Introduction
La rotura del ligamento cruzado anterior (LCA) es una de las más comunes las lesiones de ligamentos de la rodilla 1. Debido a la rotura de ligamento cruzado anterior de es incapaz de curar sin intervención quirúrgica, las limitaciones en las actividades de la vida diaria, así como la participación en deportes en coche más de 175.000 pacientes a someterse a cirugía cada año 2, con un costo estimado de mil millones de dólares al año 3. En la actualidad, ya sea autoinjerto o aloinjerto de tendón se utiliza para la reconstrucción del ligamento. Aunque altas tasas de éxito se puede lograr tanto con autoinjerto y aloinjerto de reemplazo, las complicaciones graves se asocian con estas opciones de reconstrucción 4. Tejido autoinjerto se asocia con morbilidad del sitio donante y se limita la oferta, sobre todo en casos de re-ruptura o lesiones múltiples ligamentosa. Por otro lado, el tejido de aloinjerto está vinculado con la integración retardada del injerto, la respuesta inflamatoria adversa, el riesgo infeccioso teórico, y supl limitadaly 5. Injertos no degradables sintéticos fueron desarrollados en los años 1970 y 1980, pero se vieron obstaculizados por la ruptura prematura del injerto, reacción de cuerpo extraño, osteolisis, y sinovitis 6. Como resultado de estas graves preocupaciones, actualmente no hay injertos sintéticos disponibles para uso clínico en los Estados Unidos.
Debido a estas limitaciones con opciones de injerto existentes y a la evolución reciente de la biología, la ingeniería y la medicina regenerativa, ha habido un gran interés en una solución de ingeniería de tejidos para ACL injerto. Las estrategias de ingeniería de tejidos actuales emplean materiales biológicos y sintéticos degradables para permitir el crecimiento de tejido anfitrión evitando al mismo tiempo las limitaciones asociadas con la implantación de material sintético permanente 7.
La policaprolactona (PCL) es un polímero biodegradable que es aprobado por la FDA para un número de aplicaciones médicas, incluyendo barrera de adhesión y un vendaje de heridas 8, que ha sido used en una amplia variedad de aplicaciones, incluyendo vascular, hueso, cartílago, nervios, piel, y la ingeniería de tejido esofágico 5,9-16. Biocompatibilidad favorable, relativamente larga in vivo la vida media, una resistencia mecánica adecuada, alta elasticidad y contribuyen a la popularidad de este polímero en la ingeniería de tejidos. En un modelo de roedor de la cicatrización de heridas, implantado PCL electrospun ha demostrado ser no inmunogénica y de integrarse en el tejido local sin reacciones adversas 13. Una imagen SEM de electrospun PCL se muestra en la Figura 1.
Con actual de la FDA reguladora normas, la eficacia y la seguridad tanto en modelos animales pequeños y grandes que se requeriría para un PCL o cualquier otro injerto de LCA diseñado para moverse en ensayos clínicos en los Estados Unidos. Además, las condiciones in vivo a menudo pueden aumentar las propiedades de un injerto de tejido in vitro de ingeniería. Un modelo de rata de la reconstrucción del LCA autólogo con digitor flexorum tendón del se ha descrito anteriormente, en el que se rompió el ligamento cruzado anterior nativa, femoral y tibial túneles fueron perforados, y el injerto fue aprobada y se fija mediante sutura 17-22. En este artículo, vamos a describir una modificación de este modelo para la evaluación de los reemplazos de ACL ingeniería en lugar de para la reconstrucción a base de autoinjerto (Figura 2).
Aunque existen muchos modelos animales para la ingeniería de tejido del ligamento, la rata es ventajoso en comparación con los modelos más grandes para un número de razones. Estas ventajas incluyen la cría y manejo más fácil, menos consideraciones éticas, y la reducción de 17,23 costo. Además, el modelo de rata se ha usado extensivamente como un modelo para la regeneración de tejido ortopédico, incluyendo el cartílago, tendón, y la ingeniería de tejido óseo 24. En particular, las ratas desnudos atímicos se eligieron debido a su falta de respuesta inmune mediada por células 25, permitiendo la implantación eventual of células del donante xenogeneicos en este modelo para mejorar aún más el injerto de ingeniería en el futuro. En este documento métodos, se describe la fabricación y la implantación quirúrgica de un acelular, injerto de polímero biodegradable en un modelo de rata atímicos de reconstrucción del LCA.
