Introduction
Rupture du ligament croisé antérieur (LCA) est une de la plupart des lésions ligamentaires du genou communes 1. Parce que la rupture de l'ACL est incapable de guérir sans intervention chirurgicale, les limitations dans les activités de la vie quotidienne ainsi que la participation à des activités sportives en voiture plus de 175 000 patients de subir une chirurgie chaque année 2, avec un coût estimé à un milliard de dollars par an 3. Actuellement, soit autogreffe ou allogreffe tendon est utilisé pour la reconstruction du ligament. Bien que les taux de réussite élevés peuvent être atteints à la fois avec autogreffe et allogreffe de remplacement, des complications graves sont associés à ces options de reconstruction 4. autogreffe de tissu est associé à morbidité du site donneur et est limité dans l'approvisionnement, en particulier en cas de re-rupture ou blessures multi-ligamentaire. D'autre part, le tissu d'allogreffe est liée à l'intégration de la greffe retardée, la réponse inflammatoire indésirable, risque infectieux théorique, et limité suppLy 5. Greffons non dégradables synthétiques ont été développés dans les années 1970 et 1980, mais ont été entravées par une rupture prématurée de greffe, les réactions de corps étranger, une ostéolyse et la synovite 6. À la suite de ces graves préoccupations, il n'y a actuellement aucun greffes synthétiques disponibles pour une utilisation clinique aux États-Unis.
En raison de ces limitations avec des options de greffons existants et aux développements récents de la biologie, l'ingénierie et la médecine régénérative, il ya eu beaucoup d'intérêt dans une solution de l'ingénierie tissulaire pour ACL greffage. Stratégies d'ingénierie tissulaire actuelles emploient des matériaux biologiques et synthétiques dégradables pour permettre la croissance du tissu hôte tout en évitant les contraintes liées à l'implantation permanente matière synthétique 7.
La polycaprolactone (PCL) est un polymère biodégradable qui est approuvé par la FDA pour un certain nombre d'applications médicales, y compris l'adhérence barrière et Pansement 8, qui a été used dans une grande variété d'applications, notamment vasculaire, os, du cartilage, des nerfs, la peau, et de l'ingénierie de tissu oesophagien 5,9-16. Biocompatibilité favorable, relativement longue in vivo de demi-vie, une résistance mécanique suffisante et une élasticité élevée contribue à la popularité de ce polymère dans l'ingénierie tissulaire. Dans un modèle de rongeur de la cicatrisation des plaies, implanté PCL électrofilé se est révélée être non immunogène et à intégrer dans le tissu local sans effets indésirables 13. Une image SEM de électrofilé PCL est illustrée à la figure 1.
Avec actuelle FDA normes de réglementation, l'efficacité et la sécurité dans les deux modèles petits et grands animaux qui serait nécessaire pour une PCL ou tout autre greffe ACL conçu pour se déplacer dans les essais cliniques aux États-Unis. En outre, des conditions in vivo peuvent souvent augmenter les propriétés d'un tissu greffé LCA in vitro d'ingénierie. Un modèle de rat de reconstruction du LCA autologue avec fléchisseur digitorum tendon du long a été décrit précédemment, dans lequel la LCA natif a été sectionné, du fémur et du tibia tunnels ont été forés, et la greffe a été adopté et maintenu en place avec une suture 17-22. Dans cet article, nous allons décrire une modification de ce modèle pour l'évaluation des remplacements ACL ingénierie plutôt que pour la reconstruction basée autogreffe (Figure 2).
Bien que de nombreux modèles animaux existent pour l'ingénierie tissulaire de ligament, le rat est avantageuse par rapport à de plus grands modèles pour un certain nombre de raisons. Ces avantages comprennent plus facile élevage et la manipulation, moins de considérations éthiques, et de 17,23 coût réduit. En outre, le modèle de rat a été largement utilisé comme modèle pour la régénération des tissus orthopédiques, y compris du cartilage, des tendons, os et l'ingénierie tissulaire 24. En particulier, les rats nude athymiques ont été choisis en raison de leur manque de réponse immunitaire à médiation cellulaire 25, permettant l'implantation éventuelle ocellules du donneur xénogéniques f dans ce modèle pour améliorer encore la greffe d'ingénierie à l'avenir. Dans le présent document des méthodes, nous décrivons la fabrication et l'implantation chirurgicale d'un acellulaire, greffé de polymère biodégradable dans un modèle de rat athymique de reconstruction du LCA.
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Protocol
NOTE: Toutes les chirurgies animales ont été approuvés par le personnel vétérinaire et animale comité de l'utilisation locale avant de commencer les expériences.
