Introduction
Ruptur des vorderen Kreuzbandes (ACL) ist eine der häufigsten Verletzungen der Bänder des Knies 1. Da die gerissenen ACL nicht ohne chirurgischen Eingriff zu heilen ist, die Einschränkungen in Aktivitäten des täglichen Lebens, sowie die Teilnahme an Sport fahren mehr als 175.000 Patienten einer Operation unterziehen jedes Jahr 2, mit geschätzten Kosten von einer Milliarde Dollar jährlich 3. Derzeit wird entweder autologe oder Allograft-Sehne für Bandrekonstruktion verwendet. Obwohl hohe Erfolgsraten kann sowohl mit Autograft und Transplantatersatz erreicht werden, sind schwere Komplikationen mit diesen Wiederaufbau Optionen 4 verbunden. Autologe Gewebe mit Entnahmemorbidität assoziiert und ist im Lieferumfang beschränkt, vor allem in Fällen von Wieder Bruch oder Mehrbandverletzung. Auf der anderen Seite wird Allotransplantatgewebe mit verzögerter Transplantatintegration, schädliche Entzündungsreaktion, theoretische Infektionsrisiko und begrenzte supp verbundenly 5. Synthetische nicht abbaubaren Transplantate wurden in den 1970er und 1980er Jahren entwickelt wurden aber von vorzeitigen Bruch Transplantat, Fremdkörperreaktionen, Osteolyse und Synovitis 6 behindert. Als Ergebnis dieser ernsthaften Bedenken gibt es noch keine synthetische Transplantate für den klinischen Einsatz in den Vereinigten Staaten zur Verfügung.
Aufgrund dieser Einschränkungen mit bestehenden Transplantat-Optionen und die jüngsten Entwicklungen in der Biologie, Technik und regenerative Medizin, gab es ein großes Interesse an einer Tissue Engineering Lösung für ACL Pfropfen. Aktuelle Tissue-Engineering-Strategien beschäftigen abbaubaren biologischen und synthetischen Materialien, um für Host Einwachsen von Gewebe zu ermöglichen, während die Vermeidung der Einschränkungen mit Permanent Kunststoff Implantation 7 verbunden.
Polycaprolacton (PCL) ist ein biologisch abbaubares Polymer, das von der FDA für eine Reihe von medizinischen Anwendungen einschließlich Adhäsionsbarriere und Wundverband 8 ist, dass u gewesen istin einer Vielzahl von Anwendungen, einschließlich Gefäß, Knochen, Knorpel, Nerven, Haut, und Speiseröhrenkrebs Tissue Engineering 5,9-16 sed. Günstige Biokompatibilität relativ lange in-vivo-Halbwertszeit, eine ausreichende mechanische Festigkeit und hohe Elastizität tragen zur Popularität dieses Polymer in Tissue Engineering. In einem Nagetiermodell der Wundheilung wurde implantierten elektro PCL gezeigt, dass nicht-immunogen und in lokale Gewebe ohne Nebenwirkungen bei 13 zu integrieren. Ein SEM-Bild von elektro PCL ist in Abbildung 1 dargestellt.
Mit aktuellen FDA regulatorischen Standards, Wirksamkeit und Sicherheit in kleinen und großen Tiermodellen würde bei einer PCL oder andere technisch ACL Transplantat benötigt, um in klinischen Studien in den Vereinigten Staaten zu bewegen. Darüber hinaus können in vivo-Bedingungen oft erweitern die Eigenschaften eines in vitro Gewebezüchtung ACL Transplantat. Ein Rattenmodell der autologen ACL-Rekonstruktion mit Beuge digitorum longus wurde bereits beschrieben, in dem die Mutter ACL wurde abgetrennt, Oberschenkel- und Schienbein Tunnel wurden gebohrt, und das Transplantat wurde verabschiedet und an Ort und Stelle mit Naht 17-22 gesichert. In dieser Arbeit werden wir eine Änderung des Modells für die Auswertung von technischen ACL Ersetzungen nicht für Autograft-basierte Rekonstruktion (Abbildung 2) zu beschreiben.
