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Bioengineering

इंजीनियर पूर्वकाल cruciate बंधन grafts के मूल्यांकन के लिए Athymic चूहे मॉडल

Published: March 26, 2015 doi: 10.3791/52797
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1, 1
1Department of Orthopaedic Surgery, University of California Los Angeles, 2Department of Bioengineering, University of California Los Angeles

Introduction

पूर्वकाल cruciate बंधन (एसीएल) का टूटना घुटने एक का सबसे आम बंधन चोटों से एक है। उठी एसीएल की शल्य चिकित्सा के हस्तक्षेप के बिना चंगा करने में असमर्थ है, क्योंकि दैनिक जीवन के साथ-साथ खेलों में भागीदारी की गतिविधियों में सीमाओं सालाना एक अरब डॉलर से 3 की अनुमानित लागत के साथ, हर साल दो सर्जरी से गुजरना करने के लिए 175,000 से अधिक रोगियों ड्राइव। वर्तमान में, autograft या allograft कण्डरा या तो बंध पुनर्निर्माण के लिए प्रयोग किया जाता है। उच्च सफलता दर दोनों autograft और allograft प्रतिस्थापन के साथ प्राप्त किया जा सकता है, गंभीर जटिलताओं इन पुनर्निर्माण विकल्पों 4 के साथ जुड़े रहे हैं। Autograft ऊतक विशेष रूप से फिर से टूटना या बहु ligamentous चोट के मामलों में, दाता साइट रुग्णता के साथ जुड़ा हुआ है और आपूर्ति में सीमित है। दूसरी ओर, allograft ऊतक देरी भ्रष्टाचार एकीकरण, प्रतिकूल भड़काऊ प्रतिक्रिया, सैद्धांतिक संक्रामक जोखिम, और सीमित supp के साथ जुड़ा हुआ हैly के 5। सिंथेटिक गैर degradable ग्राफ्ट 1970 के दशक और 1980 के दशक में विकसित किया गया था, लेकिन समय से पहले भ्रष्टाचार टूटना, विदेशी शरीर प्रतिक्रियाओं osteolysis, और सिनोवाइटिस 6 द्वारा बाधा उत्पन्न कर रहे थे। इन गंभीर चिंता का एक परिणाम के रूप में, संयुक्त राज्य अमेरिका में नैदानिक ​​इस्तेमाल के लिए उपलब्ध नहीं सिंथेटिक ग्राफ्ट वर्तमान में कर रहे हैं।

कारण मौजूदा भ्रष्टाचार के विकल्प के साथ और जीव विज्ञान, इंजीनियरिंग, और पुनर्योजी चिकित्सा में हाल के घटनाक्रम के लिए इन सीमाओं के कारण, एसीएल ग्राफ्टिंग के लिए एक ऊतक इंजीनियर समाधान में बहुत रुचि हुई है। वर्तमान ऊतक इंजीनियरिंग रणनीतियों स्थायी सिंथेटिक सामग्री आरोपण 7 के साथ जुड़े सीमाओं से परहेज करते हुए मेजबान ऊतक कुदी तसवीर की छाप के लिए अनुमति देने के लिए सड़ सकने जैविक और सिंथेटिक सामग्री को रोजगार।

पॉलिकैप्रोलैक्टोन (पीसीएल) एफडीए आसंजन बाधा सहित चिकित्सा अनुप्रयोगों के एक नंबर के लिए मंजूरी दे दी है और 8 ड्रेसिंग घाव है कि एक biodegradable बहुलक है, कि यू कर दिया गया हैसंवहनी, हड्डी, उपास्थि, तंत्रिका, त्वचा, और esophageal ऊतक इंजीनियरिंग 5,9-16 सहित आवेदन की एक विस्तृत विविधता में sed। अनुकूल biocompatibility, अपेक्षाकृत लंबे समय इन विवो आधा जीवन, पर्याप्त यांत्रिक शक्ति, और उच्च लोच ऊतक इंजीनियरिंग में इस बहुलक की लोकप्रियता के लिए योगदान करते हैं। घाव भरने के कृंतक मॉडल में, प्रत्यारोपित electrospun PCL गैर immunogenic होने के लिए और प्रतिकूल प्रतिक्रिया 13 बिना स्थानीय ऊतक में एकीकृत करने के लिए दिखाया गया था। Electrospun PCL की एक SEM छवि चित्र 1 में दिखाया गया है।

दोनों छोटे और बड़े पशु मॉडल में मौजूदा एफडीए नियामक मानकों, प्रभावकारिता और सुरक्षा के साथ संयुक्त राज्य अमेरिका में क्लिनिकल परीक्षण में स्थानांतरित करने के लिए एक PCL या किसी भी अन्य इंजीनियर एसीएल भ्रष्टाचार के लिए आवश्यक होगा। साथ ही, इन विवो शर्तों अक्सर एक में इन विट्रो ऊतक इंजीनियर एसीएल भ्रष्टाचार के गुणों में वृद्धि कर सकते हैं। आकुंचिका digitor साथ ऑटोलॉगस एसीएल पुनर्निर्माण का एक चूहे मॉडलउम longus कण्डरा पहले से देशी एसीएल, कटे और्विक और टिबियल सुरंगों drilled थे, और भ्रष्टाचार के पारित कर दिया और सिवनी 17-22 के साथ जगह में सुरक्षित किया गया था, जिसमें वर्णित किया गया है। इस पत्र में, हम इंजीनियर एसीएल प्रतिस्थापन के मूल्यांकन के लिए बजाय autograft आधारित पुनर्निर्माण (चित्रा 2) के लिए इस मॉडल की एक संशोधन का वर्णन करेंगे।