1. Préparation de électrofilées polycaprolactone échafaudages
- Peser et dissoudre l'ester de qualité médicale à terminaison poly (ε-caprolactone) sous forme de granulés dans le 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol pour créer un 10% p / p de la solution polymère PCL. Laissez le bruit de solution en utilisant une plaque d'agitation pendant au moins 3 heures pour assurer une solution homogène.
- Electrospin la solution PCL pour créer un brassard de fibres PCL très alignés pour échafaudage fabrication.
- Préparer la configuration d'électrofilage dans une hotte chimique avec le ventilateur en tout temps. Il se agit d'une grande boîte acrylique qui servira de support à vide isolé pour le procédé d'électrofilage et présente des points d'entrée pour la solution source de PCL entraîné par une source de tension, le mandrin collecte de motorisation, et un orifice de vide. Nettoyez le Acryliboîte de c soigneusement avec de l'éthanol et de couvrir toutes les surfaces avec des feuilles de Parafilm pour éliminer toutes les impuretés qui peuvent compromettre la qualité du produit électrofilé.
- Charge environ 3 ml de la solution ci-dessus dans une seringue de 10 ml avec une extrémité franche 18 G, une aiguille de ½ pouce. Retirer les bulles d'air en poussant la seringue jusqu'à. Solution de verrouillage dans une pompe à seringue programmable. Insérer l'aiguille à travers un petit trou dans la surface acrylique tout en laissant environ ½ pouce de l'aiguille à l'extérieur de la boîte acrylique pour la fixation du fil de source de tension.
- Utilisez un 30 mm tournant tour mandrin le collecteur pour les fibres PCL très alignés; couvrir le mandrin hermétiquement avec une mince bande de papier d'aluminium. Verrouiller le mandrin dans le moteur sur le côté opposé de la boîte d'environ 15 cm de l'aiguille de la seringue.
- Insérer le tuyau en plastique dans l'orifice de vide et se connecter à la source de vide de la hotte. Allumez la source de vide et couvrir la boîte en acrylique avec un couvercle.
- Set le débit de la pompe de seringue programmable à 2,5 ml / h perfusion. Allumez le moteur pour faire fonctionner le mandrin à 3450 rpm et fixez le fil positif de la source de tension à la pointe de l'aiguille à l'extérieur de la boîte en utilisant une pince crocodile.
- Une fois la perfusion de la solution PCL a commencé, tourner sur la source de tension et réglé à une tension de fonctionnement de 20 kV.
- Infuser la solution pendant 12 min à créer une manchette homogène à partir de 0,5 ml de la solution PCL.
NOTE: En moyenne, chaque revers a assez de matériel électrofilé pour créer deux feuilles de six bandes, qui peuvent être utilisés pour créer un total de trois à quatre couches échafaudages.
- Laser couper le brassard PCL pour former de multiples petites feuilles sur un VersaLaser Cutter 2.3 tourne à faible vide, 10,0 keV tension d'atterrissage, 6,4 mm distance de travail, et le diamètre de la sonde de 3,0.
NOTE: Dans cet exemple, une conception assistée par ordinateur a été utilisé pour charger le coupe pour obtenir plusieurs feuilles de 1,5 mm x 35 mm x 150 um échafaudages avecrépartie uniformément 150 um de diamètre aux trous 15% de la surface des pores. - Gravure plasma échafaudages PCL utilisant un nettoyeur à plasma pour induire une hydrophilie de la surface PCL avec une accélération d'ions. Réglez le vide à 450 mTorr et le traitement des échafaudages pendant 30 secondes à puissance élevée (29,6 W).
- Baigner les échafaudages à 70% d'éthanol dans un environnement stérile.
- Enduire les échafaudages individuels avec du collagène pour faciliter l'adhérence et la prolifération cellulaire in vivo.
- Créer une solution de revêtement de collagène par dilution d'une 8: solution stérile de 2,5 Purecol collagène de 3 mg / ml de solution standard, 10x PBS et 0,1 N de NaOH 1: 9 à 1 1 x PBS à 4 ° C. Mélanger soigneusement pour assurer l'homogénéité solution.
- Manteau individuelle 1,5 mm x 35 mm x 150 um échafaudages avec un film en couche mince de la solution de collagène ci-dessus. Laisser sécher pendant 24 heures dans un environnement stérile.
- Utilisation 5-0 sutures Vicryl, empiler et apposer quatre individuelle 1,5 mm x 35 mm x 150 um échafaudagesutilisant un Krackow le point de créer un 0,6 mm d'épaisseur finales multicouche, échafaudage, revêtue de collagène qui est prêt pour l'implantation.
2. Protocole de Chirurgie Rat
- Induire une anesthésie en plaçant rat dans la chambre d'inhalation et offrant 2% d'isoflurane avec 2 L / min d'oxygène. Confirmez le rat est anesthésié correctement en appliquant une pression à Hind pied et d'évaluation pour toute réponse.
