Introduction
Разрыв передней крестообразной связки (ACL) является одним из наиболее распространенных связок травмы коленного сустава 1. Потому что разрыв ACL, не в состоянии исцелить без хирургического вмешательства, ограничения в повседневной жизни, а также участия в спортивных привода на 175000 пациентов на операцию каждый 2 года, с ориентировочной стоимостью в один миллиард долларов в год 3. В настоящее время, либо аутотрансплантата или аллотрансплантата сухожилия используется для реконструкции связки. Хотя высокие темпы успех может быть достигнут и с аутотрансплантата и аллотрансплантата замены, серьезные осложнения, связанные с этими вариантов реконструкции 4. Аутотрансплантата ткани связано с донорского участка заболеваемости и ограничивается в поставках, особенно в случаях повторного разрыва или мульти-связочного травмы. С другой стороны, аллотрансплантата ткани связана с задержкой интеграции трансплантата, воспалительную реакцию вредного, теоретической инфекционного риска, а также ограниченного SuppLY 5. Синтетические Неразлагающиеся трансплантаты были разработаны в 1970-х и 1980-х годов, но были затруднены из-за преждевременного трансплантата разрыва, реакции инородного тела, остеолизом и синовита 6. В результате этих серьезных проблем, не существует в настоящее время нет синтетические трансплантаты, доступные для клинического применения в Соединенных Штатах.
Из-за этих ограничений с существующими опциями привитых и последних событиях в области биологии, инженерии и регенеративной медицины, возник большой интерес к ткани инженерное решение для ACL прививки. Современные стратегии тканевой инженерии используют разлагаемые биологическими и синтетическими материалами, чтобы обеспечить ткани хозяина врастания, избегая при этом ограничения, связанные с постоянным синтетического материала имплантации 7.
Поликапролактон (PCL) является биоразлагаемый полимер, который является FDA одобрило для ряда медицинских приложений, включая адгезии барьер и раневая повязка 8, который был UСЭД в широком диапазоне применений, включая сосудистых, кости, хряща, нерва, кожи и пищевода тканевой инженерии 5,9-16. Благоприятный биосовместимость, относительно длинной в естественных условиях период полураспада, достаточную механическую прочность и высокая эластичность способствуют популярности этого полимера в тканевой инженерии. В модели грызунов заживления ран, имплантированных electrospun PCL было показано, что неиммуногенным и интегрировать в локальной ткани без побочных реакций 13. СЭМ-изображение electrospun PCL представлен на рисунке 1.
При нынешней FDA нормативных стандартов, эффективности и безопасности в малых и больших животных моделях потребуется для PCL или любой другой инженерии ACL трансплантата переехать в клинических испытаниях в США. Кроме того, условия в естественных условиях часто может увеличить свойства в пробирке ткани инженерии ACL трансплантата. Крыса модель аутогенной реконструкции передней крестообразной связки с сгибателей digitorгм большого пальца стопы сухожилия было описано ранее, в которой родной ACL, были разорваны, бедра и голени туннели были пробурены, и трансплантат был принят и закреплен в месте с швом 17-22. В этой статье мы опишем модификацию этой модели для оценки инженерных замены ACL, а не для аутотрансплантата на основе реконструкции (рис 2).
Хотя многие животные модели существуют связки тканевой инженерии, крыса является предпочтительным по сравнению с более крупными моделями по ряду причин. Эти преимущества включают легче земледелие, погрузку и разгрузку меньше этические соображения, а также снижение 17,23 затрат. Кроме того, модель крысы широко используется в качестве модели для ортопедической регенерации тканей, в том числе хрящ, сухожилия и тканевой инженерии 24 костей. В частности, бестимусных голых крыс были выбраны из-за их отсутствия клеточного иммунного ответа 25, что позволяет в конечном итоге имплантации OF ксеногенные донорские клетки в этой модели для дальнейшего повышения инженерии трансплантата в будущем. В этом методы работе мы описываем изготовление и хирургической имплантации ацеллюлярную, биоразлагаемый полимер трансплантата в бестимусным крысиной модели реконструкции передней крестообразной связки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Все операции животных были утверждены местной ветеринарной персонала и использования животных комитета до начала экспериментов.
1. Подготовка Electrospun Поликапролактон Строительные леса
- Взвешивание и растворить эфира медицинского назначения с концевыми поли (ε-капролактона) в виде гранул в 1,1,1,3,3,3-гексафтор-2-пропанола, чтобы создать 10% вес / вес раствора полимера PCL. Пусть решение перемешать с помощью мешалки в течение по меньшей мере 3 ч, чтобы обеспечить гомогенный раствор.