Obwohl viele Tiermodelle für Bandgewebetechnik vorhanden sind, ist die Ratte vorteilhaft im Vergleich zu größeren Modelle für eine Reihe von Gründen. Zu diesen Vorteilen gehören einfacher Haltung und Handhabung, weniger ethische Überlegungen und reduzierte Kosten 17,23. Darüber hinaus ist die Ratten-Modell wurde umfangreich als ein Modell für orthopädische Geweberegeneration, einschließlich Knorpel, Sehnen und Knochengewebe 24 verwendet. Insbesondere wurden athymische Nacktratten aufgrund ihrer mangel der zellvermittelten Immunantwort 25 gewählt, so dass für die spätere Implantation of xenogenen Spenderzellen in diesem Modell zur weiteren Verbesserung der technisch Transplantat in der Zukunft. In diesem Verfahren Papier beschreiben wir die Herstellung und chirurgischen Implantation einer zellfreien, biologisch abbaubaren Polymer Transplantat in einer athymischen Rattenmodell der ACL-Rekonstruktion.
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Protocol
HINWEIS: Alle Tier Operationen wurden von der örtlichen Tierärzten und Tier Verwendung Ausschuss vor Beginn der Experimente zugelassen.
1. Vorbereitung von elektro Polycaprolacton Gerüste
- Einwiegen und lösen Grade Ester medizinischen Poly (ε-caprolacton) in Granulatform, in 1,1,1,3,3,3-Hexafluor-2-propanol, um eine 10% w erstellen / w Lösung des PCL-Polymer. Lassen Sie die Lösung für Aufsehen mit einer Rührplatte für mindestens 3 Stunden um eine homogene Lösung zu gewährleisten.
- Elektrospinnen den PCL-Lösung, um eine Manschette hoch ausgerichtet PCL-Fasern für Gerüstherstellung erstellen.
- Bereiten Sie das Elektrospinnen Setup in einem Laborabzug mit dem Lüfter auf zu allen Zeiten. Diese besteht aus einem großen Acryl-Box, die als isolierte Vakuum Medium für die Elektrospinnverfahren Einstiegspunkte für die Quelle PCL-Lösung durch eine Spannungsquelle, die motorgetriebene Sammeln Dorn und einem Vakuumanschluss angetrieben dienen und hat. Reinigen Sie die acrylic Kasten gründlich mit Ethanol und decken alle Oberflächen mit Parafilm Blätter, um Verunreinigungen, die die Qualität der elektro Produkts beeinträchtigen können, zu entfernen.
- Last ungefähr 3 ml der obigen Lösung in eine 10 ml-Spritze mit einer stumpfen Enden 18 G, 1 ½ inch Nadel. Entfernen Sie alle Luftblasen, indem Sie die Spritze auf. Schleusenlösung in eine programmierbare Spritzenpumpe. Führen Sie die Nadel durch ein kleines Loch in die Acryl-Box, während ca. ½ Zoll der Nadel außerhalb des Acryl-Box für die Befestigung der Spannungsquelle Draht.
- Verwenden Sie eine 30 mm-Drehmaschine Drehdorn als Kollektor für die hoch ausgerichtet PCL-Fasern; decken den Dorn fest mit einem dünnen Streifen aus Aluminiumfolie. Verriegeln des Dorns in den Motor auf der gegenüberliegenden Seite der Box, etwa 15 cm weg von der Injektionsnadel.
- Stecken Sie den Kunststoffschlauch in die Vakuumanschluss und eine Verbindung zum Abzug Vakuumquelle. Einschalten der Vakuumquelle und decken das Acryl-Box mit einem Deckel.
- Set die Infusionsrate der programmierbaren Spritzenpumpe auf 2,5 ml / hr. Schalten Sie den Motor, um den Dorn bei 3450 Umdrehungen pro Minute betrieben und bringen Sie den Pluspol der Spannungsquelle an der Nadelspitze außerhalb der Box mit einer Krokodilklemme.
- Nach Infusion der PCL-Lösung begonnen hat, schalten Sie die Spannungsquelle und zu einer 20 kV Betriebsspannung eingestellt.
- Die Infusion erfolgt die Lösung für 12 min, um eine homogene Manschette 0,5 ml der PCL-Lösung.
HINWEIS: Im Durchschnitt hat jeder Manschette genügend elektro Material zwei Sechsstreifen Blätter, die verwendet werden können, um insgesamt drei vierlagige Gerüste zu schaffen.