कई पशु मॉडल बंधन ऊतक इंजीनियरिंग के लिए मौजूद हैं, चूहे कारणों में से एक नंबर के लिए बड़े मॉडलों की तुलना में लाभदायक है। ये लाभ आसान पशुपालन और हैंडलिंग, कम नैतिक आधार है, और कम कीमत 17,23 शामिल हैं। इसके अलावा, चूहे मॉडल उपास्थि, पट्टा, और अस्थि ऊतक इंजीनियरिंग में 24 सहित आर्थोपेडिक ऊतक उत्थान के लिए एक मॉडल के रूप में बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है। विशेष रूप से, athymic नग्न चूहों अंतिम आरोपण ओ की अनुमति के लिए सेल की मध्यस्थता प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 25 की कमी की वजह से चुना गयाइस मॉडल में च xenogeneic दाता कोशिकाओं आगे भविष्य में इंजीनियर भ्रष्टाचार को बढ़ाने के लिए। इस तरीके पत्र में, हम एसीएल पुनर्निर्माण की एक athymic चूहे मॉडल में निर्माण और एक अकोशिकीय की शल्य आरोपण, biodegradable बहुलक भ्रष्टाचार का वर्णन है।

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Protocol

नोट: सभी पशु सर्जरी प्रयोगों शुरू करने से पूर्व स्थानीय पशु चिकित्सा स्टाफ और पशुओं के उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया।

Electrospun पॉलिकैप्रोलैक्टोन scaffolds के 1. तैयारी

  1. डब्ल्यू एक 10% बनाने के लिए 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol में दाना रूप में चिकित्सा ग्रेड एस्टर समाप्त कर पाली (ε-caprolactone) वजन और भंग PCL बहुलक का समाधान डब्ल्यू /। एक समरूप समाधान सुनिश्चित करने के लिए कम से कम तीन घंटे के लिए एक हलचल प्लेट का उपयोग कर समाधान हलचल करते हैं।
  2. PCL के समाधान Electrospin पाड़ निर्माण के लिए अत्यधिक गठबंधन PCL के फाइबर की एक कफ बनाने के लिए।
    1. हर समय पर प्रशंसक के साथ एक रासायनिक धूआं हुड में electrospinning सेटअप तैयार करें। यह एक वोल्टेज स्रोत, मोटर चालित एकत्रित कर खराद का धुरा, और एक निर्वात पोर्ट के द्वारा संचालित स्रोत PCL के समाधान के लिए प्रवेश द्वारों electrospinning प्रक्रिया के लिए एक अलग वैक्यूम के माध्यम के रूप में सेवा की है और है कि एक बड़ी एक्रिलिक बॉक्स के होते हैं। Acryli साफसी बॉक्स अच्छी तरह से इथेनॉल के साथ और electrospun उत्पाद की गुणवत्ता में समझौता हो सकता है कि किसी भी दोष को दूर करने के लिए Parafilm के पत्र के साथ सभी सतहों को कवर किया।
    2. एक कुंद के साथ एक 10 मिलीलीटर सिरिंज में ऊपर के समाधान का भार लगभग 3 मिलीलीटर 18 जी, एक आधा इंच सुई समाप्त हो गया। सिरिंज धक्का द्वारा किसी भी हवाई बुलबुले निकालें। एक प्रोग्राम सिरिंज पंप में ताला समाधान। वोल्टेज स्रोत तार की कुर्की के लिए एक्रिलिक बॉक्स के बाहर साढ़े बारे में सुई की इंच छोड़ने जबकि एक्रिलिक बॉक्स में एक छोटा सा छेद के माध्यम से सुई डालें।