- Electrospin решение PCL создать манжету высоко выровненных PCL волокон для строительных лесов производства.
- Подготовка установки электропрядения в химическом вытяжном шкафу с вентилятором на все время. Он состоит из большого акриловой коробке, которая будет служить в качестве изолированного вакуумной среды для процесса электропрядения и имеет точки входа для источника PCL решения приводится в действие источником напряжения, двигатель с питанием от сбора оправки и вакуумным портом. Очистите acryliС коробка тщательно этанолом и покрыть все поверхности с парафином листов, чтобы удалить любые примеси, которые могут поставить под угрозу качество electrospun продукта.
- Загрузка приблизительно 3 мл вышеуказанного раствора в 10 мл шприц с тупыми 18 г, 1 ½ дюйма иглы. Удалить пузырьки воздуха, нажав на шприц вверх. Блокировка раствора в программируемый шприцевой насос. Вставьте иглу через небольшое отверстие в акриловой коробке, оставляя около ½ дюйма иглы за пределами акриловой коробке для монтажа источника напряжения провода.
- Используйте 30 мм вращающийся станок оправки в качестве коллектора для высоко выровненных PCL волокон; покрыть оправку плотно тонкой полоски алюминиевой фольги. Блокировка оправку в двигатель на противоположной стороне коробки около 15 см от иглы шприца.
- Вставьте пластиковую трубку в вакуумную порт и подключения к вытяжным шкафом источника вакуума. Включите источник вакуума и покрыть акриловой коробку с крышкой.
- Sи др скорость инфузии программируемого шприца до 2,5 мл / ч. Включите двигатель работать оправку в 3450 оборотов в минуту и приложите положительный провод источника напряжения до кончика иглы за пределами коробки с помощью крокодил.
- После того, как введение раствора PCL началась, включите источник напряжения и устанавливается на рабочее напряжение 20 кВ.
- Влить раствор в течение 12 мин, чтобы создать однородное манжету из 0,5 мл раствора PCL.
ПРИМЕЧАНИЕ: В среднем, каждый манжеты имеет достаточно electrospun материал для создания двух шести-полосная листов, которые могут быть использованы для создания в общей сложности три четыре слоистых лесов.
- Лазерная резка в PCL манжету, чтобы сформировать несколько небольших листов на в VersaLaser Cutter 2.3 работает на низкой вакуумной установки, 10,0 кэВ посадки напряжения, 6,4 мм рабочее расстояние и диаметр зонда 3,0.
Примечание: В этом примере автоматизированного проектирования был использован для указания резак с получением нескольких листов 1,5 мм х 35 мм х 150 мкм каркасы сравномерно распределены отверстия диаметром 150 мкм при 15% площади пор. - Плазменного травления в PCL строительных лесов, используя очиститель плазмы, чтобы вызвать гидрофильность поверхности PCL с ускорения ионов. Установите вакуум до 450 мторр и лечить строительных лесов в течение 30 сек при высокой мощности (29,6 Вт).
- Купайтесь каркасов в 70% этаноле в стерильных условиях.
- Пальто отдельные леса с коллагеном для облегчения клеточную адгезию и пролиферацию в естественных условиях.
- Создание решение коллагена покрытия путем разбавления 8: 1: 2,5 стерильный раствор Purecol коллагена 3 мг / мл стандартного раствора, 10х PBS и 0,1 N NaOH 1: 9 в 1x PBS при 4 ° С. Тщательно перемешать, чтобы обеспечить решение однородности.
- Шерсть отдельные 1,5 мм х 35 мм х 150 мкм каркасы с тонким слоем пленки из вышеуказанного раствора коллагена. Дайте высохнуть в течение 24 часов в стерильной среде.
- Использование 5-0 викрила швов, стек и прикрепить четырех отдельных 1,5 мм х 35 мм х 150 мкм строительных лесовс помощью Krackow сшить для создания окончательных 0,6 мм толщиной, многослойный, коллаген покрытием эшафот, что готов к имплантации.
2. Крыса хирургии протокол
- Анестезии путем размещения крысу в ингаляционной камере и доставки 2% изофлуран с 2 л / мин кислорода. Подтвердите крысу адекватно наркозом, применяя давление задней ноги и оценки какого-либо ответа.
- На нестерильной задней стол, подкожно вводят 25 мг / кг ампициллин и 0,03 мг / кг бупренорфина.
