamento do tendão patelar através de uma incisão na pele medial patelar. (B) Perfuração de tunne femorall 1,6 milímetros usando k-fio. (C) Perfuração de túnel tibial. (D) Colocação de 1,2 milímetros Keith agulha através do túnel femoral para puxar através de enxerto. (E) electrospun policaprolactone enxerto puxado através de túnel femoral. (F) Graft puxado através de dois túneis femorais e tibiais, antes das extremidades são aparadas e suturado ao periósteo, e um fechamento em camadas é realizada. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. hematoxilina e eosina de enxerto polímero electrospun (top) no túnel de osso tibial (à esquerda), midsubstance (centro), e túnel ósseo femoral (direita). Para efeito de comparação, ACL nativa é mostrado (parte inferior), no momento da inserção tibial ( esquerda), midsubstance (center) e origem femoral (direita), 10X. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. colorimétrico coloração imuno-histoquímica para CD68, um marcador para macrófagos. Qualitativamente, parece haver coloração ligeiramente mais positiva no túnel do osso após 8 semanas do que na zona intra-articular do enxerto ou às 16 semanas pós-op. Parece haver inflamação mínima nos enxertos. Todas as imagens são ampliação de 20x. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Imagens de ensaios mecânicos de enxerto implantado electrospun, demonstrando falha no midsubstance de enxerto. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. Exemplo de curva de carga-deslocamento para engenharia de tecidos ACL enxerto em 16 semanas após o implante no modelo de rato atímica. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Lesões do LCA é uma condição comum em cirurgia ortopédica de esportes, com opções limitadas de Reconstrução, com o tempo presente. A fim de desenvolver um substituto apropriado da engenharia de tecidos para a ACL que irá permitir a regeneração in vivo, num modelo animal adequado é necessária. Neste estudo, a fabricação de um enxerto de engenharia biodegradável é descrita, como é o seu implante in vivo utilizando um modelo reprodutível de reconstrução ACL em um rato atímico. Este modelo pode ser utilizado para avaliar diferentes enxertos ACL engenharia de tecidos compostos por vários biomateriais, incluindo enxertos celulares e aqueles com factores de crescimento incorporadas.
Neste estudo em particular, testamos um acelular, enxerto electrospun policaprolactone com fibras alinhadas. Estudos anteriores de engenharia de tecidos reconstrução de ligamentos tenham implantado trançado ou enxertos extrudidos feitos de uma variedade de materiais, incluindo seda, PLLA, 27-29 e poliuretano. Nenhum destes materiais resultou em ambos integração bem sucedida do enxerto e recapitulação das propriedades mecânicas do LCA 7. Embora muitos polímeros têm potencial para utilização na reconstrução do ligamento, este estudo investigou PCL, porque é biologicamente inerte, não-tóxico, degrada-se lentamente in vivo, e pode ser facilmente fabricado numa conformação desejada 30. PCL também é mecanicamente robusto e mostra pouca deformação plástica sob estresse mecânico 30. Seu uso tem sido estabelecido na literatura engenharia de tecido ósseo como um reservatório de confiança para a mineralização e colágeno tipo I deposição devido à sua estrutura de nanofibras alinhadas quando electrospun 31. Além disso, demonstrou-se que a superfície elevada ao volume e escala de comprimento curto de difusão das fibras de pequeno diâmetro em esteiras PCL electrospun são favoráveis para a entrega controlada de fármaco e utilização em engenharia de tecidos 31.
Verificou-se queos enxertos implantados foram biocompatíveis com base na falta de reacção adversa clínica, e facilitou a infiltração celular nativo como pode ser visto histologicamente com 16 semanas pós-operatório. Utilizou-se um modelo animal atímicos neste estudo, uma vez que é a primeira fase de um projecto de duas fases que acabará por utilizar células humanas implantados com o enxerto, e um modelo atímicos iria reduzir as preocupações em relação a rejeição das células humanas. O andaime polímero electrospun facilitado tanto celular quanto na matriz de alinhamento no ACL regenerado. Como pode ser visto na secção transversal do enxerto, a maioria das células estavam alinhadas na direcção das fibras. Os enxertos implantados mostraram aumento propriedades mecânicas ao longo do tempo. Carregar a falha dos enxertos de polímero duplicando em comparação com a reconstrução do LCA imediatamente pós-operatório. Enquanto a carga de pico e rigidez do enxerto PCL pode parecer baixo, em comparação com ACL nativa, é importante lembrar que esses resultados devem ser vistos à luz da fato que até mesmo o atual padrão ouro, auto-enxertos ou enxertos, não são capazes de atingir a resistência mecânica do ACL saudável por 16 semanas após a cirurgia. Por exemplo, Xu et al., Relataram em um autoenxerto ACL num modelo de coelho, em que o pico de carga foi de 20% -35% e rigidez foi de 23% -36% de LTA nativo que saudável de 6 meses pós-operatório 32. Além disso, um estudo de aloenxertos num modelo canino demonstrada aproximadamente 30% da carga de pico e 40% da rigidez do LCA nativo das 30 semanas no pós-operatório 33.
