Atymiske Rat model for evaluering af Engineered forreste korsbånd udtagne transplantater

Introduction

Bristning af forreste korsbånd (ACL) er en af de mest almindelige ledbåndsskader i knæet ^1. Fordi bristede ACL er ikke er i stand til at helbrede uden kirurgisk indgreb, er begrænsningerne i dagligdags aktiviteter samt deltagelse i sport køre over 175.000 patienter skal opereres hvert år ^2, med en anslået udgift på en milliard dollars årligt ^3. I øjeblikket er enten autograft eller allograft sene anvendes til ligamentrekonstruktion. Selvom høj succesrate kan opnås med både autograft og allotransplantat udskiftning, er alvorlige komplikationer forbundet med disse genopbygning muligheder ^4. Autotransplantat væv er forbundet med donor websted sygelighed og er begrænset i udbud, især i tilfælde af re-ruptur eller flere ligamenternes skade. På den anden side er allotransplantatvæv forbundet med forsinket graft integration, negativ inflammatorisk respons, teoretisk infektiøs risiko og begrænset supply ^5. Syntetiske ikke-nedbrydelige transplantater blev udviklet i 1970'erne og 1980'erne, men blev hæmmet af for tidlig graft brud, fremmedlegeme reaktioner, osteolyse, og synovitis ^6. Som et resultat af disse alvorlige bekymringer, der er i øjeblikket ingen syntetiske grafts rådighed til klinisk brug i USA.

På grund af disse begrænsninger med eksisterende graft muligheder og til den seneste udvikling inden for biologi, teknik og regenerativ medicin, har der været stor interesse for en manipuleret væv løsning for ACL podning. Aktuelle vævsteknologiske strategier ansætte nedbrydelige biologiske og syntetiske materialer for at muliggøre host vævsindvækst samtidig undgå de begrænsninger, der er forbundet med permanent syntetisk materiale implantation ^7.

Polycaprolacton (PCL) er en biologisk nedbrydelig polymer, der er FDA godkendt til en række medicinske anvendelser, herunder adhæsion barriere og sårforbinding ^8, der har været used i en lang række applikationer, herunder vaskulær, knogle, brusk, nerver, hud og esophageal vævsmanipulering ^5,9-16. Gunstige biokompatibilitet, relativt lang in vivo halveringstid, passende mekanisk styrke og høj elasticitet bidrager til populariteten af denne polymer i tissue engineering. I en gnaver-model af sårheling, blev implanteret elektrospundet PCL vist sig at være ikke-immunogen og at integrere i lokale væv uden bivirkninger ^13. Et SEM-billede af elektrospundet PCL er vist i figur 1.

Med den nuværende FDA normer, effekt og sikkerhed i både små og store dyremodeller vil være behov for en PCL eller andre manipuleret ACL graft at flytte ind i kliniske forsøg i USA. Derudover kan in vivo betingelser ofte forøge egenskaberne for en in vitro manipuleret væv ACL graft. En rotte model af autolog ACL rekonstruktion med flexor digitorum longus senen er tidligere blevet beskrevet, hvor det native ACL blev afbrudt, femorale og tibiale tunneler blev boret og transplantatet blev passeret og fastgjort på plads med sutur ^17-22. I dette papir vil vi beskrive en ændring af denne model til vurdering af industrielt ACL udskiftninger i stedet for autograft-baserede rekonstruktion (Figur 2).

Selvom der findes mange dyremodeller for ligament tissue engineering, rotte er fordelagtig i forhold til større modeller for en række årsager. Disse fordele omfatter lettere dyrehold og håndtering, færre etiske overvejelser, og reducerede omkostninger ^17,23. Desuden har rottemodellen vid udstrækning blevet anvendt som model for ortopædisk vævsregenerering, herunder brusk, sener og knogle vævsmanipulering ^24. Navnlig blev athymiske nøgne rotter valgt på grund af deres mangel på cellemedieret immunrespons ^25, giver mulighed for en eventuel implantation of xenogene donorceller i denne model for yderligere at forbedre den konstruerede transplantat i fremtiden. I denne metoder papir, beskriver vi fremstilling og kirurgisk implantation af en acellulær, bionedbrydelig polymer graft i en athymiske rottemodel for ACL genopbygning.