- Применить глазной мази для глаз. Клип мех от оперативного задней конечности и подготовки к хирургической сайта с трех чередующихся скрабы хлоргексидина и 70% этанола.
- Трансфер крысу на операционный стол, на нагретой панели, чтобы предотвратить переохлаждение. Secure носовой конус, и поддержания анестезии в порядке, с 2% изофлуран в 2 л / мин кислорода, доставляется носовой обтекатель. Драпируйте в стерильных условиях, в результате чего оперативное конечности подвергаются.
- Сделайте 2 см длиной вертикальный разрез медиальнее до колена, с центром на уровне коленной чашечки. Уберите кожу с боков, пока разрез не по центру над коленом.
- Использование скальпель, чтобы сделать медиальной parapatellar Артротомия резанием только медиальнее надколенника и расширение проксимально к уровню мышечно стыке четырехглавой и дистально к уровню коленного сухожилия вставки на большеберцовой туберкулезных. Позаботьтесь, чтобы не порезать надколенника или четырехглавой сухожилий.
- Коленная чашечка выпуска с боков, делая 1 см вертикальный разрез по колено капсулы просто сбоку от надколенника.
- Убедитесь, колено продлен. Возьмите пару тонких ножниц и пройти под коленной чашечки от боковых медиальной. Распространение ножницы пару раз так, что механизм разгибателей можно перевести в любую сторону.
- В то время как сгибание тон колена, переводит надколенника в поперечном направлении, чтобы обнажить внутреннюю часть коленного сустава. Убедитесь, четкую визуализацию межмыщелковой вырезки и бедренных мыщелков. Использование скальпеля, секут в ACL и PCL в паз.
- Добавить дрель с 1,6 мм спицу. Поместите спицы наконечник на ACL происхождения в межмыщелковой паз. Дрель superolaterally и визуализировать точку выхода на латеральной поверхности бедра, удаление и мягких тканей, при необходимости с помощью скальпеля. Пропустите спицу в и из несколько раз, чтобы убедиться, свободный проход для протеза.
- Поместите спицы на ACL след на плато большеберцовой кости. Дрель антеролатерально и визуализировать точку выхода на передне-боковой проксимального отдела большеберцовой кости. Использование скальпель, чтобы очистить мягкой ткани по мере необходимости так, что точка, в которой K-провод выходит из голени полностью визуализированы.
- Пройдите сокращенный Кейт иглу (длинная в идеале не более 2 дюймов) через бедренную туннеля кости. Автор двух шовные концы от одного конца трансплантата через ушко Кeith иглы. С помощью иглы, чтобы вытащить один конец трансплантата через бедренную туннеля.
- Повторите на предыдущем этапе, чтобы передать другой конец трансплантата через большеберцовой туннеля.
- Используйте 4-0 викрил шов, чтобы прикрепить бедренной конец трансплантата к окружающей надкостницы или другой мягкой ткани с стежка фигура-оф-восемь. Напряжение трансплантата с коленом в продлении вручную. Прикрепите большеберцовой конец трансплантата к окружающей надкостницы или другой мягкой ткани с стежка фигура-оф-восемь.
- Используйте ножницы, чтобы отрезать лишнюю трансплантата на обоих концах, оставляя 1-2 мм на каждом конце прошлой стежка фигура-оф-восемь.
- Продлить колено и уменьшить коленную чашечку. Использование 4-0 викрил, поместите один показатель, по-восьми стежок, чтобы закрыть медиальной суставной капсулы, предотвращения бокового подвывих коленной чашечки.
- Закройте кожу с управлением субкутикулярных 5-0 Monocryl или викрил шва, с осторожностью, чтобы не сшивать подлежащей мышцы или у вас есть видимый шов, как только кожа закрыты.
- ИнджеКТ крысам подкожно бупренорфин каждые 12 ч в течение в общей сложности трех дней после операции. Проверьте хирургического сайта для любых дренажа или раны, расхождение краев раны во время инъекции. Limping и небольшая опухоль, нормальны в первые несколько дней после операции, но оперативно решать любые послеоперационных проблем в сочетании с ветеринарной персонала. Животное может быть возврата к социальному жилью на 2 недели после операции, когда хирургические разрезы полностью зажили.
3. Сбор данных протокола
- В то время умерщвления, удушье крыс по отдельности в закрытом СО 2 камеры с последующим торакотомии.
- Урожай оба хирургическим реконструируемых и контралатеральной конечности путем разделения на тазобедренном суставе.