- Sur la table de retour non stérile, injecter sous-cutanée de 25 mg / kg ampicilline et 0,03 mg / kg de buprénorphine.
- Appliquer une pommade ophtalmique pour les yeux. Clip de la fourrure de la patte postérieure opératoire et prép le site chirurgical avec trois gommages alternées de chlorhexidine et 70% d'éthanol.
- Transférer le rat à la table d'opération, sur un bloc chauffé pour éviter l'hypothermie. Nez sécurisé cône, et de maintenir l'anesthésie par la procédure avec 2% d'isoflurane dans 2 L / min d'oxygène, livré cône de nez. Drapé de manière stérile, en laissant la branche opératoire exposé.
- Faire une incision verticale médiane 2 cm de long pour le genou, centrée au niveau de la rotule. Rentrer la peau latéralement jusqu'à l'incision est centrée sur le genou.
- Utiliser un scalpel pour faire une arthrotomie parapatellaire interne en coupant simplement en dedans de la rotule et se étendant de manière proximale au niveau de la jonction musculo du quadriceps et de manière distale au niveau de l'insertion du tendon rotulien sur le tubercule tibial. Prenez soin de ne pas couper les tendons rotuliens ou quadriceps.
- rotule de sortie latéralement en faisant une incision verticale de 1 cm à travers la capsule du genou juste en dehors du tendon rotulien.
- Se assurer que le genou est en extension. Prenez une paire de ciseaux fins et passer sous la rotule de dehors en dedans. Étaler les ciseaux à quelques reprises afin que le mécanisme extenseur peut être traduit de chaque côté.
- Bien que la flexion til genou, la rotule traduire latéralement pour exposer l'intérieur de l'articulation du genou. Assurer une visualisation claire de l'échancrure intercondylienne et condyle fémoral. Avec un scalpel, sectionner l'ACL et PCL dans l'encoche.
- Charge perceuse avec un k-fil 1,6 mm. Placez la pointe k-fil sur l'origine ACL dans l'échancrure intercondylienne. Percer superolaterally et de visualiser le point de sortie sur l'aspect externe du fémur, en supprimant toute tissus mous que nécessaire avec un scalpel. Passez le k-fil et à quelques reprises pour assurer le passage clair pour la greffe.
- Placez le k-fil sur l'empreinte ACL sur le plateau tibial. Percer antéro-externe et visualiser point de sortie sur le tibia proximal antérolatérale. Utilisez scalpel pour effacer tissus mous que nécessaire pour que le point où le k-fil sort du tibia est totalement visible.
- Passez une aiguille Keith raccourcie (idéalement pas plus de deux pouces de long) à travers le tunnel de fémur. Faire passer les deux extrémités de suture de l'une des extrémités de la greffe dans le chas de la Kaiguille de eith. Utilisation de l'aiguille pour tirer une extrémité du greffon dans le tunnel fémoral.
- Répéter l'étape précédente pour passer l'autre extrémité du greffon dans le tunnel tibial.
- Utilisez 4-0 Vicryl suture pour fixer la fin fémorale de la greffe de périoste entourant ou autre tissu mou avec un point figure-de-huit. Manuellement la tension de la greffe avec le genou en extension. Apposer la fin tibial de la greffe de périoste entourant ou autre tissu mou avec un point figure-de-huit.
- Utilisez une paire de ciseaux pour couper l'excès de greffe sur les deux extrémités, laissant 1-2 mm à chaque extrémité passé le point figure-de-huit.
- Étendre le genou et réduire la rotule. Utilisation 4-0 vicryl, placer un seul point figure-de-huit pour fermer la capsule articulaire médial, empêchant subluxation latérale de la rotule.
- Fermez la peau avec un subcuticulaire 5-0 Monocryl ou Vicryl surjet, avec soin de ne pas suturer le muscle sous-jacent ou avoir une suture visible une fois la peau est fermée.
- Injerats ct voie sous-cutanée avec la buprénorphine tous les 12 h pour un total de trois jours après l'opération. Vérifiez site chirurgical pour tout drainage ou déhiscence de la plaie au moment de l'injection. Boiteux et peu d'enflure sont normaux dans les premiers jours après la chirurgie, mais rapidement répondre aux préoccupations postopératoires en collaboration avec le personnel vétérinaire. L'animal peut être revenir à un logement social à deux semaines après l'opération, lorsque les incisions chirurgicales sont complètement guéries.
3. Protocol Data Collection
- Au moment du sacrifice, asphyxier rats individuellement dans une enceinte fermée de CO 2 suivie d'une thoracotomie.
- Récolter deux membres chirurgicalement reconstruits et controlatérale en séparant à l'articulation de la hanche.