    3. अत्यधिक गठबंधन PCL के फाइबर के लिए कलेक्टर के रूप में एक 30 मिमी घूर्णन खराद का धुरा का उपयोग करें; एल्यूमीनियम पन्नी की एक पतली पट्टी के साथ कसकर खराद का धुरा को कवर किया। के बारे में 15 सेमी दूर सिरिंज सुई से बॉक्स के विपरीत दिशा में मोटर में खराद का धुरा ताला।
    4. वैक्यूम बंदरगाह में प्लास्टिक की नली डालें और धूआं हुड वैक्यूम स्रोत से कनेक्ट। वैक्यूम स्रोत पर बारी और एक ढक्कन के साथ एक्रिलिक बॉक्स को कवर किया।
    5. एसईटी 2.5 मिलीग्राम / घंटा करने के लिए प्रोग्राम सिरिंज पंप के अर्क दर। 3450 rpm पर खराद का धुरा काम करते हैं और एक मगरमच्छ क्लिप का उपयोग कर बॉक्स के बाहर सुई टिप करने के लिए वोल्टेज स्रोत के सकारात्मक नेतृत्व संलग्न करने के लिए मोटर चालू करें।
    6. PCL के समाधान की जान फूंकना शुरू हो गया है एक बार, वोल्टेज स्रोत पर बारी और एक 20 केवी ऑपरेटिंग वोल्टेज के लिए निर्धारित किया है।
    7. PCL के समाधान के 0.5 मिलीलीटर से एक समरूप कफ बनाने के लिए 12 मिनट के लिए समाधान दिखे।
      नोट: औसत पर, प्रत्येक कफ तीन चार स्तरों scaffolds के एक कुल बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जो दो से छह-पट्टी चादरें, बनाने के लिए पर्याप्त electrospun सामग्री है।
  3. लेजर कम निर्वात की स्थापना, 10.0 कीव लैंडिंग वोल्टेज, 6.4 मिमी दूरी काम है, और 3.0 की जांच के व्यास में संचालित एक VersaLaser कटर 2.3 पर कई छोटे पत्रक के लिए फार्म PCL कफ काटा।
    नोट: इस उदाहरण में, एक कंप्यूटर एडेड डिजाइन X 35 मिमी x 150 माइक्रोन scaffolds के साथ 1.5 मिमी के कई चादरें उपज के लिए कटर हिदायत करने के लिए इस्तेमाल किया गया थासमान रूप से 15% ताकना क्षेत्र में 150 माइक्रोन व्यास छेद वितरित की।
  4. प्लाज्मा आयन त्वरण के साथ PCL के सतह के hydrophilicity प्रेरित करने के लिए एक प्लाज्मा क्लीनर का उपयोग PCL scaffolds के खोदना। 450 mTorr और इलाज के लिए उच्च शक्ति (29.6 डब्ल्यू) में 30 सेकंड के लिए scaffolds के लिए वैक्यूम सेट करें।
  5. एक बाँझ वातावरण में 70% इथेनॉल में scaffolds स्नान।
  6. कोट कोलेजन के साथ व्यक्तिगत scaffolds के vivo में सेलुलर आसंजन और प्रसार की सुविधा।
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1x पीबीएस में 9: 1:: Purecol कोलेजन 3 मिलीग्राम / एमएल मानक समाधान, 10x पीबीएस और 0.1 एन NaOH एक के 2.5 बाँझ समाधान के लिए एक 8 गिराए द्वारा एक कोलेजन कोटिंग समाधान बनाएँ। समाधान एकरूपता सुनिश्चित करने के लिए अच्छी तरह से मिलाएं।
    2. कोट व्यक्ति 1.5 मिमी x 35 मिमी x से ऊपर कोलेजन समाधान की एक पतली परत फिल्म के साथ 150 माइक्रोन scaffolds के। एक बाँझ वातावरण में 24 घंटे के लिए शुष्क करने की अनुमति दें।
  7. 5-0 Vicryl टांके का उपयोग करना, ढेर और चार व्यक्ति 1.5 मिमी x 35 मिमी x 150 माइक्रोन scaffolds के प्रत्ययएक Krackow आरोपण के लिए तैयार है कि एक अंतिम 0.6 मिमी मोटी, बहुस्तरीय, कोलेजन लेपित पाड़ बनाने के लिए सिलाई का उपयोग कर।