- Laser schneiden Sie die PCL-Manschette, mehrere kleine Blätter auf einem VersaLaser Cutter 2.3 bei niedrigem Vakuumeinstellung, 10,0 keV Landespannung, 6,4 mm Arbeitsabstand und Sondendurchmesser von 3,0 betrieben zu bilden.
HINWEIS: In diesem Beispiel wurde ein Computer Aided Design verwendet, um den Schneider anzuweisen, mehrere Blätter x 35 mm x 150 um Gerüste mit einer Ausbeute von 1,5 mmgleichmäßig verteilt 150 um Löcher mit einem Durchmesser von 15% Porenfläche. - Plasma ätzen die PCL Gerüste mit einem Plasma-Reiniger, um Hydrophilie der PCL-Oberfläche mit Ionenbeschleunigung zu induzieren. Stellen Sie das Vakuum auf 450 mTorr und dem Genuss die Gerüste für 30 Sekunden bei hoher Leistung (29,6 W).
- Bathe die Gerüste in 70% Ethanol in einer sterilen Umgebung.
- Bestreichen Sie die einzelnen Gerüste mit Kollagen, zelluläre Adhäsion und Proliferation in vivo zu erleichtern.
- Erstellung einer Kollagenbeschichtungslösung durch Verdünnen einer 8: 1: 2,5 sterile Lösung Purecol Kollagen 3 mg / ml Standardlösung, 10x PBS und 0,1 N NaOH 1: 9 in 1x PBS bei 4 ° C. Gründlich mischen, um Lösung Homogenität zu gewährleisten.
- Coat einzelnen 1,5 mm x 35 mm x 150 um Gerüste mit einer dünnen Folie aus dem obigen Kollagenlösung. Man lässt 24 h in einer sterilen Umgebung zu trocknen.
- Mit 5-0 Vicryl Nahtmaterial, stapeln und bringen vier Einzel 1,5 mm x 35 mm x 150 um Gerüstemit einem Krackow Stich, um eine endgültige Dicke von 0,6 mm, vielschichtig, mit Kollagen beschichteten Gerüst, das bereit für die Implantation zu schaffen.
2. Rat Chirurgie Protocol
- Anästhesie herbei indem Ratte in der Inhalationskammer und liefert 2% Isofluran mit 2 l / min Sauerstoff. Bestätigen Sie die Ratte ausreichend durch Druck auf Fuß hinter und Bewertung für jede Antwort betäubt.
- Auf der nicht-sterilen zurück Tabelle, subkutan injiziert 25 mg / kg Ampicillin und 0,03 mg / kg Buprenorphin.
- Bewerben Augensalbe für die Augen. Befestigen Sie den Pelz aus dem operativen Hinterbein und prep die Operationsstelle mit drei Wechsel Peelings von Chlorhexidin und 70% Ethanol.
- Übertragen Sie die Ratte auf dem OP-Tisch, auf einem Heizkissen zu Unterkühlung zu verhindern. Sichere Bugnase und Aufrechterhaltung einer Narkose durch das Verfahren mit 2% Isofluran in 2 l / min Sauerstoff, geliefert Nasenkegel. Abdecktuch steril, so dass die operative Glied ausgesetzt.
- Einen 2 cm langen vertikalen Einschnitt medial zum Knie, auf der Ebene der Patella zentriert. Ziehen Sie die Haut seitlich, bis der Schnitt über dem Knie zentriert.
- Verwenden Sie ein Skalpell, um einen medialen parapatellar Arthrotomie, indem nur der Patella medial und proximal zu dem Niveau der Muskelsehnenverbindung des Quadrizeps und distal zu der Ebene der Patellarsehnenansatzes auf dem Schienbein tubercule machen. Darauf achten, dass die Patella oder Quadrizeps Sehnen schneiden.
- Seitlich Mitteilung Kniescheibe, indem Sie einen 1 cm vertikaler Schnitt durch die Kniekapsel unmittelbar lateral der Patellarsehne.
- Stellen Sie sicher, das Knie gestreckt. Nehmen Sie ein Paar für feine Schneid fahren unter der Kniescheibe von lateral nach medial. Verbreiten Sie die Schere ein paar Mal, so dass die Streckapparat ist zu beiden Seiten übersetzt werden.
- Während Biegen ter Knie, übersetzen die Patella seitlich an der Innenseite des Kniegelenks aussetzen. Stellen Sie sicher, klare Visualisierung der Fossa intercondylaris und Femurkondylen. Mit einem Skalpell durchschneiden die ACL und PCL in die Kerbe.