- Для реконструируемых конечностей, удалить все мягкие ткани, в том числе задней крестообразной связки и остатки от хирургическим нарушается родной ACL, тонкой рассечение изолировать только бедра, голени, и взяточничество. <LI> Для контралатеральных конечностей, удалить все мягкие ткани, кроме родного ACL, а также бедра и голени в виде штрафа вскрытия.
- Использование роторного инструмента, такого как Dremel, чтобы удалить все, кроме ¾ до 1 см кости с каждого конца бедренной кости, большеберцовой кости трансплантат комплекса.
- В ходе этого процесса и в течение биомеханической испытаний, регулярно и часто опрыскивать связок области с физиологическим раствором, чтобы предотвратить высыхание собранного колена, которые могут изменить результаты ложно.
- Безопасный бедра и голени, обернув 28 г оцинкованной стальной проволоки вокруг эпифиза каждой кости отдельно. Это необходимо для предотвращения неточных биомеханические данные тестирования от преждевременного растяжение разрушения образца в кости, а не на связки интерес.
- Пот бедра в смеси полиметилметакрилата (ПММА) костного цемента. Для этого смешайте два компонента цемента и сразу же использовать вязкую смесь, чтобы обеспечить бедра в металл, полностью упаковывая диафиза кости в цементированным горшок с эпифизом и придает связки выступающей свободно. Разрешить бесплатно радикальной полимеризации спонтанное постепенно трансформировать смешанные вязких компонентов в вязкой материала и в конечном итоге в твердой закаленной матрицы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот процесс занимает несколько минут и может контролироваться вручную оценки температуры комка, изготовленной изОставшиеся цемента; температура должна временно увеличить во время экзотермической реакции полимеризации, и спадают до комнатной температуры после того, как материал затвердевает. - Повторите тот же самый процесс выше для цементирования голени, за исключением при сохранении связок колена на 20 ° сгибания для идеального механических испытаний.
- Установите цементированного бедро-трансплантат голени комплекс на разрывной аппарата, и подготовить для записи нагрузки и перемещения в зависимости от времени с начала напряжения на провал. В этом примере мы использовали Инстрон Модель 5564 с датчиком нагрузки 1 кН.
- Предварительное натяжение трансплантата до 2 N со скоростью разгона 0,5 N / мин, а затем проверить трансплантата до отказа при скорости деформации 0,5 мм / сек. В процессе, убедитесь, что связки не удается в середине вещества и что костлявая бедра и голени находятся в безопасности и преждевременно не удается, которая может неточно оценить биомеханические свойства испытуемого связки.
- Используйте созданный нагрузки-смещениеКривые для расчета разрушающей нагрузки и жесткость тестируемого связки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В нашем опыте 92 крыс операций одним хирургом, среднее оперативное время от разреза до завершения раны составила 16,9 мин, со стандартным отклонением 4,7 мин. Во время жертвоприношения, крысы весили 356 ± 23 г. Все крысы переносили операцию хорошо, и не возникло никаких осложнений. Сразу же после операции крыс отметить, чтобы нести вес на оперативном конечности, но выставлены прихрамывая. По одной недели после операции, всех крыс ambulating без заметного прихрамывая. Животные все набрали вес неуклонно ходе исследования, без наблюдаемых аномалий в кормлении, мочеиспускание или дефекации привычек. Клинически не полная рана, расхождение, эритема, отек, выпот или дренаж не наблюдалось после операции.
92 крыс операции, упомянутые выше, не были выполнены в основном для целей применения этих методов рукописи. Скорее всего, они были использованы для тестирования различных инженерных условия трансплантата. В то время как detailed механические испытания и гистологические результаты выходят за рамки этого документа, более подробную информацию можно найти в работе Леонг и др. 26. Короче говоря, в 16 недель после реконструкции, гистологический анализ секционного колена показал, что леса матрица стала в значительной степени проникли фибробластов, секретирующих эозинофильный коллаген с хорошей интеграции в кость туннелей (рис 3). В это время, каркас был полностью рассасываются и никаких доказательств полимера не визуализировали. Кроме того, иммуногистохимия для макрофагов маркер CD68 продемонстрировал минимальную воспалительную реакцию в 16 недель после операции (рисунок 4).
Биомеханические свойства были оценены сразу после жертвоприношения. Все протестированные образцы не удалось в середине вещества (рисунок 5). Использование кривых нагрузки смещения, полученные от испытаний на растяжение (рис 6), разрушающая нагрузка и жесткостьбыли вычислены для каждой группы. В 16 недель после имплантации, electrospun полимер трансплантат был примерно в два раза максимальную нагрузку и жесткость протеза, испытанными непосредственно после имплантации, но эти значения были ниже, чем на родном ACL 26.