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Protocol
NOTA: Todas las cirugías animales fueron aprobadas por el personal y animal veterinaria comité uso local antes de comenzar los experimentos.
1. Preparación de electrohiladas policaprolactona Andamios
- Pesar y disolver éster de grado médico terminado poli (ε-caprolactona) en forma de gránulos en 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol para crear un 10% w / w solución del polímero PCL. Deje que el revuelo solución utilizando una placa de agitación durante al menos 3 horas para asegurar una solución homogénea.
- Electrospin la solución PCL para crear un brazalete de fibras PCL altamente alineados para la fabricación de andamios.
- Preparar la instalación electrospinning en una campana de extracción química con el ventilador encendido en todo momento. Este consiste en una caja de acrílico grande que servirá como un medio de vacío aislado para el proceso de electrospinning y tiene puntos de entrada para la solución de fuente PCL impulsado por una fuente de tensión, el mandril recogiendo accionado por motor, y un puerto de vacío. Limpie el Acrylicaja de c a fondo con etanol y cubre todas las superficies con hojas de Parafilm para eliminar las impurezas que puedan comprometer la calidad del producto electrospun.
- Cargar aproximadamente 3 ml de la solución anterior en una jeringa de 10 ml con un objeto contundente terminaron 18 G, la aguja 1 ½ pulgadas. Quite las burbujas de aire empujando la jeringa hacia arriba. Solución de bloqueo en una bomba de inyección programable. Insertar la aguja a través de un pequeño agujero en la caja de acrílico, dejando alrededor de ½ pulgada de la aguja fuera de la caja de acrílico para la fijación del cable de la fuente de tensión.
- Use un 30 mm girando mandril del torno como el colector para las fibras PCL altamente alineados; cubrir el mandril firmemente con una tira delgada de papel de aluminio. Bloquear el mandril en el motor en el lado opuesto de la caja de unos 15 cm de distancia de la aguja de la jeringa.
- Inserte la manguera de plástico en el puerto de vacío y conectarse a la fuente de vacío campana de humos. Encienda la fuente de vacío y para abarcar la caja de acrílico con una tapa.
- Set la velocidad de infusión de la bomba de jeringa programable a 2,5 ml / hr. Encienda el motor para operar en el mandril a 3.450 rpm y conecte el cable positivo de la fuente de tensión a la punta de la aguja fuera de la caja con una pinza.
- Una vez que la infusión de la solución PCL ha comenzado, encienda la fuente de tensión y establecer a una tensión de servicio de 20 kV.
- Infundir la solución durante 12 minutos para crear un manguito homogénea de 0,5 ml de la solución de PCL.
NOTA: En promedio, cada manguito tiene suficiente material de electrospun para crear dos hojas de seis tiras, que pueden ser utilizados para crear un total de tres andamios de cuatro capas.
- Láser cortar el manguito PCL para formar múltiples pequeñas hojas en un VersaLaser Cortador 2.3 operada en el ajuste bajo vacío, el voltaje de aterrizaje 10,0 keV, distancia de trabajo 6,4 mm, y el diámetro de la sonda de 3,0.
NOTA: En este ejemplo, un diseño asistido por ordenador se utiliza para instruir a la cuchilla para producir varias hojas de 1,5 mm x 35 mm x 150 micras con andamiosdistribuido uniformemente 150 micras de diámetro en un 15% el área de poro. - Plasma etch los andamios PCL utilizando un limpiador de plasma para inducir la hidrofilia de la superficie PCL con aceleración de iones. Ajuste el vacío a 450 Pa y la delicia de los andamios durante 30 segundos a alta potencia (29,6 W).
- Bañar los andamios en etanol al 70% en un ambiente estéril.
- Escudo los andamios individuales con colágeno para facilitar la adhesión y proliferación celular in vivo.
- Crear una solución de recubrimiento de colágeno mediante la dilución de un 8: solución estéril de 2,5 Purecol colágeno 3 mg / ml de solución patrón, 10x PBS y 0,1 N NaOH 1:: 1 9 en 1X PBS a 4 ° C. Mezclar bien para asegurar la homogeneidad solución.