2. चूहा सर्जरी प्रोटोकॉल

  1. साँस लेना कक्ष में चूहा रखने और 2 एल / मिनट ऑक्सीजन के साथ दो isoflurane% देने से संज्ञाहरण प्रेरित। चूहे की पुष्टि पर्याप्त रूप से पैर हिंद करने के लिए दबाव लागू करने के लिए और किसी भी प्रतिक्रिया के लिए मूल्यांकन द्वारा anesthetized है।
  2. गैर बाँझ मेज पर वापस, subcutaneously 25 मिलीग्राम / किग्रा एम्पीसिलीन और 0.03 मिलीग्राम / किग्रा buprenorphine इंजेक्षन।
  3. आंखों को नेत्र मरहम लागू करें। ऑपरेटिव पिछले अंग से फर क्लिप और तीन chlorhexidine की बारी scrubs और 70% इथेनॉल के साथ शल्य साइट तैयार।
  4. हाइपोथर्मिया को रोकने के लिए एक गर्म पैड पर, ऑपरेटिंग मेज पर चूहा स्थानांतरण। सुरक्षित नाक शंकु, और, 2 एल / मिनट ऑक्सीजन में 2% isoflurane के साथ प्रक्रिया के माध्यम से दिया नाक शंकु संज्ञाहरण बनाए रखें। उजागर ऑपरेटिव अंग छोड़ रहा है, एक बाँझ ढंग से कपड़ा।
  5. वुटने की चक्की के स्तर पर केन्द्रित घुटने के लिए एक 2 सेमी लंबी ऊर्ध्वाधर चीरा औसत दर्जे का, बनाते हैं। चीरा घुटने पर केंद्रित है जब तक पार्श्व त्वचा वापस लेना।
  6. बस वुटने की चक्की के लिए औसत दर्जे काटने और quadriceps की और distally टिबियल tubercule पर patellar कण्डरा प्रविष्टि के स्तर तक musculotendinous जंक्शन के स्तर तक proximally बढ़ा कर एक औसत दर्जे का parapatellar arthrotomy बनाने के लिए एक स्केलपेल का प्रयोग करें। पटेलर या क्वाड्रिसेप्स, tendons कटौती करने के लिए नहीं ख्याल रखना।
  7. Patellar कण्डरा को सिर्फ पार्श्व घुटने कैप्सूल के माध्यम से एक 1 सेमी ऊर्ध्वाधर चीरा द्वारा पार्श्व रिलीज वुटने की चक्की।
  8. घुटने बढ़ाया है सुनिश्चित करें। ठीक कैंची की एक जोड़ी ले लो और औसत दर्जे के लिए पार्श्व से वुटने की चक्की के तहत गुजरती हैं। प्रसारिणी तंत्र दोनों ओर के लिए अनुवाद किया जा सकता है, ताकि कैंची एक दो बार बिखरा हुआ है।
  9. टी ठोके जबकिवह घुटने, संयुक्त घुटने के अंदर बेनकाब करने के लिए पार्श्व वुटने की चक्की अनुवाद करते हैं। Intercondylar पायदान और ऊरु condyles का स्पष्ट दृश्य सुनिश्चित करें। एक स्केलपेल का उपयोग करना, निशान में एसीएल और PCL आड़ा काट।
  10. एक 1.6 मिमी कश्मीर के तार के साथ लोड बिजली ड्रिल। Intercondylar पायदान में एसीएल मूल पर कश्मीर तार टिप रखें। Superolaterally ड्रिल और एक स्केलपेल के साथ आवश्यक के रूप में किसी भी नरम ऊतकों को हटाने, फीमर के पार्श्व पहलू पर बाहर निकलने के बिंदु कल्पना। भ्रष्टाचार के लिए स्पष्ट पारित होने को सुनिश्चित करने में और एक बार कुछ बाहर K-तार गुजरती हैं।
  11. टिबियल पठार पर एसीएल पदचिह्न पर कश्मीर तार रखें। Anterolaterally ड्रिल और अग्रपाश्विक समीपस्थ टिबिया पर बाहर निकलने के बिंदु कल्पना। K-तार टिबिया बाहर निकलता है इस मुद्दे पर जहां पूरी तरह से कल्पना की है, ताकि आवश्यक के रूप में कोमल ऊतक को खाली करने के स्केलपेल का प्रयोग करें।
  12. और्विक हड्डी सुरंग के माध्यम से (आदर्श से अधिक नहीं 2 इंच लंबे) एक छोटा कीथ सुई से गुजरती हैं। कश्मीर की आंख के माध्यम से भ्रष्टाचार के एक छोर से दो सीवन सिरों धागाeith सुई। और्विक सुरंग के माध्यम से भ्रष्टाचार के एक छोर को खींचने के लिए सुई का प्रयोग करें।
  13. टिबियल सुरंग के माध्यम से भ्रष्टाचार के दूसरे छोर से पारित करने के लिए पहले चरण को दोहराएँ।
  14. एक आंकड़ा के-आठ सिलाई के साथ periosteum या अन्य नरम ऊतक आसपास के भ्रष्टाचार के और्विक अंत प्रत्यय 4-0 Vicryl सिवनी का प्रयोग करें। मैन्युअल तनाव विस्तार में घुटने के साथ भ्रष्टाचार। एक आंकड़ा के-आठ सिलाई के साथ periosteum या अन्य नरम ऊतक आसपास के भ्रष्टाचार के टिबियल अंत प्रत्यय।
  15. आंकड़ा के-आठ सिलाई अतीत प्रत्येक के अंत पर 1-2 मिमी छोड़ रहा है, दोनों सिरों पर अतिरिक्त भ्रष्टाचार के नाश करने के लिए एक कैंची का प्रयोग करें।
  16. घुटने का विस्तार करने और वुटने की चक्की कम। 4-0 Vicryl का प्रयोग, वुटने की चक्की के पार्श्व मोच रोकने, औसत दर्जे का संयुक्त कैप्सूल बंद करने के लिए एक एकल आंकड़ा-की-आठ सिलाई जगह है।
  17. अंतर्निहित मांसपेशियों सीवन के लिए नहीं देखभाल के साथ, एक चल subcuticular 5-0 Monocryl या Vicryl सीवन के साथ त्वचा को बंद या त्वचा बंद कर दिया है एक बार किसी भी दृश्य सीवन है।
  18. Injesubcutaneously buprenorphine साथ सीटी चूहों postoperatively के तीन दिनों के कुल के लिए हर 12 घंटा। इंजेक्शन के समय किसी भी जल निकासी के लिए शल्य साइट या घाव स्फुटन की जाँच करें। लंगड़ा और कुछ सूजन सर्जरी के बाद पहले कुछ दिनों में सामान्य हो रहे हैं, लेकिन तुरंत पशु चिकित्सा कर्मचारियों के साथ संयोजन के रूप में किसी भी पश्चात की चिंताओं को दूर। शल्य चीरों पूरी तरह से ठीक हो रहे हैं जब पशु, postoperatively के दो सप्ताह में सामाजिक आवास पर लौटने के लिए किया जा सकता है।