- Last Bohrmaschine mit einem 1,6 mm K-Draht. Zeigen k-Drahtspitze auf ACL Ursprung in der Fossa intercondylaris. Bohren Sie superolaterally und visualisieren den Ausgangspunkt auf der lateralen Seite des Oberschenkels, Entfernen von Weichgewebe bei Bedarf mit einem Skalpell. Übergeben Sie die k-Draht in und aus ein paar Mal, um freien Durchgang für das Transplantat zu gewährleisten.
- Legen Sie die k-Draht auf der ACL-Fußabdruck auf dem Tibiaplateau. Bohren Sie anterolateral und visualisieren Austrittspunkt auf der anterolateralen Tibia. Verwenden Skalpell, um Weichgewebe bei Bedarf zu löschen, so dass der Punkt, wo die k-Draht verlässt die Tibia vollständig sichtbar ist.
- Übergeben Sie eine verkürzte Keith Nadel (idealerweise nicht mehr als 2 cm lang) durch die Oberschenkelknochentunnel. Führen Sie die beiden Fadenenden von einem Ende des Transplantats durch das Auge des Keith Nadel. Verwenden Sie die Nadel an einem Ende des Transplantats durch den Femoral-Hohlraum zu ziehen.
- Wiederholen Sie den vorherigen Schritt, um das andere Ende des Transplantats durch den tibialen Tunnel.
- Verwenden Sie 4-0 Vicrylnaht die Oberschenkel Ende des Transplantats in die umliegenden Knochenhaut oder anderes weiches Gewebe mit einer Figur einer Acht Masche anzubringen. Manuelles Spannen des Transplantats mit dem Knie in Extension. Befestigen Sie den Tibia- Ende des Transplantats in die umliegenden Knochenhaut oder anderes weiches Gewebe mit einer Figur einer Acht Stich.
- Verwenden Sie eine Schere abzuschneiden überschüssige Transplantat an beiden Enden, so dass 1-2 mm an jedem Ende an der Zahl Acht Stich.
- Verlängern Sie die Knie und zur Verringerung der Kniescheibe. Mit 4-0 Vicryl, legen Sie eine einzelne Zahl Acht Masche, um die mediale Gelenkkapsel zu schließen, verhindert seitlichen Subluxation der Patella.
- Schließen Sie die Haut mit einer Lauf subkutikuläre 5-0 Monocryl oder Vicrylnaht, mit darauf, dass die darunter liegende Muskulatur zu nähen oder sichtbare Naht, wenn die Haut wird geschlossen.
- Inject Ratten subkutan mit Buprenorphin alle 12 h für insgesamt drei Tage nach der Operation. Prüfen Operationsstelle für jede Drainage oder Wunddehiszenz zum Zeitpunkt der Injektion. Hinken und einige Schwellungen sind normal in den ersten Tagen nach der Operation, aber prompt wenden Sie sich bei postoperativen Bedenken im Zusammenhang mit Tierärzten. Das Tier kann den sozialen Wohnungsbau der Operation zurück werden in 2 Wochen, als chirurgische Schnitte werden vollständig geheilt.
3. Datenerfassung Protocol
- Zum Zeitpunkt der Opfer ersticken Ratten einzeln in einem geschlossenen CO 2 Kammer gefolgt von Thorakotomie.
- Ernten Sie sowohl die operativ rekonstruiert und kontralateralen Gliedmaßen durch die Trennung im Hüftgelenk.
- Für den rekonstruierten Gliedmaßen, entfernen Sie alle Weichgewebe, einschließlich des hinteren Kreuzbandes und den Überresten aus dem chirurgisch gestört Mutter ACL, mit feinen Sezierung, nur den Oberschenkel, Schienbein, und Graft isolieren. <li> Für die kontralateralen Gliedmaßen, entfernen Sie alle Weichteile bis auf die Mutter ACL als auch die Ober- und Unterschenkel durch feinen Sezierung.
- Verwenden eines Drehwerkzeuges, wie Dremel, alle bis ¾ bis 1 cm von Knochen von jedem Ende des Femur-graft-Tibia-Komplex zu entfernen.
- Während dieses Prozesses und im gesamten biomechanischen Tests, regelmäßig und häufig sprühen die Band Regionen mit physiologischer Kochsalzlösung, um ein Austrocknen des geernteten Knie die fälschlicherweise Ergebnisse verändern können, zu verhindern.