Protocol

BEMÆRK: Alle dyr operationer blev godkendt af den lokale veterinære personale og dyr brug udvalg før påbegyndelse eksperimenterne.

1. Fremstilling af elektrospundne polycaprolacton Stilladser

1. I granulatform i 1,1,1,3,3,3-hexafluor-2-propanol afvejes og opløses medicinsk kvalitet estertermineret poly (ε-caprolacton) for at skabe en 10% w / w opløsning af PCL polymer. Lad opløsningen omrøres under anvendelse af en omrøringsplade i mindst 3 timer for at sikre en homogen opløsning.
2. Electrospin PCL løsning til at skabe en manchet af højt linie PCL fibre til stillads opspind.
   1. Forbered electrospinning setup i et stinkskab med blæseren på på alle tidspunkter. Det består af en stor akryl boks, der vil tjene som et isoleret vakuum medium for elektrospinningsprocessen og har indgange for kilden PCL løsning drevet af en spændingskilde, det motordrevne indsamle dorn, og et vakuum-port. Rengør akrylc box grundigt med ethanol og dækker alle overflader med parafilm ark for at fjerne eventuelle urenheder, der kan kompromittere kvaliteten af ​​elektrospundet produkt.
   2. Load ca. 3 ml af ovennævnte opløsning i en 10 ml sprøjte med en stumpendet 18 g, 1 ½ inch nål. Fjern eventuelle luftbobler ved at skubbe sprøjten op. Lock opløsning i en programmerbar sprøjtepumpe. Stik nålen gennem et lille hul i akryl boks mens omkring ½ tomme af nålen uden for akryl boks til fastgørelse af spændingskilden wire.
   3. Brug en 30 mm roterende drejebænk dorn som solfangeren for de højt tilpassede PCL fibre; dækker dornen stramt med en tynd strimmel af aluminiumfolie. Lås dornen ind i motoren på den modsatte side af feltet omkring 15 cm væk fra kanylen.
   4. Sæt plastik slange ind i vakuum-port og oprette forbindelse til stinkskabet vakuum kilde. Tænd vakuumkilden og dækker akryl boks med låg.
   5. Set infusionshastigheden af ​​den programmerbare sprøjtepumpe til 2,5 ml / time. Tænd for motoren til at drive dornen ved 3.450 rpm og vedhæfte den positive ledning på spændingskilden til nålespidsen uden for boksen ved hjælp af et krokodillenæb.
   6. Når infusion af PCL løsningen er begyndt, tænd spændingskilden og indstillet til en 20 kV driftsspænding.
   7. Infunder opløsningen i 12 minutter for at skabe en homogen manchet fra 0,5 ml af PCL opløsning.
      BEMÆRK: I gennemsnit hver manchet har tilstrækkelig elektrospundet materiale til at skabe to seks-bånd ark, som kan anvendes til at skabe en i alt tre firelaget scaffolds.
3. Laser skære PCL manchet til at danne flere små ark på en VersaLASER Cutter 2.3 drives ved lav vakuum indstilling, 10,0 keV landing spænding, 6,4 mm arbejder afstand, og sonde diameter på 3,0.
   BEMÆRK: I dette eksempel blev en computer aided design bruges til at instruere kutteren for at give flere ark af 1,5 mm x 35 mm x 150 um stilladser medjævnt fordelt 150 um diameter huller på 15% pore område.
4. Plasma ætse PCL scaffolds ved anvendelse af en plasma renere at inducere hydrofilicitet PCL overflade med ion acceleration. Sæt vakuum til 450 mTorr og behandle stillads til 30 sekunder ved høj effekt (29,6 W).
5. Bade stilladser i 70% ethanol i et sterilt miljø.
6. Coat de enkelte stilladser med collagen til at lette cellulær adhæsion og proliferation in vivo.
   1. Opret en collagen coatingopløsning ved fortynding af et 8: 1: 2,5 steril opløsning af Purecol collagen 3 mg / ml standardopløsning, 10x PBS og 0,1 N NaOH 1: 9 i 1x PBS ved 4 ° C. Bland grundigt for at sikre løsning homogenitet.
   2. Coat individuelle 1,5 mm x 35 mm x 150 um stilladser med et tyndt lag film af den ovennævnte collagen opløsning. Lad det tørre i 24 timer i et sterilt miljø.
7. Brug 5-0 Vicryl suturer, stable og anbringer fire individuelle 1,5 mm x 35 mm x 150 um stilladserved hjælp af en Krackow søm at skabe en afsluttende 0,6 mm tyk, multi-lag, collagen-coated stillads, der er klar til implantation.