3. डेटा संग्रह प्रोटोकॉल

  1. बलिदान के समय, thoracotomy के बाद बंद सीओ 2 चैम्बर में व्यक्तिगत रूप से चूहों गला घोंटना।
  2. संयुक्त कूल्हे पर अलग से शल्य चिकित्सा द्वारा खंगाला और contralateral अंग दोनों हार्वेस्ट।
    1. खंगाला अंगों के लिए, केवल फीमर, टिबिया, और भ्रष्टाचार को अलग-थलग करने के लिए ठीक विच्छेदन से, पीछे cruciate बंधन और शल्य चिकित्सा द्वारा बाधित देशी एसीएल से अवशेष सहित सभी नरम ऊतक को हटा दें।
      2. <ली> प्रतिपक्षी अंगों के लिए, देशी एसीएल के अलावा सभी नरम ऊतक के रूप में अच्छी तरह से ठीक विच्छेदन द्वारा फीमर और टिबिया को हटा दें।
    2. फीमर भ्रष्टाचार-टिबिया परिसर के प्रत्येक के अंत से हड्डी के ¾ करने के लिए एक सेमी, लेकिन सभी को दूर करने के लिए, इस तरह के Dremel के रूप में एक रोटरी उपकरण का प्रयोग करें।
    3. इस प्रक्रिया के दौरान और biomechanical परीक्षण के दौरान, नियमित रूप से और अक्सर झूठा परिणाम बदल सकता है जो काटा घुटने की सुखाना को रोकने के लिए सामान्य नमक के साथ ligamentous क्षेत्रों स्प्रे।
  3. ऊतकीय विश्लेषण के लिए, 48 घंटा के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर व्यक्तिगत रूप से 4% paraformaldehyde समाधान में प्रत्येक घुटने तय कर लो। इसके बाद, पूरा विकैल्सीकरण के लिए Immunocal अभिकर्मक की एक समाधान में घुटने डूब; इस प्रक्रिया के नमूने की calcific सामग्री पर निर्भर है और पांच दिन तक का समय लग सकता है। नमूना गुणवत्ता को कम कर सकते हैं अधूरी विकैल्सीकरण के रूप में प्रगति का आकलन करने के लिए दैनिक व्यक्ति के नमूनों की जाँच करें। के रूप में वांछित, सेक्शनिंग प्रदर्शन, स्लाइड, बढ़ते और धुंधला एक बार पूरा हो गया।
  4. कामकाजएम बायोमैकेनिकल परीक्षण ऊतक इंजीनियर बंधन का कार्य क्षमता का आकलन करने के लिए।
    1. अलग से हड्डी के epiphysis लगभग 28 जी जस्ती इस्पात तार लपेटकर द्वारा फीमर और टिबिया सुरक्षित। यह हड्डी पर बजाय हित के बंधन में नमूने के समय से पहले तन्यता विफलता से गलत बायोमैकेनिकल परीक्षण डेटा को रोकने के लिए है।
    2. पॉट polymethylmethacrylate (PMMA) हड्डी सीमेंट के मिश्रण में फीमर। ऐसा करने के लिए, दो सीमेंट घटकों मिश्रण और तुरंत पूरी तरह से स्वतंत्र रूप से फैला हुआ epiphysis और संलग्न बंधन के साथ एकजुट बर्तन में हड्डी की diaphysis encasing, धातु में फीमर सुरक्षित करने के लिए चिपचिपा मिश्रण का उपयोग करें। सहज मुक्त कट्टरपंथी polymerization धीरे-धीरे एक मलायम सामग्री के लिए और अंत में एक ठोस कठोर मैट्रिक्स में मिश्रित चिपचिपा घटकों को बदलने की अनुमति दें।
      नोट: इस प्रक्रिया में कई मिनट लगते हैं और मैन्युअल रूप से बनाया गया एक सांस के तापमान का आकलन करने से नजर रखी जा सकतीशेष सीमेंट; तापमान क्षणिक एक्ज़ोथिर्मिक polymerization प्रतिक्रिया के दौरान बढ़ाने के लिए और सामग्री solidifies के बाद आर टी को कम करना चाहिए।
    3. आदर्श यांत्रिक परीक्षण के लिए 20 डिग्री मोड़ पर घुटने बंध बनाए रखते हुए, सिवाय टिबिया जोड़नेवाला के लिए ऊपर एक ही प्रक्रिया को दोहराएं।
    4. एक तन्यता परीक्षण उपकरण पर एकजुट फीमर भ्रष्टाचार-टिबिया जटिल माउंट, और विफलता के लिए तनाव की शुरुआत से समय के एक समारोह के रूप में रिकॉर्ड लोड और विस्थापन के लिए तैयार करते हैं। इस उदाहरण में, हम एक एक केएन लोड सेल के साथ एक Instron मॉडल 5564 का इस्तेमाल किया।
    5. पूर्व तनाव 0.5 एन / मिनट की एक रैंप दर पर 2 एन को भ्रष्टाचार और फिर 0.5 मिमी / सेकंड के एक तनाव दर पर विफलता के लिए भ्रष्टाचार का परीक्षण करें। प्रक्रिया के दौरान, बंध मध्य पदार्थ में असफल साबित हुई है कि और बोनी फीमर और टिबिया सुरक्षित हैं और समय से पहले ही गलत परीक्षण किया बंध के biomechanical गुणों का आकलन कर सकते हैं, जो नाकाम रहने यकीन नहीं है।
    6. उत्पन्न लोड विस्थापन का प्रयोग करेंघटता परीक्षण किया बंध की विफलता लोड और कठोरता की गणना करने के लिए।

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Representative Results

एक भी सर्जन द्वारा 92 चूहे सर्जरी के हमारे अनुभव में, घाव के पूरा होने से चीरा से ऑपरेटिव समय मतलब 4.7 मिनट की एक मानक विचलन के साथ, 16.9 मिनट था। बलिदान के समय, चूहों 356 ± 23 छ तौला। सभी चूहों को अच्छी तरह से सर्जरी सहन, और कोई जटिलताओं का अनुभव किया। तुरंत सर्जरी के बाद, चूहों ऑपरेटिव छोर पर भार सहन करने के लिए विख्यात है, लेकिन एक मामूली लंगड़ा प्रदर्शित किया गया। एक सप्ताह तक के बाद operatively, सभी चूहों कोई सराहनीय लंगड़ा के साथ ambulating थे। जानवरों के सभी खिला, पेशाब, या शौच की आदतों में कोई मनाया असामान्यताओं के साथ, अध्ययन के दौरान तेजी से वजन प्राप्त की। चिकित्सकीय, कोई सकल घाव स्फुटन, पर्विल, सूजन, बहाव, या जल निकासी postoperatively मनाया गया।