- Escudo individuo 1,5 mm x 35 mm x 150 micras andamios con una película fina capa de la solución de colágeno anteriormente. Deje secar durante 24 horas en un ambiente estéril.
- El uso de suturas de Vicryl 5-0, apilar y colocar cuatro individuo 1,5 mm x 35 mm x 150 micras andamiosutilizando un Krackow puntada para crear un final 0,6 mm de espesor de capas múltiples, andamios, revestida de colágeno que está listo para su implantación.
2. Protocolo de Cirugía de la rata
- Inducir la anestesia mediante la colocación de la rata en la cámara de inhalación y la entrega de 2% de isoflurano con 2 L / min de oxígeno. Confirmar la rata se anestesia adecuada por aplicación de presión a las patas traseras y la evaluación de cualquier respuesta.
- Sobre la mesa de vuelta no estériles, por vía subcutánea inyectar 25 mg / kg de ampicilina y 0,03 mg / kg de buprenorfina.
- Aplique un ungüento oftálmico para los ojos. Clip de la piel de la extremidad posterior operativa y preparar la zona quirúrgica con tres matorrales alternas de clorhexidina y etanol al 70%.
- Traslado a la rata a la mesa de operaciones, en un cojín con calefacción para evitar la hipotermia. Secure nariz cono, y mantener la anestesia a través del procedimiento con un 2% de isoflurano en 2 l / min de oxígeno, cono de la nariz entregado. Coloque de una manera estéril, dejando la extremidad operativa expuesta.
- Hacer un 2 cm de largo medial incisión vertical a la rodilla, centrado en el nivel de la rótula. Retraer la piel lateralmente hasta que la incisión se centra sobre la rodilla.
- Utilice un bisturí para realizar una artrotomía parapatelar medial cortando justo medial a la rótula y que se extiende proximalmente hasta el nivel de la unión musculotendinosa de los cuádriceps y distalmente al nivel de la inserción del tendón rotuliano en el tubérculo tibial. Tenga cuidado de no cortar los rotulianos o cuádriceps tendones.
- Rótula Release lateralmente haciendo una incisión vertical de 1 cm a través de la cápsula de la rodilla justo lateral al tendón patelar.
- Asegúrese de que la rodilla está extendida. Tome un par de tijeras finas y pasar por debajo de la rótula de lateral a medial. Difundir las tijeras un par de veces para que el mecanismo extensor se puede traducir a cualquier lado.
- Mientras flexionando tél la rodilla, traducir la rótula lateralmente para exponer el interior de la articulación de la rodilla. Asegurar una visualización clara de la escotadura intercondílea y cóndilos femorales. El uso de un bisturí, seccionar la ACL y PCL en la muesca.
- Taladro eléctrico de carga con un alambre de Kirschner de 1,6 mm. Coloque la punta de Kirschner en el origen del LCA en la escotadura intercondílea. Perforar superolateralmente y visualizar el punto de salida en la cara lateral del fémur, la eliminación de cualquier tejido suave como sea necesario con un bisturí. Pase el alambre de Kirschner y salir un par de veces para asegurarse de paso libre para el injerto.
- Coloque el alambre de Kirschner en la huella de ACL en la meseta tibial. Perforar anterolateralmente y visualizar punto de salida en la tibia proximal anterolateral. Utilice bisturí para limpiar el tejido blando como sea necesario para que el punto donde el k-alambre sale de la tibia está totalmente visualizada.
- Pasar una aguja Keith acortada (idealmente no más de 2 pulgadas de largo) a través del túnel del hueso femoral. Pase los dos extremos de la sutura de un extremo del injerto a través del ojo de la Kaguja eith. Utilice la aguja para tirar de un extremo del injerto a través del túnel femoral.
- Repita el paso antes de pasar el otro extremo del injerto a través del túnel tibial.
- Utilice 4-0 Vicryl sutura para fijar el extremo femoral del injerto al que rodea periostio u otro tejido blando con una puntada figura en forma de ocho. Manual de la tensión del injerto con la rodilla en extensión. Asegurar el extremo tibial del injerto al que rodea periostio u otro tejido blando con una puntada figura en forma de ocho.