- Pour les membres reconstruits, enlever tous les tissus mous, y compris le ligament croisé postérieur et les restes de la LCA natif chirurgicalement perturbé, par dissection fine pour isoler seulement le fémur, le tibia et la greffe. <li> Pour les membres controlatéraux, enlever tous les tissus mous à l'exception du LCA natif ainsi que le fémur et le tibia par dissection fine.
- Utilisation d'un outil rotatif tel que Dremel, pour supprimer tout sauf ¾ de 1 cm de l'os à partir de chaque extrémité de l'ensemble fémur-tibia par greffage.
- Au cours de ce processus et tout au long tests biomécaniques, régulièrement et fréquemment pulvériser les régions ligamentaires avec du sérum physiologique pour éviter la dessiccation du genou récoltée qui peuvent modifier les résultats faussement.
- Fixez le fémur et le tibia en enveloppant 28 G fil d'acier galvanisé autour de l'épiphyse de chaque os séparément. Ce est pour éviter que les données de tests biomécaniques inexactes de rupture en traction prématurée de l'échantillon à l'os plutôt qu'à le ligament d'intérêt.
- Pot fémur dans un mélange de ciment polyméthylméthacrylate (PMMA) de l'os. Pour ce faire, mélanger les deux composants du ciment et d'utiliser immédiatement le mélange visqueux pour sécuriser le fémur dans le métal, recouvrant complètement la diaphyse de l'os dans le pot cimentée avec l'épiphyse et le ligament fixé librement saillante. Laisser polymérisation radicalaire spontanée de transformer progressivement les composants mixtes visqueux à un matériau pâteux et finalement dans une matrice durcie solide.
NOTE: Ce processus prend plusieurs minutes et peut être contrôlée en étudiant manuellement la température d'un bolus fabriqué à partir dele ciment restant; la température doit augmenter de manière transitoire au cours de la réaction de polymérisation exothermique et se abaisser à la température ambiante après la solidification de matériaux. - Répétez le même processus ci-dessus pour cimenter le tibia, sauf tout en conservant le ligament du genou à 20 ° de flexion pour les essais mécaniques idéale.
- Monter le complexe fémur, tibia cémenté par greffage sur un appareil d'essai de traction, et pour préparer la charge d'enregistrement et de déplacement en fonction du temps à partir du début de la tension à l'échec. Dans cet exemple, nous avons utilisé un modèle Instron 5564 avec une cellule de charge de 1 kN.
- Pré-tension de la greffe à 2 N à un débit de 0,5 N / min rampe et ensuite tester la greffe à l'échec à une vitesse de 0,5 mm / s souche. Pendant le processus, assurez-vous que le ligament ne parvient pas à la mi-substance et que le fémur et le tibia sont osseuse sécurisé et pas prématurément à défaut, qui peut évaluer à tort propriétés biomécaniques du ligament testé.
- Utilisez la charge déplacement générécourbes pour calculer la charge de rupture et la raideur du ligament testé.
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Representative Results
Dans notre expérience de 92 chirurgies de rat par un seul chirurgien, le temps moyen de fonctionnement de l'incision à l'achèvement de la plaie était de 16,9 min, avec un écart type de 4,7 min. Au moment du sacrifice, les rats pesaient 356 ± 23 g. Tous les rats ont toléré la chirurgie bien, et ont connu aucune complication. Immédiatement après la chirurgie, les rats ont été notés à porter le poids sur l'extrémité opérationnelle, mais présentaient une légère claudication. D'une semaine post-opératoire, tous les rats ont été ambulants sans boiter appréciable. Les animaux tous pris du poids régulièrement au cours de l'étude, sans anomalies observées dans les habitudes d'alimentation, la miction ou la défécation. Cliniquement, aucune déhiscence de la plaie brute, érythème, gonflement, épanchement, ou de drainage a été observée après l'opération.
Les 92 interventions chirurgicales rat mentionnés ci-dessus ne ont pas été effectués dans le but essentiel de ce manuscrit méthodes. Au contraire, ils ont été utilisés pour tester différentes conditions de greffage d'ingénierie. Bien que la detailed essais mécaniques et les résultats histologiques sont en dehors de la portée du présent document, plus de détails peuvent être trouvés dans un article de Leong et al. 26. En bref, à 16 semaines après la reconstruction, l'analyse histologique du genou en coupe démontré que la matrice d'échafaudage se est largement infiltré par les fibroblastes sécrétant collagène éosinophile une bonne intégration dans les tunnels osseux (Figure 3). A ce moment, l'échafaudage a été complètement résorbé et aucune preuve du polymère a été visualisé. En outre, l'immunohistochimie pour le marqueur CD68 des macrophages démontré réponse inflammatoire minimale à 16 semaines après l'intervention (figure 4).