Рисунок 1. СЭМ-изображение electrospun поликапролактонового эшафот с совмещенными волокон. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2. Бестимусным крысах реконструкции передней крестообразной связки. () Выделение надколенника с помощью медиальной parapatellar разрез кожи. (B) Бурение бедренной Tunneл через 1,6 мм спицу. (C) Бурение большеберцовой туннеля. (D) Размещение 1,2 мм Keith иглой через бедренную туннеля тянуть трансплантата через. (E) Electrospun поликапролактона трансплантат протягивается через бедренную туннеля. (F) Прививка вытащил через обе бедра и голени туннелей, прежде чем концы обрезаются и пришита к надкостнице и слоистых закрытие выполняется. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 3. гематоксилин-эозином из electrospun полимерной трансплантата (вверху) в большеберцовой кости туннеля (слева), midsubstance (в центре) и бедренной кости туннеля (справа). Для сравнения, родной ACL показано (внизу), при вставке большеберцовой ( слева), midsubstance (CEГюнтер) и бедренной происхождения (справа), 10X. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 4. Colorimetric иммуногистохимии окрашивание CD68, маркер для макрофагов. Качественно, там, кажется, несколько более позитивными окрашивание в туннеле кости в 8 недель, чем в внутрисуставного области трансплантата или в 16 недель после оп. Там, кажется, минимальное воспаление в трансплантатов. Все изображения являются 20X увеличение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 5. Изображения механических испытаний имплантированного electrospun трансплантата, демонстрируя отказ в midsubstance трансплантата. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 6. Пример кривой нагрузки перемещения для тканевой инженерии ACL трансплантата при 16 недель после имплантации в бестимусным крысиной модели. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ACL травмы общее состояние в ортопедической спортивной хирургии, с ограниченными возможностями для реконструкции в настоящее время. Для того, чтобы разработать соответствующий тканевой инженерии замену для ACL, что позволит регенерацию в естественных условиях, подходящая животная модель обязательно для заполнения. В этом исследовании, изготовление из биоразлагаемого имплантата инженерии описано, как его имплантации в естественных условиях с использованием воспроизводимый модель реконструкции ACL в бестимусных крыс. Эта модель может быть использована для оценки различных тканевой инженерии трансплантаты ACL, состоящие из различных биоматериалов, в том числе клеточных трансплантатов и тех, с включены факторов роста.
В данном исследовании мы проверили ацеллюлярную, electrospun поликапролактон трансплантата с ориентированными волокнами. Предыдущие исследования ткани инженерии реконструкции связки были имплантированы плетеные или экструдированные трансплантатов, изготовленные из различных материалов, в том числе шелк, PLLA и полиуретана 27-29, Ни один из этих материалов не привело как успешной интеграции имплантата и суммировании механических свойств ACL 7. В то время как многие полимеры имеют потенциал для использования в реконструкции связки, это исследование исследовали PCL, поскольку он является биологически инертным, нетоксичным, медленно разлагается в естественных условиях, и легко изготовлены в желаемой конформации 30. PCL также механической прочностью и показывает мало пластической деформации под действием механических напряжений 30. Его использование было установлено в костной ткани технической литературе в качестве надежного резервуара для минерализации и типа я коллагена осаждения из-за его в соответствие структуры нановолокон, когда electrospun 31. Кроме того, было показано, что высокие поверхности к объему и короткую диффузионную длину шкалы волокон малого диаметра в electrospun PCL коврики благоприятны для регулируемой доставки лекарственного средства и применение в тканевой инженерии 31.