- Sichern Sie die Oberschenkel und Schienbein durch Umwickeln 28 G Stahl verzinkt Draht um die Epiphyse der einzelnen Knochen getrennt. Dies ist zu ungenauen biomechanischen Testdaten vor vorzeitiger Zugversagen der Probe am Knochen und nicht am Bandinteressiere verhindern.
- Pot der Oberschenkelknochen in eine Mischung aus Polymethylmethacrylat (PMMA) Knochenzement. Dazu mischen Sie die beiden Zementkomponenten und sofort die viskose Mischung, um den Oberschenkelknochen in das Metall zu sichern, vollständig umschließt die Diaphyse des Knochens in dem Hart Topf mit der Epiphyse und die angeschlossenen Band frei herausragend. Lassen spontane radikalische Polymerisation nach und nach zu einer teigigen Material und schließlich in eine feste gehärtete Matrix-Transformation der gemischten viskosen Komponenten.
HINWEIS: Dieser Vorgang dauert mehrere Minuten und kann durch die manuelle Prüfung der Temperatur des Bolus aus gemacht überwacht werdender restliche Zement; sollte die Temperatur vorübergehend während der exothermen Polymerisationsreaktion zu erhöhen und klingen auf RT nach dem Material erstarrt. - Wiederholen Sie diesen Vorgang über zum Zementieren der Tibia, nur unter Beibehaltung der Kreuzbandriss bei 20 ° Flexion für optimale mechanische Prüfung.
- Montieren Sie den zementierten Femur-graft-Tibia-Komplex auf eine Zugprüfmaschine, und bereiten sich auf Rekord Last und Verschiebung als Funktion der Zeit vom Beginn der Spannung zum Scheitern. In diesem Beispiel verwendeten wir ein Instron Modell 5564 mit einer 1 kN Lastzelle.
- Vorspannung das Transplantat zu 2 N bei einem Anstieg von 0,5 N / min und testen Sie dann das Transplantat zum Scheitern bei einer Verformungsgeschwindigkeit von 0,5 mm / sec. Während des Prozesses werden Sie sicher, dass das Band an der Mitte der Substanz versagen und dass die Knochen Oberschenkel und Schienbein sicher sind und nicht vorzeitig versagen, was ungenau abschätzen kann biomechanischen Eigenschaften der getesteten Ligament.
- Verwenden Sie die erzeugte Last-Weg-Kurven, die Bruchlast und Steifigkeit des getesteten Ligament zu berechnen.
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Representative Results
Wir haben die Erfahrung von 92 Ratten Operationen von einem einzigen Chirurgen, meine operative Zeit vom Schnitt bis zur Fertigstellung der Wunde war 16,9 min, mit einer Standardabweichung von 4,7 min. Zum Zeitpunkt der Opfer, wog Ratten 356 ± 23 g. Alle Ratten toleriert die Operation gut und hatten keine Komplikationen. Unmittelbar nach der Operation wurden die Ratten darauf hingewiesen, das Gewicht auf dem operativen Ende tragen, zeigten aber eine leichte schlaff. Um eine Woche nach der Operation wurden alle Ratten ohne nennens schlaff ambulating. Die Tiere aller Gewichts stetig gewann im Verlauf der Studie, ohne beobachteten Anomalien in Fütterung, Wasserlassen oder Stuhlgang Gewohnheiten. Klinisch keine grobe Wunddehiszenz, Rötung, Schwellung, Erguss, oder Entwässerung wurde postoperativ beobachtet.
Die oben erwähnten Operationen wurden 92 Ratten nicht primär für die Zwecke dieser Methoden Manuskript geführt. Vielmehr wurden sie verwendet, um verschiedene engineered Transplantat Bedingungen zu testen. Während der detailed mechanische Tests und histologische Ergebnisse sind nicht Gegenstand dieses Papiers können mehr Details in einem Papier von Leong et al. 26 gefunden werden. Kurz gesagt, in der 16. Woche nach der Rekonstruktion, die histologische Analyse der geschnittene Knie gezeigt, dass die Gerüstmatrix wurde weitgehend durch Fibroblasten sezer eosinophile Kollagen mit guten Einbindung in den Knochentunnel (3) infiltriert. Zu diesem Zeitpunkt hat das Gerüst vollständig resorbiert und keinen Hinweis auf das Polymer visualisiert wurde. Zusätzlich Immunhistochemie für den Makrophagenmarker CD68 zeigten minimale Entzündungsreaktion nach 16 Wochen nach der Operation ist (Abbildung 4).