Propriétés biomécaniques ont été évalués immédiatement après le sacrifice. Tous les échantillons testés ont échoué à la mi-substance (Figure 5). En utilisant des courbes de charge-déplacement générées par les essais de traction (figure 6), la charge de rupture et la rigiditéont été calculés pour chaque groupe. À 16 semaines après l'implantation, la greffe de polymère électrofilé avait environ le double de la charge de pointe et de la rigidité de la greffe testés immédiatement après l'implantation, mais ces valeurs étaient inférieures à la LCA natif 26.
Figure 1. Image MEB d'électrofilé polycaprolactone échafaudage avec des fibres alignées. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Modèle de rat athymique de reconstruction du LCA. (A) d'isolement du tendon rotulien intermédiaire d'une incision de la peau parapatellaire interne. (B) Le forage du Tunne fémoralel aide de 1,6 mm k-fil. (C) Le forage du tunnel tibial. (D) Placement de 1,2 mm aiguille Keith travers tunnel fémoral de tirer à travers la greffe. Greffe de polycaprolactone (E) électrofilées tiré à travers tunnel fémoral. (F) Graft tiré à travers deux tunnels fémoral et tibial, avant que les extrémités sont taillées et suturées à périoste, et une fermeture en couches est effectuée. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. hématoxyline et éosine de greffe de polymère électrofilé (en haut) au tunnel tibial osseuse (à gauche), midsubstance (au centre), et le tunnel de fémur (à droite). A titre de comparaison, ACL native est représentée (en bas), lors de l'insertion tibiale ( gauche), midsubstance (CEnter) et l'origine fémorale (à droite), 10X. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. colorimétrique coloration immunohistochimique pour CD68, un marqueur pour les macrophages. Qualitativement, il semble y avoir une coloration légèrement plus positif dans le tunnel osseux à 8 semaines que dans la zone intra-articulaire de la prothèse ou à 16 semaines post-op. Il semble y avoir une inflammation minimale dans les greffes. Toutes les images sont 20X. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. Les images des essais mécaniques de greffe de électrofilé implanté, ce qui démontre l'échec de la greffe midsubstance. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6. Exemple de courbe de charge-déplacement pour génie tissulaire ACL greffé à 16 semaines après l'implantation dans le modèle de rat athymique. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
ACL blessures sont une condition commune en chirurgie orthopédique de sport, avec des options limitées pour la reconstruction à l'heure actuelle. Afin de développer un substitut d'ingénierie tissulaire appropriée pour l'ACL qui permettra la régénération in vivo, un modèle animal approprié est nécessaire. Dans cette étude, la fabrication d'un greffon conçu biodégradable est décrite, de même que son implantation in vivo en utilisant un modèle de reconstruction du LCA reproductible dans un rat athymique. Ce modèle peut être utilisé pour évaluer les différentes greffes d'ACL de l'ingénierie tissulaire composés de différents biomatériaux, y compris les greffes cellulaires et ceux présentant des facteurs de croissance Incorporated.
Dans cette étude, nous avons testé un acellulaire, électrofilé polycaprolactone greffe avec des fibres alignées. Des études antérieures de l'ingénierie tissulaire reconstruction ligamentaire ont implanté greffons tressés ou extrudés en une variété de matériaux, y compris la soie, le PLLA et le polyuréthane 27-29. Aucun de ces matériaux a entraîné à la fois une intégration réussie de la greffe et de récapitulation des propriétés mécaniques des ACL 7. Alors que de nombreux polymères ont le potentiel pour une utilisation dans la reconstruction de ligament, cette étude a examiné PCL car il est biologiquement inerte, non toxique, se dégrade lentement in vivo, et est facilement fabriqué en une 30 conformation souhaitée. PCL est également mécanique robuste et montre peu de déformation plastique sous contrainte mécanique 30. Son utilisation a été établi dans la littérature de l'ingénierie tissulaire osseuse selon un réservoir fiable pour la minéralisation et le dépôt de collagène de type I en raison de sa structure de nanofibres alignées lorsque électrofilage 31. En outre, il a été montré que la surface au volume et à haute échelle de longueur de diffusion courte des petites fibres d'un diamètre de tapis PCL électrofilées sont favorables pour la livraison contrôlée de médicaments et l'utilisation dans l'ingénierie tissulaire 31.