2. Rat Surgery Protocol

1. Fremkald anæstesi ved at placere rotte i indånding kammer og levere 2% isofluran med 2 L / min ilt. Bekræft rotten er tilstrækkeligt bedøvet ved at anvende pres for bagben og evaluering for nogen reaktion.
2. På det ikke-sterile tilbage bord, subkutant injicere 25 mg / kg ampicillin og 0,03 mg / kg buprenorphin.
3. Anvend oftalmologiske salve til øjnene. Klip pelsen fra den operative bagben og prep det kirurgiske sted med tre skiftende scrubs af klorhexidin og 70% ethanol.
4. Overfør rotte til operationsbordet, på en opvarmet pude for at forhindre hypotermi. Sikker næse kegle, og opretholde anæstesi gennem proceduren med 2% isofluran i 2 L / min ilt, leveret næse kegle. Drapere på en steril måde, forlader udløsende lemmer udsat for.
5. Foretag en 2 cm lang lodret snit medialt for knæet, centreret ved niveauet af patella. Træk huden lateralt, indtil snittet er centreret over knæet.
6. Brug en skalpel til at foretage en medial parapatellar artrotomi ved at skære lige medialt for knæskallen og strækker sig proximalt til niveauet for den muskulotendinøst krydset af quadriceps og distalt til niveauet af patellarsenen indsættelse på den tibiale tuberkuløse. Pas på ikke at skære patella eller quadriceps sener.
7. Frigivelse patella sideværts ved at lave en 1 cm lodret snit gennem knæet kapsel lige lateralt for patellarsenen.
8. Sørg knæet forlænges. Tag et par fine sakse og passere under knæskallen fra laterale til mediale. Spred saksen et par gange, så extensor mekanismen kan oversættes til hver side.
9. Under bøjning than knæ, oversætte patella sideværts for at blotlægge den indvendige side af knæleddet. Sikre klar visualisering af interkondylære hak og femurkondyler. Ved hjælp af en skalpel, transektere ACL og PCL i hak.
10. Load boremaskine med en k-wire 1,6 mm. Placer k-wire tip om ACL oprindelse i interkondylære hak. Bor superolaterally og visualisere udgangsstedet på den laterale aspekt af lårben, fjerne et andet blødt væv som nødvendigt med en skalpel. Før K-wire ind og ud et par gange for at sikre fri passage for transplantatet.
11. Placer k-ledningen på ACL fodaftryk på den tibial plateau. Bor anterolaterally og visualisere udgangsstedet på anterolaterale proksimale tibia. Brug skalpel for at fjerne blødt væv som nødvendigt, så det punkt, hvor k-trådudgangene skinnebenet er fuldt visualiseres.
12. Pass en forkortet Keith nål (ideelt ikke mere end 2 inches lang) gennem lårbensknogle tunnel. Tråd to suturender fra den ene ende af implantatet gennem øjet af Keith nål. Brug nålen til at trække den ene ende af implantatet gennem den femorale tunnel.
13. Gentag forudgående trin til at passere den anden ende af transplantatet gennem tibial tunnel.
14. Brug 4-0 Vicryl sutur til at anbringe den femorale ende af transplantatet til omgivende periosteum eller andet blødt væv med en tal-of-otte sting. Manuelt spænding transplantatet med knæet i forlængelse. Fastgør den tibiale ende af transplantatet til omgivende periosteum eller andet blødt væv med en tal-of-otte sting.
15. Brug en saks til at afskære overskydende graft på begge ender, hvorefter 1-2 mm på hver ende forbi figur-af-otte sting.
16. Forlæng knæet og reducere knæskallen. Brug 4-0 Vicryl, placere et enkelt tal-of-otte sting for at lukke den mediale ledkapslen, forhindrer lateral subluksation af patella.
17. Luk huden med en kørende subkutikulær 5-0 Monocryl eller Vicryl sutur med omhu for ikke at suturere den underliggende muskel eller har nogen synlig sutur når huden lukkes.
18. Inject rotter subkutant med buprenorphin hver 12 timer til i alt tre dage efter operationen. Tjek kirurgisk STEDET dræning eller sårruptur på tidspunktet for injektionen. Halter og nogle hævelse er normalt i de første par dage efter operationen, men straks løse eventuelle postoperative problemer i forbindelse med dyrlæger. Dyret kan vende tilbage til socialt boligbyggeri ved 2 uger postoperativt, når kirurgiske snit er fuldstændig helet.