जैसा कि ऊपर उल्लेख 92 चूहे सर्जरी इस तरीके पांडुलिपि के प्रयोजन के लिए मुख्य रूप से प्रदर्शन नहीं कर रहे थे। बल्कि, वे विभिन्न इंजीनियर भ्रष्टाचार स्थितियों का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया गया। Detaile जबकिडी यांत्रिक परीक्षण और histological परिणाम इस पत्र के दायरे से बाहर हैं, अधिक जानकारी के Leong एट अल। 26 द्वारा एक अखबार में पाया जा सकता है। पुनर्निर्माण निम्नलिखित 16 सप्ताह में, संक्षेप में, sectioned घुटने के histological विश्लेषण पाड़ मैट्रिक्स काफी हद तक हड्डी सुरंगों में अच्छा एकीकरण (चित्रा 3) के साथ इओसिनोफिलिक कोलेजन स्रावित fibroblasts द्वारा घुसपैठ हो गया है कि प्रदर्शन किया। इस समय, पाड़ पूरी तरह से resorbed किया गया है और बहुलक का कोई सबूत नहीं कल्पना की गई थी। इसके अतिरिक्त, बृहतभक्षककोशिका मार्कर CD68 के लिए immunohistochemistry के बाद operatively 16 सप्ताह (चित्रा 4) में कम से कम भड़काऊ प्रतिक्रिया का प्रदर्शन किया।

Biomechanical गुणों बलिदान के बाद तुरंत मूल्यांकन किया गया। सभी परीक्षण के नमूने मध्य पदार्थ (चित्रा 5) में विफल रहा है। तनन परीक्षण से उत्पन्न लोड विस्थापन घटता (चित्रा 6), विफलता लोड और कठोरता का प्रयोगप्रत्येक समूह के लिए गणना कर रहे थे। 16 सप्ताह बाद आरोपण से कम, electrospun बहुलक भ्रष्टाचार के तुरंत बाद आरोपण परीक्षण किया भ्रष्टाचार के लगभग डबल पीक लोड और कठोरता थी, लेकिन इन मूल्यों देशी एसीएल 26 की तुलना में कम थे।

चित्र 1
चित्रा 1. निरपेक्ष फाइबर के साथ electrospun पॉलिकैप्रोलैक्टोन पाड़ की SEM छवि। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
एसीएल पुनर्निर्माण चित्रा 2. Athymic चूहे मॉडल। एक औसत दर्जे का parapatellar त्वचा चीरा के माध्यम से patellar कण्डरा की (ए) अलगाव। और्विक tunne (बी) ड्रिलिंग1.6 मिमी K-तार का उपयोग एल। टिबियल सुरंग (सी) ड्रिलिंग। और्विक सुरंग के माध्यम से 1.2 मिमी कीथ सुई (डी) प्लेसमेंट के माध्यम से भ्रष्टाचार को खींचने के लिए। (ई) Electrospun पॉलिकैप्रोलैक्टोन भ्रष्टाचार और्विक सुरंग के माध्यम से खींच लिया। सिरों छंटनी और periosteum के लिए sutured, और एक स्तरित बंद करने में किया जाता है कर रहे हैं इससे पहले (एफ) भ्रष्टाचार, दोनों और्विक और टिबियल सुरंगों के माध्यम से खींच लिया। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
टिबियल प्रविष्टि पर चित्रा 3. Hematoxylin और टिबियल हड्डी सुरंग (बाएं), midsubstance (बीच में), और और्विक हड्डी सुरंग (दाएं) पर electrospun बहुलक भ्रष्टाचार (ऊपर) के eosin धुंधला। तुलना के लिए, देशी एसीएल दिखाया गया है (नीचे), ( ) छोड़ दिया, midsubstance (सीईnter) और ऊरु मूल (दाएं), 10X। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
CD68, मैक्रोफेज के लिए एक मार्कर के लिए चित्रा 4. वर्णमिति immunohistochemistry के धुंधला। गुणात्मक बाद सेशन भ्रष्टाचार का इंट्रा-जोड़ क्षेत्र में अधिक या 16 सप्ताह में 8 सप्ताह में हड्डी सुरंग में थोड़ा और अधिक सकारात्मक धुंधला प्रतीत होता है। ग्राफ्ट में न्यूनतम सूजन प्रतीत होता है। सभी छवियों 20X बढ़ाई हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
भ्रष्टाचार के midsubstance पर विफलता का प्रदर्शन प्रत्यारोपित electrospun भ्रष्टाचार के यांत्रिक परीक्षण, 5. छवियाँ चित्रा। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
Athymic चूहे मॉडल में आरोपण के बाद 16 सप्ताह में ऊतक इंजीनियर एसीएल भ्रष्टाचार के लिए 6 चित्रा नमूना लोड विस्थापन वक्र। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

एसीएल चोटों वर्तमान समय में पुनर्निर्माण के लिए सीमित विकल्पों के साथ आर्थोपेडिक खेल सर्जरी में एक सामान्य स्थिति में हैं। Vivo में उत्थान की अनुमति देगा कि एसीएल के लिए एक उपयुक्त ऊतक इंजीनियर विकल्प विकसित करने के लिए एक उपयुक्त पशु मॉडल की आवश्यकता है। एक athymic चूहे में एसीएल पुनर्निर्माण की एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मॉडल का उपयोग कर अपने में vivo आरोपण है के रूप में इस अध्ययन में, एक biodegradable इंजीनियर भ्रष्टाचार के निर्माण, वर्णित है। इस मॉडल सेलुलर ग्राफ्ट और शामिल वृद्धि कारकों के साथ उन सहित विभिन्न biomaterials, से बना विभिन्न ऊतक इंजीनियर एसीएल ग्राफ्ट का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है।