Biomechanischen Eigenschaften wurden sofort nach der Tötung bewertet. Alle getesteten Proben versagten bei der Mitte der Substanz (Abbildung 5). Mit Last-Verschiebungskurven aus Zugversuch erzeugt (Abbildung 6), Bruchlast und Steifigkeitwurden für jede Gruppe berechnet. 16 Wochen nach der Implantation hatte der elektrogesponnenen Polymer-Transplantat etwa die doppelte Spitzenlast und Steifigkeit des Transplantates getestet sofort nach der Implantation, aber diese Werte niedriger als die native ACL 26 waren.
Abbildung 1. REM-Aufnahme von elektro Polycaprolacton Gerüst mit ausgerichteten Fasern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 2. athymischen Rattenmodell der ACL-Rekonstruktion. (A) Isolierung der Patellasehne über einen medialen parapatellaren Hautschnitt. (B) Das Bohren der Oberschenkel tunnel mit 1,6 mm K-Draht. (C) Das Bohren der tibialen Tunnel. (D) Platzierung von 1,2 mm Keith Nadel durch Femoral-Hohlraum, um Transplantat durchziehen. (E) Durch Elektro Polycaprolacton Transplantat durchzogen Femoral-Hohlraum. (F) Graft zog durch beide Ober- und Unterschenkel Tunnel, bevor die Enden getrimmt und Knochenhaut eingenäht, und eine geschichtete Schließung wird durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 3 Hämatoxylin und Eosin-Färbung der elektroPolymer Transplantat (oben) an Schienbeinknochenkanal (links), midsubstance (Mitte) und Oberschenkelknochenkanal (rechts) Zum Vergleich wird Mutter ACL angezeigt. (Unten), an der Tibia Insertion ( links), midsubstance (center) und Oberschenkel Ursprung (rechts), 10X. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 4. Kolorimetrische Immunhistochemie Färbung für CD68, einem Marker für Makrophagen. Qualitativ scheint es etwas positiver Färbung in den Knochentunnel nach 8 Wochen sein als in der intraartikulären Gebiet des Transplantats oder nach 16 Wochen nach der Operation. Es scheint eine geringe Entzündung in den Transplantaten werden. Alle Bilder sind 20-facher Vergrößerung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 5 Bilder mechanische Prüfung von implantierten elektro Transplantats, zeigen Versagen midsubstance des Transplantats. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 6. Beispiellastverschiebungskurve für Tissue-Engineering-ACL-Transplantat bei 16 Wochen nach der Implantation in athymischen Rattenmodell. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
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Discussion
ACL Verletzungen sind eine häufige Erkrankung in der orthopädischen Sportchirurgie, mit begrenzten Möglichkeiten für den Wiederaufbau in der heutigen Zeit. Um einen geeigneten Tissue-Engineering Ersatz für die ACL, die Regeneration in vivo ermöglicht entwickeln wird ein geeignetes Tiermodell erforderlich. In dieser Studie wird die Herstellung eines biologisch abbaubaren Werk Transplantats beschrieben, so ist seine in vivo-Implantation unter Verwendung eines reproduzierbaren Modell ACL-Rekonstruktion in einer athymischen Ratten. Dieses Modell kann verwendet werden, um verschiedene Gewebezüchtung ACL Transplantate verschiedener Biomaterialien, einschließlich zellulären Transplantaten und diejenigen mit eingebauter Wachstumsfaktoren zusammensetzt bewerten.