Было обнаружено, чтоимплантированные трансплантаты были биосовместимы на основе отсутствия клинических побочных реакций и способствует родной клеточную инфильтрацию, как видно гистологически в 16 недель после операции. Мы использовали в Бестимусным животную модель в данном исследовании, как это первый этап двухэтапного проекта, который в конечном итоге использовать клетки человека, имплантированных трансплантата, и атимические модель будет уменьшить озабоченность по поводу отказа от клеток человека. Electrospun полимер леса способствовали как клетки и матрицу выравнивание в регенерированного ACL. Как видно на поперечном сечении трансплантата, большинство клеток были выровнены в направлении волокон. В имплантированные трансплантаты показали повышенную механические свойства в течение долгого времени. Нагрузка к выходу из полимерных имплантатов в два раза по сравнению с восстановленной ACL сразу же после операции. В то время как пиковой нагрузки и жесткость трансплантата PCL может показаться низкими по сравнению с нативной ACL, важно помнить, что эти результаты следует рассматривать в свете Fакт, который даже нынешний золотой стандарт, аутотрансплантатов или аллотрансплантатов, не в состоянии достичь механической прочности здорового ACL 16 недель после операции. Например, Xu и др. Сообщили о качестве аутотрансплантата ACL в модели кролика, в котором пиковая нагрузка составляет 20% -35% и жесткость на 23% -36%, что здорового родной ACL по 6 месяцев после операции 32. Кроме того, аллотрансплантата исследование в модели собачьего продемонстрировали примерно 30% пиковой нагрузки и 40% жесткости родной ACL на 30 недель после операции 33.
Хотя это выходит за рамки данной статьи, многие другие анализы могут быть выполнены, чтобы оценить качество трансплантата после использования этой модели на животных. Это включает, но не ограничивается биолюминесцентного изображений или рентгеновских лучей и КТ в естественных условиях, и множеством пятен и анализов, таких как иммуногистохимии для коллагеновых маркеров или маркеров воспаления. Например, ранее мы опубликовали результаты по количественной выровненных соllagen волокон с использованием picrosirius красные пятна после имплантации electrospun PCL лесов, имплантированных в данной животной модели 26.
Потенциальные ограничения этого исследования включают в себя выбор самой модели животного. Присущие различия в анатомии и походки в четвероногих крысы по сравнению с двуногими человека означает, что биомеханика ACL варьируются и что перевод клинических параметров между моделями должно быть сделано со знанием этих ограничений. Тем не менее, этот вопрос является общим в исследованиях на животных и не отрицает важность или поступательное потенциал этого исследования.
Там было интересно исследование послеоперационных протоколов для реконструкции крыса ACL с помощью аутотрансплантата, которые могут быть применены к нашей модели для инженерных замены ACL в будущем. Внешние устройства фиксации были использованы для иммобилизации крыс после операции для того, чтобы позволить улучшенное заживление сухожилия-кости у аутотрансплантата сухожилия модели19 Кроме того, было показано, что задержка циклическую нагрузку, такие как с сгибания расширения устройства, описанного Stasiak и др., 34., Может дополнительно повысить аутотрансплантата включение 20. Тем не менее, это также было показано, что короткие длительности низкого величина циклическое нагружение также может привести к повышенной воспаление уменьшилось и образование костной ткани на поверхности раздела кость-сухожилия 35. Дальнейшие исследования должны быть проведены, чтобы оценить применимость этих результатов к electrospun, на полимерной основе замены ACL, как, например трансплантат бы слабые начальные механические свойства, чем сухожилия аллотрансплантата.
Настоящее исследование разработана модель реконструкции передней крестообразной связки ацеллюлярной electrospun трансплантата в бестимусным крысы, основаны от модификации ранее описанного крыс аутотрансплантата модели 17-22. Мы продемонстрировали разработку плотной краю коллагена всей трансплантата с одновременным улучшением нагрузки до отказатрансплантата в течение долгого времени. Это исследование также предоставляет доказательства концепции для использования этой модели в будущем для оценки различных тканевой инженерии трансплантаты для реконструкции передней крестообразной связки. В частности, бестимусных крыс позволяет посева ксеногенных донорских клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Габриэль Arom и Майкл Yeranosian для их технический вклад в более ранних итерациях проекта. Этот проект был профинансирован OREF клиницист Scientist субсидия на обучение (NL), HH Ли Хирургическое исследовательских грантов (NL), по делам ветеранов BLR & D заслуги отзыв 1 I01 BX00012601 (DM) и опорно-двигательного Трансплантация Фонд молодого исследователя Award (FP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medical grade ester terminated poly (ε-caprolactone), granule form (MW = 110,000) |  Lactel Absorbable Polymers |