इस विशेष अध्ययन में, हम गठबंधन फाइबर के साथ एक अकोशिकीय, electrospun पॉलिकैप्रोलैक्टोन भ्रष्टाचार का परीक्षण किया। ऊतक इंजीनियर बंधन पुनर्निर्माण के पिछले अध्ययनों लट या रेशम, PLLA सहित सामग्री की एक किस्म का बना extruded ग्राफ्ट प्रत्यारोपित, और polyurethane 27-29 गए। इन सामग्रियों में से कोई भी एसीएल 7 के यांत्रिक गुणों के भ्रष्टाचार और आवृत्ति के सफल एकीकरण दोनों में हुई। कई पॉलिमर बंधन पुनर्निर्माण में इस्तेमाल के लिए क्षमता है जबकि यह गैर विषैले, जैविक रूप से निष्क्रिय है, क्योंकि इस अध्ययन PCL जांच की, विवो में धीरे-धीरे degrades, और आसानी से एक वांछित रचना 30 में निर्मित है। PCL भी यंत्रवत् मजबूत है और यांत्रिक तनाव 30 के तहत छोटे प्लास्टिक विरूपण से पता चलता है। 31 electrospun जब इसके प्रयोग की वजह से उसके गठबंधन nanofiber संरचना करने के लिए खनिज और मैं बयान कोलेजन टाइप के लिए एक विश्वसनीय जलाशय के रूप में अस्थि ऊतक इंजीनियरिंग साहित्य में स्थापित किया गया है। इसके अलावा, यह electrospun PCL मैट में छोटे व्यास फाइबर की मात्रा और कम प्रसार लंबाई पैमाने पर करने के लिए उच्च सतह नियंत्रित दवा वितरण के लिए अनुकूल हैं और ऊतक इंजीनियरिंग में 31 में उपयोग करने वाले दिखाया गया है।

ऐसा पाया गया किप्रत्यारोपित ग्राफ्ट नैदानिक ​​प्रतिकूल प्रतिक्रिया की कमी के आधार पर biocompatible थे, और बाद operatively 16 सप्ताह में histologically देखा के रूप में देशी सेल घुसपैठ में मदद की। यह अंत में भ्रष्टाचार के साथ प्रत्यारोपित मानव कोशिकाओं का उपयोग करेगा कि एक दो चरण परियोजना का पहला चरण है, और एक athymic मॉडल मानव कोशिकाओं की अस्वीकृति के बारे में चिंताओं को कम करेगा के रूप में हम इस अध्ययन में एक athymic पशु मॉडल का उपयोग किया। electrospun बहुलक पाड़ पुनर्जीवित एसीएल में दोनों सेल और मैट्रिक्स संरेखण में मदद की। भ्रष्टाचार के पार अनुभाग में देखा, कोशिकाओं के बहुमत के तंतुओं की दिशा में गठबंधन किया गया। प्रत्यारोपित ग्राफ्ट समय के साथ यांत्रिक गुणों में वृद्धि हुई है दिखाया। तुरंत postoperatively खंगाला एसीएल की तुलना में दोगुनी बहुलक ग्राफ्ट की विफलता के लिए लोड करें। देशी एसीएल की तुलना में कम लग सकता है PCL के भ्रष्टाचार की पीक लोड और कठोरता है, यह इन परिणामों च की रोशनी में देखा जाना चाहिए कि याद रखना महत्वपूर्ण हैकि यहां तक ​​कि वर्तमान सोने के मानक, autografts या allografts कार्य है, postoperatively के 16 सप्ताह से स्वस्थ एसीएल के यांत्रिक शक्ति प्राप्त करने में सक्षम नहीं हैं। उदाहरण के लिए, जू एट अल। पीक लोड 20% -35% थी और कठोरता में जो एक खरगोश मॉडल में एक एसीएल autograft, पर रिपोर्ट 23% 6 महीने postoperatively के 32 से स्वस्थ देशी एसीएल के उस -36% थी। इसके अतिरिक्त, एक कुत्ते मॉडल में एक allograft अध्ययन 30 हफ्तों postoperatively के 33 से लगभग 30% पीक लोड और 40% देशी एसीएल की कठोरता का प्रदर्शन किया।

यह इस पत्र के दायरे से बाहर है, जबकि कई अन्य विश्लेषण इस पशु मॉडल का उपयोग करने के बाद भ्रष्टाचार गुणवत्ता का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है। यह भी शामिल है, लेकिन bioluminescent इमेजिंग या एक्स-रे और vivo में सीटी स्कैन, और जैसे कोलेजन मार्करों या भड़काऊ मार्करों के लिए immunohistochemistry के रूप में दाग और assays के एक भीड़ के लिए सीमित नहीं है। उदाहरण के लिए, हम पहले से निरपेक्ष सह की मात्रा का ठहराव पर परिणाम प्रकाशितइस पशु मॉडल 26 में प्रत्यारोपित electrospun PCL scaffolds के आरोपण के बाद picrosirius लाल धुंधला का उपयोग llagen फाइबर।

इस अध्ययन के संभावित सीमाएं पशु मॉडल खुद की पसंद में शामिल हैं। द्विपाद मनुष्यों की तुलना में चौपाया चूहे में शरीर रचना विज्ञान और चाल में निहित मतभेद एसीएल के बायोमैकेनिक्स भिन्न है और मॉडलों के बीच नैदानिक ​​मापदंडों के उस अनुवाद इन सीमाओं के ज्ञान के साथ किया जाना चाहिए कि मतलब है। हालांकि, इस मुद्दे पर जानवरों के अध्ययन में आम है और इस शोध के महत्व या translational को संभावित नकारना नहीं है।