Enquanto que está fora do âmbito deste documento, muitas outras análises podem ser realizadas para avaliar a qualidade do enxerto após utilização deste modelo animal. Isto inclui, mas não está limitado a imagem de bioluminescência ou raios-X e tomografia computadorizada in vivo, e uma infinidade de manchas e de ensaios como imunohistoquímica para marcadores de colágeno ou marcadores inflamatórios. Por exemplo, nós já publicado resultados na quantificação dos co Alinhadosfibras llagen usando coloração picrosirius vermelho após a implantação de andaimes PCL electrospun implantados neste modelo animal 26.
Potenciais limitações deste estudo incluem a escolha do próprio modelo animal. As diferenças inerentes entre a anatomia e marcha no rato quadrúpede em comparação com os humanos bípedes significa que a biomecânica do ACL variam e que a tradução dos parâmetros clínicos entre modelos deve ser feito com o conhecimento dessas limitações. No entanto, este problema é comum em estudos com animais e não nega a importância ou potencial translacional desta pesquisa.
Houve uma pesquisa interessante sobre protocolos de pós-operatório de reconstrução do LCA rato usando auto-enxerto que pode ser aplicado ao nosso modelo para substituições ACL engenharia no futuro. Os dispositivos de fixação externa foram utilizados para imobilizar ratos pós-operatório, a fim de permitir uma melhor cicatrização do tendão-osso num modelo de auto-enxerto de tendão19. Além disso, tem sido mostrado que atrasou carga cíclica, tal como com o dispositivo de flexão-extensão descrito por Stasiak et al. 34, pode aumentar ainda mais a incorporação autoenxerto 20. No entanto, também foi mostrado que a duração curta de baixa magnitude carga cíclica também pode causar inflamação aumentada e diminuição da formação de osso na interface osso-tendão 35. Outras investigações devem ser realizados para avaliar a aplicabilidade destes resultados para um electrospun, substituição ACL baseado em polímero, como tal, um enxerto teria propriedades mecânicas iniciais mais fracos do que um enxerto de tendão.
O presente estudo desenvolveu um modelo de reconstrução do LCA com enxerto electrospun acelular em um rato atímica, baseado fora modificações de um modelo de auto-enxerto de ratos previamente descrito 17-22. Nós demonstramos a elaboração de colagénio densas alinhado ao longo do enxerto com uma melhoria concomitante de carga para falhado enxerto ao longo do tempo. Este estudo também fornece a prova de conceito para empregar este modelo no futuro para avaliar vários enxertos de engenharia de tecidos para a reconstrução do LCA. Em particular, o rato atímico permite a sementeira de células dadoras xenogénicas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer Gabriel Arom e Michael Yeranosian por suas contribuições técnicas para iterações anteriores deste projeto. Este projecto foi financiado pelo OREF Clínico Scientist Training Grant (NL), HH Lee Surgical Research Grant (NL), Veterans Administration BLR & D Mérito comentário 1 I01 BX00012601 (DM) e Musculoskeletal Transplantation Foundation Young Investigator Award (FP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medical grade ester terminated poly (ε-caprolactone), granule form (MW = 110,000) |  Lactel Absorbable Polymers |
Custom synthesized polymer to desired molecular weight | |
| 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol | Sigma-Aldrich | 105228 | Solvent for PCL polymer |
| 18 G x 1½" bevel needle | BD Medical | 305196 | |
| Remote Infuse/Withdraw Programmable Syringe Pump | Harvard Apparatus | 702101 | |
| VersaLaser VLS2.30 Laser Engraver | Microgeo USA | VLS2.30 | |
| Expanded Plasma Cleaner 115 V | Harrick Plasma | PDC-001 | Plasma etch just prior to collagen coating for surface modification |
| PureCol Collagen Standard Solution, 3 mg/ml | Advanced Biomatrix | 5015-A | Mix 8:1:2.5 solution of PureCol, 10x PBS, 0.1 N NaOH 1:9 in 1x PBS |