On a constaté queles greffons implantés étaient biocompatible basée sur un manque de réaction indésirable clinique, et de faciliter l'infiltration de cellules natif comme on le voit en histologie à 16 semaines post-opératoire. Nous avons utilisé un modèle animal athymiques dans cette étude car elle est la première étape d'un projet en deux étapes qui finira par utiliser des cellules humaines implantées avec le greffon, et un modèle athymiques réduirait préoccupations concernant le rejet des cellules humaines. L'échafaudage de polymère électrofilé facilité l'alignement à la fois de cellules et la matrice dans la LCA régénéré. Comme on le voit dans la section transversale de la greffe, la majorité des cellules ont été alignés dans la direction des fibres. Les greffons implantés ont montré une augmentation des propriétés mécaniques au fil du temps. Charge à la rupture des greffons polymériques doublé par rapport à l'ACL reconstruit immédiatement après l'opération. Alors que la charge de pointe et de la rigidité de la greffe PCL peut sembler faible par rapport à ACL natif, il est important de se rappeler que ces résultats doivent être considérés à la lumière de la fagir que même la norme de référence actuelle, autogreffes ou allogreffes, ne sont pas en mesure d'atteindre la résistance mécanique de l'ACL en bonne santé en 16 semaines après l'opération. Par exemple, Xu et al., Rapporté sur une autogreffe ACL dans un modèle de lapin, dans lequel la charge de pointe était de 20% -35% et la rigidité est de 23% -36% de celle de LCA natif sain de 6 32 mois après l'intervention. En outre, une étude d'allogreffe dans un modèle canin montré environ 30% de la charge de pointe et de 40% de la rigidité de LCA natif de 30 33 semaines après l'intervention.
Même se il est en dehors de la portée du présent document, d'autres analyses peuvent être effectuées pour évaluer la qualité de la greffe après l'utilisation de ce modèle animal. Cela inclut, mais ne est pas limitée à l'imagerie bioluminescente ou des rayons X et la tomodensitométrie in vivo, et une multitude de taches et des dosages tels que des marqueurs pour l'immunohistochimie du collagène ou des marqueurs inflammatoires. Par exemple, nous l'avons déjà publié des résultats sur la quantification des co alignésllagen utilisant des fibres de picrosirius coloration au rouge après l'implantation des échafaudages PCL électrofilées implantées dans ce modèle animal 26.
Les limites potentielles de cette étude comprennent le choix du modèle animal lui-même. Les différences inhérentes à l'anatomie et de la marche chez le rat quadrupède rapport à l'homme bipèdes signifient que la biomécanique de l'ACL ne varient et que la traduction de paramètres cliniques entre les modèles doivent être faites avec la connaissance de ces limitations. Toutefois, cette question est courante dans les études animales et ne nie pas l'importance ou potentiel de translation de cette recherche.
Il ya eu des recherches intéressantes sur les protocoles post-opératoires pour la reconstruction du LCA de rat en utilisant autogreffe qui peut être appliqué à notre modèle pour les remplacements ACL modifiées à l'avenir. Des dispositifs de fixation externes ont été utilisées pour immobiliser les rats post-opératoire, afin de permettre une meilleure cicatrisation tendon-os dans un modèle d'autogreffe de tendon19. En outre, il a été montré que retardé chargement cyclique, tel que le dispositif de flexion-extension décrit par Stasiak et al., 34, peut en outre améliorer l'incorporation 20 autogreffe. Toutefois, il a également été montré que de courte durée à faible amplitude du chargement cyclique peut également provoquer une inflammation accrue et une diminution de la formation osseuse à l'interface os-tendon 35. Une enquête plus approfondie doit être menée afin d'évaluer l'applicabilité de ces résultats à une électrofilé, ACL de remplacement à base de polymère, comme une telle greffe aurait des propriétés mécaniques initiales plus faibles que d'une allogreffe de tendon.
La présente étude a mis au point un modèle de reconstruction du LCA avec un greffon électrofilé acellulaire dans un rat athymique, basé outre des modifications d'un modèle de rat autogreffe décrit précédemment 17-22. Nous avons démontré l'élaboration de collagène dense alignés tout au long de la greffe avec une amélioration simultanée de la charge à l'échecde la greffe au cours du temps. Cette étude fournit également la preuve de concept pour l'emploi de ce modèle à l'avenir pour évaluer les différentes greffes de l'ingénierie tissulaire pour la reconstruction du LCA. En particulier, le rat athymique permet l'ensemencement des cellules de donneur xénogénique.