3. Dataindsamling Protocol

1. På tidspunktet for aflivning kvalt rotter enkeltvis i et lukket CO ₂ kammer efterfulgt af torakotomi.
2. Høst både kirurgisk rekonstruerede og kontralaterale lemmer ved at adskille på hofteleddet.
   1. For de rekonstruerede lemmer, fjerne alt blødt væv, herunder bagerste korsbånd og resterne fra kirurgisk forstyrret native ACL, med bøde dissektion at isolere kun lårben, skinneben og graft.
   <li> For den kontralaterale lemmer, fjerne alle bløde væv undtagen den native ACL samt lårben og skinneben med bøde dissektion.
   2. Brug et roterende værktøj såsom Dremel, for at fjerne alt, men ¾ til 1 cm knogle fra hver ende af lårbenet-graft-skinneben kompleks.
   3. I løbet af denne proces og i hele biomekanisk testning, regelmæssigt og ofte sprøjte ligamentous regioner med normalt saltvand for at forhindre udtørring af høstede knæ som kan fejlagtigt ændre resultater.
3. Til histologisk analyse, fastsætte hver knæ individuelt i 4% paraformaldehyd-opløsning ved 25 ° C i 48 timer. Dernæst nedsænkes knæet i en opløsning af Immunocal reagens til fuldstændig afkalkning; denne proces er afhængig af de forkalkede indhold af prøven og kan tage op til fem dage. Tjek individuelle prøver dagligt at vurdere fremskridt som ufuldstændig afkalkning kan sænke prøve kvalitet. Når du er færdig, skal du udføre sektionering, slide montering og farvning som ønsket.
4. Perform biomekaniske test for at vurdere den funktionelle kapacitet af vævet manipuleret ligament.
   1. Fastgør lårben og skinneben af ​​indpakning 28 G galvaniseret ståltråd omkring epiphysis af hver knogle separat. Dette er for at forhindre unøjagtige biomekaniske test data fra tidlig trækstyrke svigt af prøven på knoglen i stedet for i ledbånd af interesse.
   2. Pot lårbenet i en blanding af polymethylmethacrylat (PMMA) knoglecement. For at gøre dette, bland de to cement komponenter, og straks bruge den viskose blanding for at sikre lårbenet ind i metal, helt omslutter diafysen af ​​knoglen i cementerede puljen med epifysen og fastgjort ligament rager frit. Tillad spontan fri radikal polymerisation til gradvist at omdanne de blandede viskose komponenter til en dejagtig materiale og i sidste ende til en fast hærdet matrix.
      BEMÆRK: Denne proces tager flere minutter og kan overvåges ved manuelt at vurdere temperaturen af ​​en bolus fremstillet afden resterende cement; temperaturen bør forbigående stige i den exoterme polymerisationsreaktion og aftager til RT efter de materielle størkner.
   3. Gentag den samme proces over til cementering skinnebenet, undtagen samtidig opretholde knæet ledbånd ved 20 ° fleksion for ideal mekanisk prøvning.
   4. Monter cementerede lårben-graft-skinneben kompleks på en apparat trækprøvning, og forberede sig på at optage belastningen og forskydning som en funktion af tiden fra begyndelsen af ​​spænding til fiasko. I dette eksempel anvendte vi en Instron Model 5564 med en 1 kN belastningscelle.
   5. Forspænding implantatet til 2 N med en stigningsgrad på 0,5 N / min og derefter teste implantatet til svigt ved en belastning på 0,5 mm / sek. Under processen, skal du sørge for, at ledbånd svigter i midten stof, og at den benede lårben og skinneben er sikre og ikke for tidligt mangel, som kan unøjagtigt vurdere biomekaniske egenskaber af det testede ledbånd.
   6. Brug den genererede belastning-forskydningkurver til at beregne den manglende belastning og stivhed i den testede ligament.