In diesem speziellen Studie untersuchten wir eine zellfreie, elektro Polycaprolacton Transplantat mit ausgerichteten Fasern. Frühere Studien der Gewebezüchtung Bandrekonstruktion haben geflochtenen oder extrudierten Transplantate aus einer Vielzahl von Materialien, einschließlich Seide, PLLA hergestellt implantiert und Polyurethan 27-29. Keines dieser Materialien ergab sowohl eine erfolgreiche Integration des Transplantats und Wiederholung der mechanischen Eigenschaften des ACL 7. Viele Polymere haben das Potential für den Einsatz in Bandrekonstruktion dieser Studie untersucht PCL weil es biologisch inert, nicht toxisch ist, zersetzt sich langsam in vivo, und ist leicht in eine gewünschte Form 30 hergestellt. PCL ist auch mechanisch robust und zeigt wenig plastische Verformung unter mechanischer Belastung 30. Seine Verwendung in der Knochengewebe Literatur als zuverlässiger Reservoir für die Mineralisierung und Typ I Kollagen Abscheidung aufgrund seiner ausgerichteten Nanofaserstruktur, wenn elektrogesponnen 31 etabliert. Auch hat es sich gezeigt, dass die hohe Oberfläche zu Volumen und kurze Diffusionslängenskala der Fasern mit kleinem Durchmesser in elektro PCL Matten sind günstig für kontrollierte Arzneimittelabgabe und Verwendung in Tissue Engineering 31.
Es wurde gefunden, dassdie implantierten Transplantate wurden biokompatible basierend auf einem Mangel an klinischen Nebenwirkungen, und erleichtert nativen Zellinfiltration als histologisch nach 16 Wochen nach der Operation sehen. Wir verwendeten eine athymische Tiermodell in dieser Studie, da es die erste Stufe eines zweistufigen Projekt schließlich verwenden werden menschliche Zellen, die mit dem Transplantat implantiert und eine athymische Modell würde Bedenken Verringerung hinsichtlich Ablehnung der menschlichen Zellen. Die elektrogesponnenen Polymergerüst erleichtert sowohl die Zelle und Matrix-Ausrichtung in der regenerierten ACL. Wie in dem Querschnitt des Implantats zu sehen ist, wurden die meisten der Zellen in der Richtung der Fasern ausgerichtet sind. Die implantierten Transplantate zeigten mechanischen Eigenschaften im Laufe der Zeit erhöht. Belastung bis zum Versagen der Polymertransplantate verdoppelt im Vergleich zu dem rekonstruierten ACL unmittelbar postoperativ. Während der Spitzenlast und Steifigkeit des PCL Transplantat kann im Vergleich zu nativen ACL niedrig erscheinen, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass diese Ergebnisse sollten angesichts der f betrachtet werdenhandeln, dass auch der derzeitige Goldstandard, Autotransplantaten oder Allotransplantaten, sind nicht in der Lage, die mechanische Festigkeit der gesunden ACL um 16 Wochen nach der Operation zu erreichen. Zum Beispiel war Xu et al. Auf einer ACL Autotransplantat in einem Kaninchenmodell, in dem Spitzenlast bei 20% -35% und Steifigkeit berichteten 23% -36% der von gesunden natürlichen vorderen innerhalb von 6 Monaten nach der Operation 32. Darüber hinaus wird eine Allograft-Studie in einem Hunde-Modell gezeigt, rund 30% der Spitzenlast und 40% der Steifigkeit des Mutter ACL um 30 Wochen nach der Operation 33.
Obwohl es nicht in den Anwendungsbereich der vorliegenden Arbeit ist, können viele andere Analysen durchgeführt werden, um Transplantatqualität nach der Anwendung dieses Tiermodells zu bewerten. Dies umfasst, ist aber nicht biolumineszierenden Bildgebung oder Röntgenstrahlen und CT in vivo, und eine Vielzahl von Flecken und Assays wie Immunhistochemie für Kollagen Marker oder Entzündungsmarker beschränkt. Zum Beispiel werden zuvor veröffentlichten wir Ergebnisse der Quantifizierung flucht collagen Fasern mittels Picrosirius Rotfärbung nach Implantation elektro PCL Gerüsten in diesem Tiermodell 26 implantiert.
Mögliche Einschränkungen der Studie gehören die Wahl des Tiermodell selbst. Die inhärenten Unterschiede in der Anatomie und Gangbild in der vierbeinigen Ratte im Vergleich zum zweibeinigen Menschen bedeuten, dass die Biomechanik des ACL variieren und Übersetzung der klinischen Parameter zwischen den Modellen sollten mit Kenntnis dieser Einschränkungen durchgeführt werden. Allerdings ist dieses Problem im Tierversuch häufig und negiert nicht die Bedeutung oder Translations Potenzial dieser Forschung.