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Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier Gabriel Arom et Michael Yeranosian pour leurs contributions techniques aux itérations précédentes de ce projet. Ce projet a été financé par le clinicien-chercheur Grant formation OREF (NL), HH Lee Surgical Research Grant (NL), Veterans Administration BLR & D examen du mérite une I01 BX00012601 (DM) et l'appareil locomoteur transplantation Fondation Prix du jeune chercheur (FP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medical grade ester terminated poly (ε-caprolactone), granule form (MW = 110,000) |  Lactel Absorbable Polymers |
Custom synthesized polymer to desired molecular weight | |
| 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol | Sigma-Aldrich | 105228 | Solvent for PCL polymer |
| 18 G x 1½" bevel needle | BD Medical | 305196 | |
| Remote Infuse/Withdraw Programmable Syringe Pump | Harvard Apparatus | 702101 | |
| VersaLaser VLS2.30 Laser Engraver | Microgeo USA | VLS2.30 | |
| Expanded Plasma Cleaner 115 V | Harrick Plasma | PDC-001 | Plasma etch just prior to collagen coating for surface modification |
| PureCol Collagen Standard Solution, 3 mg/ml | Advanced Biomatrix | 5015-A | Mix 8:1:2.5 solution of PureCol, 10x PBS, 0.1 N NaOH 1:9 in 1x PBS |
| Suture, 5-0 Vicryl | Henry Schein | 1086471 | |
| Suture, 4-0 Vicryl | Henry Schein | 6540072 | |
| Sharp-pointed Dissecting Scissors (Straight; 4.5 inch) | Fisher Scientific | 8940 | |
| Buphrenorphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | B9275 | Use 0.03 mg/kg for both intra- and post-operatively for pain control |
| Ampicillin, injectable | Henry Schein | 1185678 | Use 25 mg/kg subcutaneously during the procedure |
| K-wire, 1.6 mm | Spectrum Surgical | SI040062 | |
| Keith Needle, Straight 1½" | Delasco Dermatology Lab & Supply | KE-112 | |
| Immunocal Decalcifying Solution | Fisher Scientific | NC9491030 | |
| Opticryl Acrylic Resin Bone Cement (PMMA) (Monomer and polymer) | US Dental Depot | OPTICRYL 100410 | |
| Instron Model 5564 Tensile Testing Machine | Instron | 5564 | Any comparable tensile testing apparatus is suitable |
References
- Fetto, J. F., Marshall, J. L. The natural history and diagnosis of anterior cruciate ligament insufficiency. Clin Orthop Relat Res. (147), 29-38 (1980).
- Kim, Y. M., Lee, C. A., Matava, M. J. Clinical results of arthroscopic single-bundle transtibial posterior cruciate ligament reconstruction: a systematic review. Am J Sports Med. 39 (2), 425-434 (2011).
- Andersson, C., Odensten, M., Gillquist, J. Knee function after surgical or nonsurgical treatment of acute rupture of the anterior cruciate ligament: a randomized study with a long-term follow-up period. Clin Orthop Relat Res. (264), 255-263 (1991).
- Klimkiewicz, J. J., Petrie, R. S., Harner, C. D. Surgical treatment of combined injury to anterior cruciate ligament, posterior cruciate ligament, and medial structures. Clin Sports Med. 19 (3), 479-492 (2000).
- Petrigliano, F. A., McAllister, D. R., Wu, B. M. Tissue engineering for anterior cruciate ligament reconstruction: a review of current strategies. Arthroscopy. 22 (4), 441-451 (2006).
- Groot, J. H., et al. Use of porous polyurethanes for meniscal reconstruction and meniscal prostheses. Biomaterials. 17 (2), 163-173 (1996).
- Leong, N. L., Petrigliano, F. A., McAllister, D. R. Current tissue engineering strategies in anterior cruciate ligament reconstruction. J Biomed Mater Res A. 102 (5), 1614-1624 (2014).
- Duling, R. R., Dupaix, R. B., Katsube, N., Lannutti, J. Mechanical characterization of electrospun polycaprolactone (PCL): a potential scaffold for tissue engineering. J Biomech Eng. 130 (1), 011006 (2008).
- Shao, Z., et al. Polycaprolactone electrospun mesh conjugated with an MSC affinity peptide for MSC homing in vivo. Biomaterials. 33 (12), 3375-3387 (2012).
- Tillman, B. W., et al. The in vivo stability of electrospun polycaprolactone-collagen scaffolds in vascular reconstruction. Biomaterials. 30 (4), 583-588 (2009).
- Wise, S. G., et al. A multilayered synthetic human elastin/polycaprolactone hybrid vascular graft with tailored mechanical properties. Acta Biomater. 7 (1), 295-303 (2011).
- Vargel, I., Korkusuz, P., Menceloğlu, Y. Z., Pişkin, E. In vivo performance of antibiotic embedded electrospun PCL membranes for prevention of abdominal adhesions. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 81 (2), 530-543 (2007).
- Cao, H., McHugh, K., Chew, S. Y., Anderson, J. M. The topographical effect of electrospun nanofibrous scaffolds on the in vivo and in vitro foreign body reaction. J Biomed Mater Res A. 93 (3), 1151-1159 (2010).