Representative Results

Det er vores erfaring af 92 rotte operationer ved en enkelt kirurg, betyde operative tid fra indsnit til færdiggørelse af sår var 16,9 min, med en standardafvigelse på 4,7 min. På tidspunktet for aflivning rotterne vejede 356 ± 23 g. Alle rotter tolereres operationen godt, og oplevet nogen komplikationer. Umiddelbart efter kirurgi blev rotterne bemærkes at bære vægten på den operative ende, men udviste en svag halte. En uge postoperativt blev alle rotter ambulating med nogen mærkbar halte. Dyrene alle tog på i vægt støt i løbet af undersøgelsen, uden observerede abnormiteter i fodring, vandladning eller afføring vaner. Klinisk ingen brutto sårruptur, erytem, ​​hævelse, effusion eller dræning blev observeret postoperativt.

De 92 rotte operationer ovennævnte blev ikke udført primært i forbindelse med denne metoder manuskript. Snarere blev de brugt til at afprøve forskellige Engineered podede betingelser. Mens detailed mekanisk prøvning og histologiske resultater er uden for dette papir, kan flere detaljer findes i en afhandling af Leong et al. ^26. Kort sagt ved 16 uger efter genopbygning, histologisk analyse af snit knæet viste, at stilladset matrix stort set blev infiltreret af fibroblaster secernerer eosinofil collagen med god integration i knoglen tunneler (figur 3). På dette tidspunkt har stilladset blevet fuldstændig resorberet og ingen tegn på polymeren blev visualiseret. Derudover immunhistokemi for makrofag CD68 påvist minimal inflammatorisk respons efter 16 uger postoperativt (figur 4).

Biomekaniske egenskaber blev vurderet umiddelbart efter aflivning. Alle testede prøver mislykkedes i midten stof (figur 5). Brug kurver load-forskydning genereret fra trækprøvning (figur 6), brudlast og stivhedblev beregnet for hver gruppe. 16 uger efter implantation, den elektrospundet polymer graft havde omtrent dobbelt spidsbelastning og stivhed testes umiddelbart efter implantation graft, men disse værdier var lavere end den native ACL ^26.

Figur 1. SEM billede af elektrospundet polycaprolacton stillads med justeret fibre. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 2. athymiske rottemodel for ACL genopbygning. (A) Isolering af patellarsenen via en medial parapatellar incision i huden. (B) Boring af femoral Tunnel ved hjælp af 1,6 mm K-wire. (C) Boring af tibial tunnel. (D) Placering af 1,2 mm Keith nål gennem femoral tunnel at trække graft igennem. (E) elektrospundne polycaprolacton graft trukket gennem femoral tunnel. (F) Graft trukket gennem både femorale og tibial tunneler, før enderne er trimmet og syet til periost, og en lagdelt lukning udføres. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 3. hematoxylin og eosin-farvning af elektrospundet polymer graft (øverst) ved tibial knogle tunnel (til venstre), midsubstance (i midten) og lårbensknogle tunnel (højre). Til sammenligning er native ACL vist (nederst) ved tibial indføring ( venstre), midsubstance (cePil) og femoral oprindelse (til højre), 10X. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 4. Kolorimetrisk immunhistokemi farvning for CD68, en markør for makrofager. Kvalitativt synes der at være lidt mere positiv farvning i knoglen tunnel efter 8 uger end i det intraartikulære område af transplantatet eller efter 16 uger efter operationen. Der synes at være minimal betændelse i transplantaterne. Alle billeder er 20X forstørrelse. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 5. Billeder af mekanisk afprøvning af implanteret elektrospundet graft, der viser svigt i midsubstance af graft. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur load-forskydningskurve 6. Prøve til tissue-manipuleret ACL transplantat på 16 uger efter implantation i athymiske rottemodel. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Discussion