Custom synthesized polymer to desired molecular weight | |
| 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol | Sigma-Aldrich | 105228 | Solvent for PCL polymer |
| 18 G x 1½" bevel needle | BD Medical | 305196 | |
| Remote Infuse/Withdraw Programmable Syringe Pump | Harvard Apparatus | 702101 | |
| VersaLaser VLS2.30 Laser Engraver | Microgeo USA | VLS2.30 | |
| Expanded Plasma Cleaner 115 V | Harrick Plasma | PDC-001 | Plasma etch just prior to collagen coating for surface modification |
| PureCol Collagen Standard Solution, 3 mg/ml | Advanced Biomatrix | 5015-A | Mix 8:1:2.5 solution of PureCol, 10x PBS, 0.1 N NaOH 1:9 in 1x PBS |
| Suture, 5-0 Vicryl | Henry Schein | 1086471 | |
| Suture, 4-0 Vicryl | Henry Schein | 6540072 | |
| Sharp-pointed Dissecting Scissors (Straight; 4.5 inch) | Fisher Scientific | 8940 | |
| Buphrenorphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | B9275 | Use 0.03 mg/kg for both intra- and post-operatively for pain control |
| Ampicillin, injectable | Henry Schein | 1185678 | Use 25 mg/kg subcutaneously during the procedure |
| K-wire, 1.6 mm | Spectrum Surgical | SI040062 | |
| Keith Needle, Straight 1½" | Delasco Dermatology Lab & Supply | KE-112 | |
| Immunocal Decalcifying Solution | Fisher Scientific | NC9491030 | |
| Opticryl Acrylic Resin Bone Cement (PMMA) (Monomer and polymer) | US Dental Depot | OPTICRYL 100410 | |
| Instron Model 5564 Tensile Testing Machine | Instron | 5564 | Any comparable tensile testing apparatus is suitable |
References
- Fetto, J. F., Marshall, J. L. The natural history and diagnosis of anterior cruciate ligament insufficiency. Clin Orthop Relat Res. (147), 29-38 (1980).
- Kim, Y. M., Lee, C. A., Matava, M. J. Clinical results of arthroscopic single-bundle transtibial posterior cruciate ligament reconstruction: a systematic review. Am J Sports Med. 39 (2), 425-434 (2011).
- Andersson, C., Odensten, M., Gillquist, J. Knee function after surgical or nonsurgical treatment of acute rupture of the anterior cruciate ligament: a randomized study with a long-term follow-up period. Clin Orthop Relat Res. (264), 255-263 (1991).
- Klimkiewicz, J. J., Petrie, R. S., Harner, C. D. Surgical treatment of combined injury to anterior cruciate ligament, posterior cruciate ligament, and medial structures. Clin Sports Med. 19 (3), 479-492 (2000).
- Petrigliano, F. A., McAllister, D. R., Wu, B. M. Tissue engineering for anterior cruciate ligament reconstruction: a review of current strategies. Arthroscopy. 22 (4), 441-451 (2006).
- Groot, J. H., et al. Use of porous polyurethanes for meniscal reconstruction and meniscal prostheses. Biomaterials. 17 (2), 163-173 (1996).
- Leong, N. L., Petrigliano, F. A., McAllister, D. R. Current tissue engineering strategies in anterior cruciate ligament reconstruction. J Biomed Mater Res A. 102 (5), 1614-1624 (2014).
- Duling, R. R., Dupaix, R. B., Katsube, N., Lannutti, J. Mechanical characterization of electrospun polycaprolactone (PCL): a potential scaffold for tissue engineering. J Biomech Eng. 130 (1), 011006 (2008).
- Shao, Z., et al. Polycaprolactone electrospun mesh conjugated with an MSC affinity peptide for MSC homing in vivo. Biomaterials. 33 (12), 3375-3387 (2012).
- Tillman, B. W., et al. The in vivo stability of electrospun polycaprolactone-collagen scaffolds in vascular reconstruction. Biomaterials. 30 (4), 583-588 (2009).
- Wise, S. G., et al. A multilayered synthetic human elastin/polycaprolactone hybrid vascular graft with tailored mechanical properties. Acta Biomater. 7 (1), 295-303 (2011).
- Vargel, I., Korkusuz, P., Menceloğlu, Y. Z., Pişkin, E. In vivo performance of antibiotic embedded electrospun PCL membranes for prevention of abdominal adhesions. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 81 (2), 530-543 (2007).
- Cao, H., McHugh, K., Chew, S. Y., Anderson, J. M. The topographical effect of electrospun nanofibrous scaffolds on the in vivo and in vitro foreign body reaction. J Biomed Mater Res A. 93 (3), 1151-1159 (2010).
- Joshi, V. S., Lei, N. Y., Walthers, C. M., Wu, B., Dunn, J. C. Macroporosity enhances vascularization of electrospun scaffolds. J Surg Res. 183 (1), 18-26 (2013).