Es hat interessante Forschungs auf postoperative Protokolle für die Ratte ACL Rekonstruktion mit Autograft, die unser Modell für hochentwickelte ACL Ersatz in der Zukunft angewendet werden können. Externe Fixierungsvorrichtungen verwendet worden, um Ratten postoperativ, um zu immobilisieren, um eine verbesserte sehnenKnochenHeilung in einem Sehnenautotransplantat-Modell erlauben19. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass zyklische Belastung verzögert wird, wie mit dem durch Stasiak et al. 34 beschrieben Flexion-Extension-Gerät, weiter verstärken können autologe Einbau 20. Es hat sich jedoch auch gezeigt, dass kurze Dauer geringer Größe zyklischer Beanspruchung kann auch dazu führen erhöhte Entzündung und verringerte Knochenbildung an der Knochen-Sehnen-Schnittstelle 35. Weitere Untersuchungen durchgeführt werden müssen, um die Anwendbarkeit dieser Ergebnisse zu einem elektroPolymerBasis ACL Ersatz zu bewerten, da ein solches Transplantat schwächere anfängliche mechanische Eigenschaften als eine Sehne Allotransplantat haben.
In der vorliegenden Studie wurde ein Modell der ACL-Rekonstruktion mit einem azellulären elektro Transplantat in einer athymischen Ratten entwickelt, aus Modifikationen eines zuvor beschriebenen Ratten-Autotransplantat-Modell 17-22 basiert. Wir haben gezeigt, die Ausarbeitung von dichten bündig Kollagen während des Transplantats mit einer gleichzeitigen Verbesserung der Belastung bis zum Versagendes Transplantats im Laufe der Zeit. Die Studie gibt auch Proof of Concept für die Beschäftigung dieses Modell in der Zukunft, um verschiedene Tissue-Engineering-Transplantate für ACL-Rekonstruktion zu bewerten. Insbesondere ermöglicht die Aussaat von xenogenen Spenderzellen die athymischen Ratten.
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Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich bei Gabriel Arom und Michael Yeranosian für ihre technischen Beiträge zu früheren Iterationen dieses Projekts danken. Dieses Projekt wurde von der OREF Kliniker Scientist Ausbildung Grant (NL) finanziert, HH Lee Surgical Research Grant (NL), Veterans Administration BLR & E Merit Bewertung 1 I01 BX00012601 (DM) und Muskel-Skelett-Stiftung für Transplantation Young Investigator Award (FP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medical grade ester terminated poly (ε-caprolactone), granule form (MW = 110,000) |  Lactel Absorbable Polymers |
Custom synthesized polymer to desired molecular weight | |
| 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol | Sigma-Aldrich | 105228 | Solvent for PCL polymer |
| 18 G x 1½" bevel needle | BD Medical | 305196 | |
| Remote Infuse/Withdraw Programmable Syringe Pump | Harvard Apparatus | 702101 | |
| VersaLaser VLS2.30 Laser Engraver | Microgeo USA | VLS2.30 | |
| Expanded Plasma Cleaner 115 V | Harrick Plasma | PDC-001 | Plasma etch just prior to collagen coating for surface modification |
| PureCol Collagen Standard Solution, 3 mg/ml | Advanced Biomatrix | 5015-A | Mix 8:1:2.5 solution of PureCol, 10x PBS, 0.1 N NaOH 1:9 in 1x PBS |
| Suture, 5-0 Vicryl | Henry Schein | 1086471 | |
| Suture, 4-0 Vicryl | Henry Schein | 6540072 | |
| Sharp-pointed Dissecting Scissors (Straight; 4.5 inch) | Fisher Scientific | 8940 | |
| Buphrenorphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | B9275 | Use 0.03 mg/kg for both intra- and post-operatively for pain control |
| Ampicillin, injectable | Henry Schein | 1185678 | Use 25 mg/kg subcutaneously during the procedure |
| K-wire, 1.6 mm | Spectrum Surgical | SI040062 | |
| Keith Needle, Straight 1½" | Delasco Dermatology Lab & Supply | KE-112 | |
| Immunocal Decalcifying Solution | Fisher Scientific | NC9491030 | |
| Opticryl Acrylic Resin Bone Cement (PMMA) (Monomer and polymer) | US Dental Depot | OPTICRYL 100410 | |
| Instron Model 5564 Tensile Testing Machine | Instron | 5564 | Any comparable tensile testing apparatus is suitable |
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