ACL skader er en almindelig tilstand i ortopædisk sport kirurgi, med begrænsede muligheder for genopbygning på nuværende tidspunkt. For at udvikle en passende væv-manipuleret erstatning for ACL, der vil tillade regenerering in vivo, er en egnet dyremodel påkrævet. I denne undersøgelse, er fremstillingen af en biologisk nedbrydelig manipuleret graft beskrevet, som det er dets in vivo implantation under anvendelse af en reproducerbar model af ACL rekonstruktion i et athymiske rotter. Denne model kan anvendes til at evaluere forskellige væv manipuleret ACL transplantater sammensat af forskellige biomaterialer, herunder cellulære transplantater og dem med inkorporerede vækstfaktorer.

I denne undersøgelse har vi testet en acellulær elektrospundet polycaprolacton transplantat med aligned fibre. Tidligere undersøgelser af manipuleret væv ligamentrekonstruktion har implanteret flettet eller ekstruderede implantater fremstillet af en række materialer, herunder silke, PLLA, og polyurethan ^27-29. Ingen af disse materialer har resulteret i både vellykket integration af transplantatet og sammenfatning af de mekaniske egenskaber af ACL ^7. Mens mange polymerer har potentiale til anvendelse i ligamentrekonstruktion denne undersøgelse undersøgt PCL, fordi det er biologisk inert, ikke-toksisk, nedbrydes langsomt in vivo og er let at fremstille i en ønsket konformation ^30. PCL er også mekanisk robust og udviser lille plastisk deformation under mekanisk belastning ^30. Er blevet etableret Dens anvendelse i knoglevævet engineering litteratur som en pålidelig reservoir for mineralisering og type I collagen deposition på grund af sin linje nanofiber struktur når elektrospindes ^31. Desuden er det blevet vist, at den høje overflade til volumen og korte diffusion længdeskala af fibre med lille diameter i elektrospundne PCL måtter er gunstige for kontrolleret lægemiddelafgivelse og anvendelse i vævsmanipulering ^31.

Det konstateredes, atde implanterede grafts var biokompatible baseret på en manglende klinisk bivirkning, og lettes native celleinfiltration set histologisk efter 16 uger postoperativt. Vi udnyttede et athymiske dyremodel i denne undersøgelse, da det er det første trin i en to-trins-projekt, der med tiden vil udnytte humane celler implanteret med implantatet, og en athymiske model ville reducere bekymringer vedrørende afvisning af de humane celler. Den elektrospundet polymerskelet lettet både celle og matrix tilpasning i den regenererede ACL. Som det ses i tværsnit af implantatet blev størstedelen af ​​cellerne linie i retning af fibrene. De implanterede transplantater viste øget mekaniske egenskaber over tid. Til svigt af de polymere implantater dobbelt i forhold til den rekonstruerede ACL umiddelbart postoperativt. Mens spidsbelastning og stivhed af PCL graft kan synes lav i sammenligning med nativ ACL, er det vigtigt at huske, at disse resultater skal ses i lyset af fhandle, at selv den aktuelle guldstandard, autotransplantater eller allotransplantater, er ikke i stand til at opnå den mekaniske styrke af sunde ACL ved 16 uger postoperativt. For eksempel, Xu et al. Rapporteret på en ACL autograft i en kanin model, hvor spidsbelastning var 20% -35% og stivhed var 23% -36% hos raske native ACL 6 måneders postoperativt ^32. Derudover en allograft studie i en hundemodel demonstrerede ca. 30% spidsbelastningen og 40% stivhed native ACL efter 30. uge postoperativt ^33.

Selv om det er uden for rammerne af dette papir, kan mange andre analyser udføres for at vurdere graft kvalitet efter brug af denne dyremodel. Dette omfatter, men er ikke begrænset til bioluminescerende billeddannelse eller røntgenstråler og CT-scanninger in vivo, og et væld af pletter og assays, såsom immunhistokemi for kollagen markører eller inflammatoriske markører. For eksempel har vi tidligere offentliggjorte resultater på kvantificering af aligned collagen fibre ved hjælp PicroSirius rødfarvning efter implantation af elektrospundne PCL stilladser implanteret i denne dyremodel ^26.