- Utilice una tijera para cortar el exceso de injerto en ambos extremos, dejando 1-2 mm en cada extremo pasado la puntada figura en forma de ocho.
- Extender la rodilla y reducir la rótula. Utilizando 4-0 vicryl, coloque una sola puntada figura en forma de ocho para cerrar la cápsula articular medial, evitando subluxación lateral de la rótula.
- Cierre la piel con una subcuticular 5-0 Monocryl o Vicryl sutura continua, con cuidado de no suturar el músculo subyacente o tiene cualquier sutura visible una vez que la piel se cierra.
- Inject ratas por vía subcutánea con buprenorfina cada 12 hr para un total de tres días después de la operación. Visite el sitio quirúrgico para cualquier secreción o dehiscencia de la herida en el momento de la inyección. Cojeando y un poco de hinchazón son normales en los primeros días después de la cirugía, pero prontamente abordar cualquier preocupación postoperatorias en conjunto con el personal veterinario. El animal puede ser de vuelta a la vivienda social a las 2 semanas después de la operación, cuando las incisiones quirúrgicas hayan desaparecido por completo.
3. Protocolo de Recolección de Datos
- En el momento del sacrificio, asfixiar ratas individualmente en una cámara cerrada CO 2 seguido por toracotomía.
- Cosecha tanto las extremidades reconstruidas quirúrgicamente y contralateral separando en la articulación de la cadera.
- Para las extremidades reconstruidas, eliminar todo el tejido blando, incluyendo el ligamento cruzado posterior y los restos de la ACL nativo alterado quirúrgicamente, mediante disección fina para aislar sólo el fémur, la tibia, y el injerto. <li> En las extremidades contralaterales, eliminar todo el tejido blando, excepto la ACL nativo, así como el fémur y la tibia por la disección fina.
- Utilice una herramienta rotativa, tales como Dremel, para eliminar todo pero ¾ a 1 cm de hueso de cada extremo del complejo fémur-injerto tibia.
- Durante este proceso ya lo largo de las pruebas biomecánicas, con regularidad y frecuencia rocíe las regiones ligamentosas con solución salina normal para evitar la desecación de la rodilla cosechado que pueden alterar los resultados falsamente.
- Asegurar el fémur y la tibia envolviendo 28 G alambre de acero galvanizado alrededor de la epífisis de cada hueso separado. Esto es para evitar que los datos de pruebas biomecánicas inexactas de fallo prematuro de la tracción de la muestra en el hueso en lugar de en el ligamento de interés.
- Pot el fémur en una mezcla de cemento de polimetilmetacrilato (PMMA) de hueso. Para ello, mezclar los dos componentes del cemento y utilizar inmediatamente la mezcla viscosa para asegurar el fémur en el metal, que encierra completamente la diáfisis del hueso en la olla cementada con la epífisis y el ligamento adjunto que sobresale libremente. Permitir la polimerización de radicales libres espontánea para transformar gradualmente los componentes viscosos mixtos a un material pastoso y, finalmente, en una matriz endurecida sólido.
NOTA: Este proceso tarda varios minutos y se puede controlar manualmente mediante la evaluación de la temperatura de un bolo a partir deel cemento restante; la temperatura debe aumentar transitoriamente durante la reacción de polimerización exotérmica y disminuir a RT después el material se solidifica. - Repita el mismo proceso anterior para cementar la tibia, excepto la vez que mantiene el ligamento de la rodilla en 20 ° de flexión para la prueba mecánica ideal.
- Montar el complejo fémur-injerto tibia cementado en un aparato de ensayo de tracción, y preparar a la carga de registro y el desplazamiento como una función de tiempo desde el comienzo de la tensión al fracaso. En este ejemplo, se utilizó un modelo Instron 5564 con una célula de carga de 1 kN.
- Pre-tensión del injerto a 2 N a una velocidad de rampa de 0,5 N / min y luego probar el injerto al fracaso a una velocidad de deformación de 0,5 mm / seg. Durante el proceso, asegúrese de que el ligamento está fallando en la mitad de la sustancia y que el fémur y la tibia ósea son seguras y no prematuramente en su defecto, que puede evaluar de manera inexacta propiedades biomecánicas del ligamento probado.
- Utilice el desplazamiento de carga generadacurvas para calcular la carga de rotura y la rigidez del ligamento probado.