- Pham, Q. P., Sharma, U., Mikos, A. G. Electrospun poly(epsilon-caprolactone) microfiber and multilayer nanofiber/microfiber scaffolds: characterization of scaffolds and measurement of cellular infiltration. Biomacromolecules. 7 (10), 2796-2805 (2006).
- Vaz, C. M., van Tuijl, S., Bouten, C. V., Baaijens, F. P. Design of scaffolds for blood vessel tissue engineering using a multi-layering electrospinning technique. Acta Biomater. 1 (5), 575-582 (2005).
- Kawamura, S., Ying, L., Kim, H. J., Dynybil, C., Rodeo, S. A. Macrophages accumulate in the early phase of tendon-bone healing. J Orthop Res. 23 (6), 1425-1432 (2005).
- Hays, P. L., et al. The role of macrophages in early healing of a tendon graft in a bone tunnel. J Bone Joint Surg Am. 90 (3), 565-579 (2008).
- Dagher, E., et al. Immobilization modulates macrophage accumulation in tendon-bone healing. Clin Orthop Relat Res. 467 (1), 281-287 (2009).
- Bedi, A., et al. Effect of early and delayed mechanical loading on tendon-to-bone healing after anterior cruciate ligament reconstruction. J Bone Joint Surg Am. 92 (14), 2387-2401 (2010).
- Bedi, A., Kawamura, S., Ying, L., Rodeo, S. A. Differences in tendon graft healing between the intra-articular and extra-articular ends of a bone tunnel. HSS J. 5 (1), 51-57 (2009).
- Fu, S. C., et al. Effect of graft tensioning on mechanical restoration in a rat model of anterior cruciate ligament reconstruction using free tendon graft. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc. 21 (5), 1226-1233 (2013).
- Fan, H., Liu, H., Wong, E. J., Toh, S. L., Goh, J. C. In vivo study of anterior cruciate ligament regeneration using mesenchymal stem cells and silk scaffold. Biomaterials. 29 (23), 3324-3337 (2008).
- Landis, J. R., Koch, G. G. The measurement of observer agreement for categorical data. Biometrics. 33 (1), 159-174 (1977).
- Joshi, S. M., Mastrangelo, A. N., Magarian, E. M., Fleming, B. C., Murray, M. M. Collagen-platelet composite enhances biomechanical and histologic healing of the porcine anterior cruciate ligament. Am J Sports Med. 37 (12), 2401-2410 (2009).
- Leong, N. L., et al. In vitro and in vivo evaluation of heparin mediated growth factor release from tissue-engineered constructs for anterior cruciate ligament reconstruction. J Orthop Res. 10, (2014).
- Seo, Y. K., et al. Increase in cell migration and angiogenesis in a composite silk scaffold for tissue-engineered ligaments. J Orthop Res. 27 (4), 495-503 (2009).
- Freeman, J. W., Woods, M. D., Laurencin, C. T. Tissue engineering of the anterior cruciate ligament using a braid-twist scaffold design. J Biomech. 40 (9), 2029-2036 (2007).
- Bashur, C. A., Shaffer, R. D., Dahlgren, L. A., Guelcher, S. A., Goldstein, A. S. Effect of fiber diameter and alignment of electrospun polyurethane meshes on mesenchymal progenitor cells. Tissue Eng Part A. 15 (9), 2435-2445 (2009).
- Dash, T. K., Konkimalla, V. B. Poly-є-caprolactone based formulations for drug delivery and tissue engineering: A review. J Control Release. 158 (1), 15-33 (2012).
- Yoshimoto, H., Shin, Y. M., Terai, H., Vacanti, J. P. A biodegradable nanofiber scaffold by electrospinning and its potential for bone tissue engineering. Biomaterials. 24 (12), 2077-2082 (2003).
- Xu, Y., Ao, Y. F. Histological and biomechanical studies of inter-strand healing in four-strand autograft anterior cruciate ligament reconstruction in a rabbit model. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc. 17 (7), 770-777 (2009).
- Shino, K., et al. Replacement of the anterior cruciate ligament by an allogeneic tendon graft. An experimental study in the dog. J Bone Joint Surg Br. 66 (5), 672-681 (1984).
- Stasiak, M. E., et al. A novel device to apply controlled flexion and extension to the rat knee following anterior cruciate ligament reconstruction. J Biomech Eng. 134 (4), 041008 (2012).
- Brophy, R. H., et al. Effect of short-duration low-magnitude cyclic loading versus immobilization on tendon-bone healing after ACL reconstruction in a rat model. J Bone Joint Surg Am. 93 (4), 381-393 (2011).