| Suture, 5-0 Vicryl | Henry Schein | 1086471 | |
| Suture, 4-0 Vicryl | Henry Schein | 6540072 | |
| Sharp-pointed Dissecting Scissors (Straight; 4.5 inch) | Fisher Scientific | 8940 | |
| Buphrenorphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | B9275 | Use 0.03 mg/kg for both intra- and post-operatively for pain control |
| Ampicillin, injectable | Henry Schein | 1185678 | Use 25 mg/kg subcutaneously during the procedure |
| K-wire, 1.6 mm | Spectrum Surgical | SI040062 | |
| Keith Needle, Straight 1½" | Delasco Dermatology Lab & Supply | KE-112 | |
| Immunocal Decalcifying Solution | Fisher Scientific | NC9491030 | |
| Opticryl Acrylic Resin Bone Cement (PMMA) (Monomer and polymer) | US Dental Depot | OPTICRYL 100410 | |
| Instron Model 5564 Tensile Testing Machine | Instron | 5564 | Any comparable tensile testing apparatus is suitable |
References
- Fetto, J. F., Marshall, J. L. The natural history and diagnosis of anterior cruciate ligament insufficiency. Clin Orthop Relat Res. (147), 29-38 (1980).
- Kim, Y. M., Lee, C. A., Matava, M. J. Clinical results of arthroscopic single-bundle transtibial posterior cruciate ligament reconstruction: a systematic review. Am J Sports Med. 39 (2), 425-434 (2011).
- Andersson, C., Odensten, M., Gillquist, J. Knee function after surgical or nonsurgical treatment of acute rupture of the anterior cruciate ligament: a randomized study with a long-term follow-up period. Clin Orthop Relat Res. (264), 255-263 (1991).
- Klimkiewicz, J. J., Petrie, R. S., Harner, C. D. Surgical treatment of combined injury to anterior cruciate ligament, posterior cruciate ligament, and medial structures. Clin Sports Med. 19 (3), 479-492 (2000).
- Petrigliano, F. A., McAllister, D. R., Wu, B. M. Tissue engineering for anterior cruciate ligament reconstruction: a review of current strategies. Arthroscopy. 22 (4), 441-451 (2006).
- Groot, J. H., et al. Use of porous polyurethanes for meniscal reconstruction and meniscal prostheses. Biomaterials. 17 (2), 163-173 (1996).
- Leong, N. L., Petrigliano, F. A., McAllister, D. R. Current tissue engineering strategies in anterior cruciate ligament reconstruction. J Biomed Mater Res A. 102 (5), 1614-1624 (2014).
- Duling, R. R., Dupaix, R. B., Katsube, N., Lannutti, J. Mechanical characterization of electrospun polycaprolactone (PCL): a potential scaffold for tissue engineering. J Biomech Eng. 130 (1), 011006 (2008).
- Shao, Z., et al. Polycaprolactone electrospun mesh conjugated with an MSC affinity peptide for MSC homing in vivo. Biomaterials. 33 (12), 3375-3387 (2012).
- Tillman, B. W., et al. The in vivo stability of electrospun polycaprolactone-collagen scaffolds in vascular reconstruction. Biomaterials. 30 (4), 583-588 (2009).
- Wise, S. G., et al. A multilayered synthetic human elastin/polycaprolactone hybrid vascular graft with tailored mechanical properties. Acta Biomater. 7 (1), 295-303 (2011).
- Vargel, I., Korkusuz, P., Menceloğlu, Y. Z., Pişkin, E. In vivo performance of antibiotic embedded electrospun PCL membranes for prevention of abdominal adhesions. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 81 (2), 530-543 (2007).
- Cao, H., McHugh, K., Chew, S. Y., Anderson, J. M. The topographical effect of electrospun nanofibrous scaffolds on the in vivo and in vitro foreign body reaction. J Biomed Mater Res A. 93 (3), 1151-1159 (2010).
- Joshi, V. S., Lei, N. Y., Walthers, C. M., Wu, B., Dunn, J. C. Macroporosity enhances vascularization of electrospun scaffolds. J Surg Res. 183 (1), 18-26 (2013).
- Pham, Q. P., Sharma, U., Mikos, A. G. Electrospun poly(epsilon-caprolactone) microfiber and multilayer nanofiber/microfiber scaffolds: characterization of scaffolds and measurement of cellular infiltration. Biomacromolecules. 7 (10), 2796-2805 (2006).