भविष्य में इंजीनियर एसीएल प्रतिस्थापन के लिए हमारे मॉडल को लागू किया जा सकता है कि autograft का उपयोग कर चूहा एसीएल पुनर्निर्माण के लिए पोस्ट ऑपरेटिव प्रोटोकॉल पर दिलचस्प शोध किया गया है। बाहरी निर्धारण उपकरणों एक कण्डरा autograft मॉडल में सुधार कण्डरा की हड्डी चिकित्सा की अनुमति देने के क्रम में बाद operatively चूहों को स्थिर करने के लिए इस्तेमाल किया गया है19। इसके अतिरिक्त, यह ऐसी Stasiak एट अल। 34 से वर्णित बल-विस्तार डिवाइस के साथ के रूप में, चक्रीय लोड हो रहा है देरी दिखाया गया है कि, आगे autograft समावेश 20 बढ़ाने सकता है। हालांकि, यह भी कम अवधि कम परिमाण चक्रीय लोड हो रहा है में भी वृद्धि हुई सूजन का कारण है और अस्थि-कण्डरा इंटरफ़ेस 35 में हड्डी गठन कमी आई सकता है कि दिखाया गया है। आगे की जांच पड़ताल में इस तरह के एक भ्रष्टाचार के एक कण्डरा allograft की तुलना में कमजोर प्रारंभिक यांत्रिक गुणों होता है, एक electrospun, बहुलक आधारित एसीएल प्रतिस्थापन के लिए इन निष्कर्षों की प्रयोज्यता का मूल्यांकन करने के लिए आयोजित किया जाना चाहिए।

वर्तमान अध्ययन, एक athymic चूहे में एक अकोशिकीय electrospun भ्रष्टाचार के साथ एसीएल पुनर्निर्माण का एक मॉडल विकसित एक पहले से वर्णित चूहा autograft मॉडल 17-22 के संशोधनों के आधार पर बंद कर दिया है। हम विफलता के लिए लोड की एक समवर्ती सुधार के साथ भ्रष्टाचार के दौरान घने गठबंधन कोलेजन के विस्तार का प्रदर्शनसमय के साथ भ्रष्टाचार के। इस अध्ययन में यह भी एसीएल पुनर्निर्माण के लिए विभिन्न ऊतक इंजीनियर ग्राफ्ट का मूल्यांकन करने के लिए भविष्य में इस मॉडल को रोजगार के लिए अवधारणा का सबूत प्रदान करता है। विशेष रूप से, athymic चूहे xenogeneic दाता कोशिकाओं के बोने के लिए अनुमति देता है।

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Acknowledgments

लेखकों के लिए इस परियोजना के पहले पुनरावृत्तियों को उनके तकनीकी योगदान के लिए गेब्रियल Arom और माइकल Yeranosian को धन्यवाद देना चाहूंगा। इस परियोजना OREF Clinician वैज्ञानिक प्रशिक्षण अनुदान (एनएल) द्वारा वित्त पोषित किया गया था, एचएच ली सर्जिकल रिसर्च ग्रांट (एनएल), दिग्गजों प्रशासन BLR एवं विकास मेरिट की समीक्षा एक I01 BX00012601 (डीएम) और Musculoskeletal ट्रांसप्लांटेशन फाउंडेशन युवा अन्वेषक पुरस्कार (एफपी)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Medical grade ester terminated poly (ε-caprolactone), granule form (MW = 110,000) Lactel Absorbable Polymers Custom synthesized polymer to desired molecular weight
1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol Sigma-Aldrich 105228 Solvent for PCL polymer
18 G x 1½" bevel needle BD Medical 305196
Remote Infuse/Withdraw Programmable Syringe Pump Harvard Apparatus 702101
VersaLaser VLS2.30 Laser Engraver Microgeo USA VLS2.30
Expanded Plasma Cleaner 115 V Harrick Plasma PDC-001 Plasma etch just prior to collagen coating for surface modification
PureCol Collagen Standard Solution, 3 mg/ml Advanced Biomatrix 5015-A Mix 8:1:2.5 solution of PureCol, 10x PBS, 0.1 N NaOH 1:9 in 1x PBS
Suture, 5-0 Vicryl Henry Schein 1086471
Suture, 4-0 Vicryl Henry Schein 6540072
Sharp-pointed Dissecting Scissors (Straight; 4.5 inch) Fisher Scientific 8940
Buphrenorphine hydrochloride Sigma-Aldrich B9275 Use 0.03 mg/kg for both intra- and post-operatively for pain control
Ampicillin, injectable Henry Schein 1185678 Use 25 mg/kg subcutaneously during the procedure
K-wire, 1.6 mm Spectrum Surgical SI040062
Keith Needle, Straight 1½" Delasco Dermatology Lab & Supply KE-112
Immunocal Decalcifying Solution Fisher Scientific NC9491030
Opticryl Acrylic Resin Bone Cement (PMMA) (Monomer and polymer) US Dental Depot OPTICRYL 100410 
Instron Model 5564 Tensile Testing Machine Instron 5564 Any comparable tensile testing apparatus is suitable

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References

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बायोइन्जिनियरिंग अंक 97 पूर्वकाल cruciate बंधन ऊतक इंजीनियरिंग पशु मॉडल biodegradable चबूतरा चूहे घुटने
इंजीनियर पूर्वकाल cruciate बंधन grafts के मूल्यांकन के लिए Athymic चूहे मॉडल
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Leong, N. L., Kabir, N., Arshi, A.,… More

Leong, N. L., Kabir, N., Arshi, A., Nazemi, A., Wu, B. M., McAllister, D. R., Petrigliano, F. A. Athymic Rat Model for Evaluation of Engineered Anterior Cruciate Ligament Grafts. J. Vis. Exp. (97), e52797, doi:10.3791/52797 (2015).

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