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Representative Results
En nuestra experiencia de 92 cirugías de rata por un solo cirujano, el tiempo medio operatorio desde la incisión hasta la finalización de la herida fue de 16,9 min, con una desviación estándar de 4,7 min. En el momento del sacrificio, ratas pesaban 356 ± 23 g. Todas las ratas toleraron la cirugía bien, y no experimentaron complicaciones. Inmediatamente después de la cirugía, se observaron las ratas para soportar el peso sobre la extremidad operativa, pero mostraron una leve cojera. Una semana después de la operación, todas las ratas se deambular sin cojera apreciable. Todos los animales ganaron peso de forma constante durante el curso del estudio, sin anomalías observadas en los hábitos de alimentación, la micción o defecación. Clínicamente, sin dehiscencia de herida grave, eritema, inflamación, derrame o drenaje se observó después de la operación.
Los 92 cirugías de rata mencionados anteriormente no se llevaron a cabo principalmente con el propósito de esta métodos manuscrito. Más bien, se utilizaron para probar varias condiciones Engineered injerto. Mientras que el detailed ensayos mecánicos y los resultados histológicos están fuera del alcance de este documento, más detalles se pueden encontrar en un documento por Leong et al. 26. En resumen, a las 16 semanas después de la reconstrucción, el análisis histológico de la rodilla seccionada demostró que la matriz de andamio convirtió en gran medida infiltrado por fibroblastos secretan colágeno eosinofílica con buena integración en los túneles del hueso (Figura 3). En este momento, el andamio ha sido completamente reabsorbido y no hay evidencia de que el polímero se visualizó. Además, la inmunohistoquímica para el marcador macrófago CD68 demostró respuesta inflamatoria mínima a las 16 semanas después de la operación (Figura 4).
Propiedades biomecánicas se evaluaron inmediatamente después del sacrificio. Todas las muestras analizadas fallaron en la mitad de la sustancia (Figura 5). El uso de curvas de carga-desplazamiento generados a partir de ensayos de tracción (Figura 6), carga de rotura y la rigidezse calcularon para cada grupo. A las 16 semanas después de la implantación, el injerto de polímeros electrospun tenía aproximadamente el doble de la carga máxima y la rigidez del injerto a prueba inmediatamente después de la implantación, pero estos valores fueron inferiores a la ACL nativa 26.
Figura 1. Imagen SEM de andamio policaprolactona electrospun con fibras alineadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. modelo de rata atímicos de reconstrucción del LCA. (A) Aislamiento del tendón rotuliano a través de una incisión en la piel pararrotuliana medial. (B) La perforación de tunne femorall utilizando 1,6 mm alambre de Kirschner. (C) La perforación del túnel tibial. (D) La colocación de 1,2 mm Keith aguja a través del túnel femoral para tirar de injerto a través. (E) Electrospun policaprolactona injerto tira a través del túnel femoral. (F) Injerto tira a través de dos túneles femoral y tibial, antes de que los extremos se recortan y se suturan al periostio, y un cierre por planos se realiza. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Hematoxilina y eosina de injerto de polímero electrospun (arriba) al túnel del hueso tibial (izquierda), sustancia media (centro), y el túnel del hueso femoral (derecha). A modo de comparación, se muestra ACL nativo (abajo), con la inserción tibial ( izquierda), sustancia media (center) y origen femoral (derecha), 10 veces. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. tinción inmunohistoquímica colorimétrico para CD68, un marcador de macrófagos. Cualitativamente, no parece ser ligeramente más tinción positiva en el túnel del hueso a las 8 semanas que en la región intra-articular de la prótesis o a las 16 semanas post-op. Parece que hay inflamación mínima en los injertos. Todas las imágenes son 20X. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Imágenes de ensayos mecánicos de injerto implantado electrospun, lo que demuestra el fracaso en sustancia media del injerto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. Ejemplo de curva de carga-desplazamiento para ingeniería de tejidos ACL injerto a las 16 semanas después de la implantación en el modelo de rata sin timo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Las lesiones del LCA son una condición común en la cirugía ortopédica deportes, con opciones limitadas para la reconstrucción en la actualidad. A fin de desarrollar un sustituto de tejido de ingeniería apropiado para la ACL que permitirá la regeneración in vivo, se requiere un modelo animal adecuado. En este estudio, la fabricación de un injerto de ingeniería biodegradable se describe, como es su implantación in vivo utilizando un modelo reproducible de la reconstrucción del LCA en una rata atímicos. Este modelo puede ser utilizado para evaluar diferentes injertos de ACL ingeniería tisular compuestas de diversos biomateriales, incluyendo injertos celulares y aquellos con factores de crecimiento Incorporated.