- Joshi, V. S., Lei, N. Y., Walthers, C. M., Wu, B., Dunn, J. C. Macroporosity enhances vascularization of electrospun scaffolds. J Surg Res. 183 (1), 18-26 (2013).
- Pham, Q. P., Sharma, U., Mikos, A. G. Electrospun poly(epsilon-caprolactone) microfiber and multilayer nanofiber/microfiber scaffolds: characterization of scaffolds and measurement of cellular infiltration. Biomacromolecules. 7 (10), 2796-2805 (2006).
- Vaz, C. M., van Tuijl, S., Bouten, C. V., Baaijens, F. P. Design of scaffolds for blood vessel tissue engineering using a multi-layering electrospinning technique. Acta Biomater. 1 (5), 575-582 (2005).
- Kawamura, S., Ying, L., Kim, H. J., Dynybil, C., Rodeo, S. A. Macrophages accumulate in the early phase of tendon-bone healing. J Orthop Res. 23 (6), 1425-1432 (2005).
- Hays, P. L., et al. The role of macrophages in early healing of a tendon graft in a bone tunnel. J Bone Joint Surg Am. 90 (3), 565-579 (2008).
- Dagher, E., et al. Immobilization modulates macrophage accumulation in tendon-bone healing. Clin Orthop Relat Res. 467 (1), 281-287 (2009).
- Bedi, A., et al. Effect of early and delayed mechanical loading on tendon-to-bone healing after anterior cruciate ligament reconstruction. J Bone Joint Surg Am. 92 (14), 2387-2401 (2010).
- Bedi, A., Kawamura, S., Ying, L., Rodeo, S. A. Differences in tendon graft healing between the intra-articular and extra-articular ends of a bone tunnel. HSS J. 5 (1), 51-57 (2009).
- Fu, S. C., et al. Effect of graft tensioning on mechanical restoration in a rat model of anterior cruciate ligament reconstruction using free tendon graft. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc. 21 (5), 1226-1233 (2013).
- Fan, H., Liu, H., Wong, E. J., Toh, S. L., Goh, J. C. In vivo study of anterior cruciate ligament regeneration using mesenchymal stem cells and silk scaffold. Biomaterials. 29 (23), 3324-3337 (2008).
- Landis, J. R., Koch, G. G. The measurement of observer agreement for categorical data. Biometrics. 33 (1), 159-174 (1977).
- Joshi, S. M., Mastrangelo, A. N., Magarian, E. M., Fleming, B. C., Murray, M. M. Collagen-platelet composite enhances biomechanical and histologic healing of the porcine anterior cruciate ligament. Am J Sports Med. 37 (12), 2401-2410 (2009).
- Leong, N. L., et al. In vitro and in vivo evaluation of heparin mediated growth factor release from tissue-engineered constructs for anterior cruciate ligament reconstruction. J Orthop Res. 10, (2014).
- Seo, Y. K., et al. Increase in cell migration and angiogenesis in a composite silk scaffold for tissue-engineered ligaments. J Orthop Res. 27 (4), 495-503 (2009).
- Freeman, J. W., Woods, M. D., Laurencin, C. T. Tissue engineering of the anterior cruciate ligament using a braid-twist scaffold design. J Biomech. 40 (9), 2029-2036 (2007).
- Bashur, C. A., Shaffer, R. D., Dahlgren, L. A., Guelcher, S. A., Goldstein, A. S. Effect of fiber diameter and alignment of electrospun polyurethane meshes on mesenchymal progenitor cells. Tissue Eng Part A. 15 (9), 2435-2445 (2009).
- Dash, T. K., Konkimalla, V. B. Poly-є-caprolactone based formulations for drug delivery and tissue engineering: A review. J Control Release. 158 (1), 15-33 (2012).
- Yoshimoto, H., Shin, Y. M., Terai, H., Vacanti, J. P. A biodegradable nanofiber scaffold by electrospinning and its potential for bone tissue engineering. Biomaterials. 24 (12), 2077-2082 (2003).
- Xu, Y., Ao, Y. F. Histological and biomechanical studies of inter-strand healing in four-strand autograft anterior cruciate ligament reconstruction in a rabbit model. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc. 17 (7), 770-777 (2009).
- Shino, K., et al. Replacement of the anterior cruciate ligament by an allogeneic tendon graft. An experimental study in the dog. J Bone Joint Surg Br. 66 (5), 672-681 (1984).
- Stasiak, M. E., et al. A novel device to apply controlled flexion and extension to the rat knee following anterior cruciate ligament reconstruction. J Biomech Eng. 134 (4), 041008 (2012).
- Brophy, R. H., et al. Effect of short-duration low-magnitude cyclic loading versus immobilization on tendon-bone healing after ACL reconstruction in a rat model. J Bone Joint Surg Am. 93 (4), 381-393 (2011).