- Vaz, C. M., van Tuijl, S., Bouten, C. V., Baaijens, F. P. Design of scaffolds for blood vessel tissue engineering using a multi-layering electrospinning technique. Acta Biomater. 1 (5), 575-582 (2005).
- Kawamura, S., Ying, L., Kim, H. J., Dynybil, C., Rodeo, S. A. Macrophages accumulate in the early phase of tendon-bone healing. J Orthop Res. 23 (6), 1425-1432 (2005).
- Hays, P. L., et al. The role of macrophages in early healing of a tendon graft in a bone tunnel. J Bone Joint Surg Am. 90 (3), 565-579 (2008).
- Dagher, E., et al. Immobilization modulates macrophage accumulation in tendon-bone healing. Clin Orthop Relat Res. 467 (1), 281-287 (2009).
- Bedi, A., et al. Effect of early and delayed mechanical loading on tendon-to-bone healing after anterior cruciate ligament reconstruction. J Bone Joint Surg Am. 92 (14), 2387-2401 (2010).
- Bedi, A., Kawamura, S., Ying, L., Rodeo, S. A. Differences in tendon graft healing between the intra-articular and extra-articular ends of a bone tunnel. HSS J. 5 (1), 51-57 (2009).
- Fu, S. C., et al. Effect of graft tensioning on mechanical restoration in a rat model of anterior cruciate ligament reconstruction using free tendon graft. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc. 21 (5), 1226-1233 (2013).
- Fan, H., Liu, H., Wong, E. J., Toh, S. L., Goh, J. C. In vivo study of anterior cruciate ligament regeneration using mesenchymal stem cells and silk scaffold. Biomaterials. 29 (23), 3324-3337 (2008).
- Landis, J. R., Koch, G. G. The measurement of observer agreement for categorical data. Biometrics. 33 (1), 159-174 (1977).
- Joshi, S. M., Mastrangelo, A. N., Magarian, E. M., Fleming, B. C., Murray, M. M. Collagen-platelet composite enhances biomechanical and histologic healing of the porcine anterior cruciate ligament. Am J Sports Med. 37 (12), 2401-2410 (2009).
- Leong, N. L., et al. In vitro and in vivo evaluation of heparin mediated growth factor release from tissue-engineered constructs for anterior cruciate ligament reconstruction. J Orthop Res. 10, (2014).
- Seo, Y. K., et al. Increase in cell migration and angiogenesis in a composite silk scaffold for tissue-engineered ligaments. J Orthop Res. 27 (4), 495-503 (2009).
- Freeman, J. W., Woods, M. D., Laurencin, C. T. Tissue engineering of the anterior cruciate ligament using a braid-twist scaffold design. J Biomech. 40 (9), 2029-2036 (2007).
- Bashur, C. A., Shaffer, R. D., Dahlgren, L. A., Guelcher, S. A., Goldstein, A. S. Effect of fiber diameter and alignment of electrospun polyurethane meshes on mesenchymal progenitor cells. Tissue Eng Part A. 15 (9), 2435-2445 (2009).
- Dash, T. K., Konkimalla, V. B. Poly-є-caprolactone based formulations for drug delivery and tissue engineering: A review. J Control Release. 158 (1), 15-33 (2012).
- Yoshimoto, H., Shin, Y. M., Terai, H., Vacanti, J. P. A biodegradable nanofiber scaffold by electrospinning and its potential for bone tissue engineering. Biomaterials. 24 (12), 2077-2082 (2003).
- Xu, Y., Ao, Y. F. Histological and biomechanical studies of inter-strand healing in four-strand autograft anterior cruciate ligament reconstruction in a rabbit model. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc. 17 (7), 770-777 (2009).
- Shino, K., et al. Replacement of the anterior cruciate ligament by an allogeneic tendon graft. An experimental study in the dog. J Bone Joint Surg Br. 66 (5), 672-681 (1984).
- Stasiak, M. E., et al. A novel device to apply controlled flexion and extension to the rat knee following anterior cruciate ligament reconstruction. J Biomech Eng. 134 (4), 041008 (2012).
- Brophy, R. H., et al. Effect of short-duration low-magnitude cyclic loading versus immobilization on tendon-bone healing after ACL reconstruction in a rat model. J Bone Joint Surg Am. 93 (4), 381-393 (2011).