En este estudio en particular, hemos probado una acelular, injerto policaprolactona electrospun con fibras alineadas. Los estudios previos de ingeniería tisular reconstrucción de ligamento han implantado trenzado o injertos extruidos hechos de una variedad de materiales, incluyendo seda, PLLA, y poliuretano 27-29. Ninguno de estos materiales resultó en tanto la integración con éxito del injerto y recapitulación de las propiedades mecánicas de ACL 7. Mientras que muchos polímeros tienen el potencial para su uso en la reconstrucción del ligamento, este estudio investigó PCL, ya que es biológicamente inerte, no tóxico, se degrada lentamente in vivo, y se fabrica fácilmente en una conformación deseada 30. PCL también es mecánicamente robusto y muestra poca deformación plástica bajo estrés mecánico 30. Su uso ha sido establecido en la literatura ingeniería de tejido óseo como un depósito fiable para la mineralización y la deposición de colágeno de tipo I debido a su estructura de nanofibras alineados cuando electrospun 31. Además, se ha demostrado que la alta superficie a volumen y la escala de longitud de difusión corta de las fibras de pequeño diámetro en esteras PCL electrospun son favorables para la entrega controlada de fármacos y el uso en la ingeniería de tejidos 31.
Se encontró quelos injertos implantados estaban biocompatible basado en una falta de reacción adversa clínica, y facilitar la infiltración de células nativa como se ve histológicamente a las 16 semanas después de la operación. Hemos utilizado un modelo animal atímicos en este estudio, ya que es la primera etapa de un proyecto de dos etapas que eventualmente utilizar células humanas implantadas con el injerto, y un modelo de atímicos sería reducir las preocupaciones respecto del rechazo de las células humanas. La estructura de polímeros electrospun facilitó tanto la alineación de células y la matriz en la LCA regenerado. Como se ve en la sección transversal del injerto, la mayoría de las células se alinea en la dirección de las fibras. Los injertos implantados mostraron un aumento de las propiedades mecánicas en el tiempo. Cargar al fracaso de los injertos de polímero se duplicó en comparación con el ACL reconstruido inmediatamente después de la operación. Si bien la carga máxima y la rigidez del injerto PCL puede parecer bajo en comparación con ACL nativo, es importante recordar que estos resultados deben considerarse a la luz de la facto que incluso el actual estándar de oro, autoinjertos o aloinjertos, no son capaces de alcanzar la resistencia mecánica de ACL saludable a las 16 semanas después de la operación. Por ejemplo, Xu et al. Informaron sobre un autoinjerto ACL en un modelo de conejo, en los que la carga pico fue de 20% -35% y la rigidez fue de 23% -36% de la de ACL nativo saludable a los 6 meses después de la operación 32. Además, un estudio de aloinjerto en un modelo canino demostró aproximadamente 30% de la carga pico y el 40% de la rigidez de ACL nativo por 30 semanas después de la operación 33.
Si bien es fuera del alcance de este documento, muchos otros análisis se pueden realizar para evaluar la calidad del injerto después de su uso de este modelo animal. Esto incluye pero no se limita a bioluminiscente de imágenes o los rayos X y las exploraciones de TC en vivo, y una multitud de manchas y ensayos tales como inmunohistoquímica para marcadores de colágeno o marcadores inflamatorios. Por ejemplo, hemos publicado previamente resultados en la cuantificación de co Alineadosfibras llagen utilizando tinción con rojo picrosirius después de la implantación de los andamios PCL electrospun implantados en este modelo animal 26.
Las limitaciones potenciales de este estudio incluyen la elección del modelo animal en sí. Las diferencias inherentes en la anatomía y la marcha en la rata quadrupedal comparación con los humanos bípedos significan que la biomecánica de la ACL varían y que la traducción de parámetros clínicos entre los modelos se debe hacer con el conocimiento de estas limitaciones. Sin embargo, este problema es común en estudios en animales y no niega la importancia o potencial de la traducción de esta investigación.