Potentielle begrænsninger af denne undersøgelse omfatter valg af dyremodellen selv. De iboende forskelle i anatomi og gangart i quadrupedal rotte sammenlignet med bipedal mennesker betyder, at biomekanik af ACL varierer, og at oversættelsen af ​​kliniske parametre mellem modellerne bør ske med kendskab til disse begrænsninger. Men dette spørgsmål er almindelig i dyreforsøg, og ophæver ikke betydningen eller translationelle potentiale af denne forskning.

Der har været interessant forskning postoperative protokoller for rotte ACL rekonstruktion hjælp autograft der kan anvendes til vores model for manipuleret ACL udskiftninger i fremtiden. Eksterne fastgørelsesindretninger er blevet anvendt til at immobilisere rotter postoperativt for at give forbedret sene-knogleheling i en sene autograft model19. Derudover er det blevet vist, at forsinket cyklisk belastning, såsom med fleksion-extension anordning beskrevet af Stasiak et al. ^34, kan yderligere forbedre autograft inkorporering ^20. Det har også vist sig imidlertid, at kortvarig lav størrelsesorden cyklisk belastning også kan forårsage øget inflammation og reduceret knogledannelse ved knogle-senen grænseflade ^35. Skal udføres yderligere undersøgelser for at evaluere anvendeligheden af ​​disse resultater til en elektrospundet, polymer-baserede ACL udskiftning, da en sådan graft vil have svagere indledende mekaniske egenskaber end en sene allograft.

Nærværende undersøgelse har udviklet en model af ACL rekonstruktion med en acellulær elektrospundet transplantat i en athymiske rotte, baseret ud ændringer af en tidligere beskrevet rotte autotransplantat model ^17-22. Vi demonstrerede udarbejdelsen af ​​tæt alliancefrie collagen hele transplantatet med en samtidig forbedring af belastning til fiaskoaf implantatet over tid. Denne undersøgelse giver også proof of concept for ansættelse denne model i fremtiden for at evaluere forskellige væv-manipuleret transplantater til ACL rekonstruktion. Især athymiske rotter muliggør podning af xenogene donorceller.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medical grade ester terminated poly (ε-caprolactone), granule form (MW = 110,000)	Lactel Absorbable Polymers		Custom synthesized polymer to desired molecular weight
1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol	Sigma-Aldrich	105228	Solvent for PCL polymer
18 G x 1½" bevel needle	BD Medical	305196
Remote Infuse/Withdraw Programmable Syringe Pump	Harvard Apparatus	702101
VersaLaser VLS2.30 Laser Engraver	Microgeo USA	VLS2.30
Expanded Plasma Cleaner 115 V	Harrick Plasma	PDC-001	Plasma etch just prior to collagen coating for surface modification
PureCol Collagen Standard Solution, 3 mg/ml	Advanced Biomatrix	5015-A	Mix 8:1:2.5 solution of PureCol, 10x PBS, 0.1 N NaOH 1:9 in 1x PBS
Suture, 5-0 Vicryl	Henry Schein	1086471
Suture, 4-0 Vicryl	Henry Schein	6540072
Sharp-pointed Dissecting Scissors (Straight; 4.5 inch)	Fisher Scientific	8940
Buphrenorphine hydrochloride	Sigma-Aldrich	B9275	Use 0.03 mg/kg for both intra- and post-operatively for pain control
Ampicillin, injectable	Henry Schein	1185678	Use 25 mg/kg subcutaneously during the procedure
K-wire, 1.6 mm	Spectrum Surgical	SI040062
Keith Needle, Straight 1½"	Delasco Dermatology Lab & Supply	KE-112
Immunocal Decalcifying Solution	Fisher Scientific	NC9491030
Opticryl Acrylic Resin Bone Cement (PMMA) (Monomer and polymer)	US Dental Depot	OPTICRYL 100410
Instron Model 5564 Tensile Testing Machine	Instron	5564	Any comparable tensile testing apparatus is suitable