No ha habido una investigación interesante en protocolos post-operatorias para la reconstrucción del LCA rata utilizando autoinjerto que se puede aplicar a nuestro modelo para los reemplazos de ACL ingeniería en el futuro. Dispositivos de fijación externa se han utilizado para inmovilizar las ratas después de la operación a fin de permitir la mejora de la curación del tendón-hueso en un modelo de autoinjerto del tendón19 Además, se ha demostrado que retrasa la carga cíclica, tal como con el dispositivo de flexión-extensión descrito por Stasiak et al., 34., Puede mejorar aún más la incorporación autoinjerto 20. Sin embargo, también se ha demostrado que la carga cíclica de baja magnitud corta duración también puede causar aumento de la inflamación y la disminución de la formación de hueso en la interfaz hueso-tendón 35. Más investigación debe llevarse a cabo para evaluar la aplicabilidad de estos resultados a un electrospun, reemplazo ACL basado en polímero, como un injerto de este tipo tendría propiedades mecánicas iniciales más débiles que un aloinjerto de tendón.
El presente estudio ha desarrollado un modelo de reconstrucción del LCA con un injerto electrospun acelular en una rata sin timo, con sede fuera modificaciones de un modelo de autoinjerto rata descrito previamente 17-22. Hemos demostrado la elaboración de colágeno denso alineado a lo largo del injerto con una mejora simultánea de la carga al fracasodel injerto con el tiempo. Este estudio también proporciona una prueba de concepto para el empleo de este modelo en el futuro para evaluar varios injertos de ingeniería tisular para la reconstrucción del LCA. En particular, la rata atímicos permite la siembra de células de donante xenogeneico.
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Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Gabriel Arom y Michael Yeranosian por sus contribuciones técnicas a las iteraciones anteriores de este proyecto. Este proyecto fue financiado por el OREF Clínico Científico Training Grant (NL), HH Lee quirúrgica Beca de Investigación (NL), la Administración de Veteranos BLR + D Revisión Mérito 1 I01 BX00012601 (DM) y Musculoesqueléticas Trasplante Fundación Premio al Investigador Joven (FP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medical grade ester terminated poly (ε-caprolactone), granule form (MW = 110,000) |  Lactel Absorbable Polymers |
Custom synthesized polymer to desired molecular weight | |
| 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol | Sigma-Aldrich | 105228 | Solvent for PCL polymer |
| 18 G x 1½" bevel needle | BD Medical | 305196 | |
| Remote Infuse/Withdraw Programmable Syringe Pump | Harvard Apparatus | 702101 | |
| VersaLaser VLS2.30 Laser Engraver | Microgeo USA | VLS2.30 | |
| Expanded Plasma Cleaner 115 V | Harrick Plasma | PDC-001 | Plasma etch just prior to collagen coating for surface modification |
| PureCol Collagen Standard Solution, 3 mg/ml | Advanced Biomatrix | 5015-A | Mix 8:1:2.5 solution of PureCol, 10x PBS, 0.1 N NaOH 1:9 in 1x PBS |
| Suture, 5-0 Vicryl | Henry Schein | 1086471 | |
| Suture, 4-0 Vicryl | Henry Schein | 6540072 | |
| Sharp-pointed Dissecting Scissors (Straight; 4.5 inch) | Fisher Scientific | 8940 | |
| Buphrenorphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | B9275 | Use 0.03 mg/kg for both intra- and post-operatively for pain control |
| Ampicillin, injectable | Henry Schein | 1185678 | Use 25 mg/kg subcutaneously during the procedure |
| K-wire, 1.6 mm | Spectrum Surgical | SI040062 | |
| Keith Needle, Straight 1½" | Delasco Dermatology Lab & Supply | KE-112 | |
| Immunocal Decalcifying Solution | Fisher Scientific | NC9491030 | |
| Opticryl Acrylic Resin Bone Cement (PMMA) (Monomer and polymer) | US Dental Depot | OPTICRYL 100410 | |
| Instron Model 5564 Tensile Testing Machine | Instron | 5564 | Any comparable tensile testing apparatus is suitable |
References
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