Abstract
Grænserne for optisk opløsning og udfordringen med at identificere specifikke protein befolkninger i transmission elektronmikroskopi har været forhindringer i cellebiologi. Mange fænomener kan ikke forklares ved in vitro analyse forenklede systemer og har brug for yderligere strukturel information på stedet, især i området mellem 1 nm og 0,1 um, for at blive fuldt forstået. Her elektron spektroskopisk imaging, en transmissionselektronmikroskopi teknik, der tillader samtidig kortlægning af fordelingen af proteiner og nukleinsyrer, og et udtryk tag, miniSOG, kombineres for at studere strukturen og organiseringen af DNA dobbelt-strenget pause reparation foci.
Introduction
På trods af de betydelige fremskridt i lysmikroskopi i de seneste år 1, celle-biologer stadig lider et hul i opløsning. Dette begrænser forståelsen af struktur og funktion i de grundlæggende cellulære processer, der involverer den koordinerede samspil mellem makromolekylære komplekser (fx i kromatin remodeling, DNA-reparation, transskription RNA og DNA-replikation). Selv om transmission elektronmikroskoper (TEM) s tilvejebringe den krævede opløsning, har det været en udfordring at definere disse processer strukturelt grund af manglende evne til at mærke specifikke proteiner samtidig være i stand til at bestemme den biokemiske sammensætning af det visualiserede strukturer. I mangel af interne membraner til at hjælpe differentiere nukleare strukturer, har kernen været særligt udfordrende. Electron spektroskopisk imaging (ESI) løser nogle af disse begrænsninger ved at tillade samtidig påvisning og differentiering af DNA, RNA og protEin-baserede nukleare strukturer 2-5.
Electron spektroskopisk imaging:
For at kortlægge elementært distributioner ved høj følsomhed og opløsning i elektron mikroskop, kan man bruge en billeddannende spektrometer, der udvælger elektroner, der er blevet uelastisk spredt gennem interaktioner med indre skalelektroner af et element i prøven 6. Fordi element-specifikke mængder af energi går tabt som følge af ionisering af atomer i prøven, kan disse elektroner adskilles og visualiseres under anvendelse af et spektrometer, der er knyttet til elektronmikroskop. Således analyse af spektret af de elektroner, der har interageret med modellen afslører kvalitative og kvantitative oplysninger om grundstofsammensætningen af prøven 7. Elektroner, der ikke mister energi, når de passerer gennem prøven findes i "nul-tab peak" af elektronenergi tabspektrum. Forekomsten af disse elektroner er relateret til massen, densitet og tykkelse af prøven og består af elektroner, der passerer gennem prøven uden at støde ind i prøven eller miste energi under passagen gennem prøven. Disse oplysninger kan være nyttige for absolut kvantificering af antallet af atomer af et specifikt element til stede i prøven 8.
Da biologiske prøver består hovedsageligt af lette elementer, der dårligt afbøjer elektronerne i den indfaldende stråle af TEM, farvningsmetoder hjælp tungmetaller salte har skal anvendes for at skabe kontrast i prøven. Manglende specificitet af de fleste af disse kontrastmidler og den manglende evne til at visualisere mere end én plet, hvor specificitet er muligt har begrænset værdien af konventionelle elektronmikroskopi i studiet af kernen. ESI har betydelige fordele i forhold til konventionelle TEM, især til undersøgelse af strukturer i cellekernen.Det er muligt at udnytte fosfor-rige natur DNA- og RNA-holdige makromolekylære komplekser at skelne nukleoprotein komplekser fra proteinkomplekser og løse forskellige nukleoprotein komplekser baseret på deres tæthed af nukleinsyrer. De resterende biologiske materiale kan afbildes baseret på dens overflod af nitrogen. Kortlægning netop disse to elementer og analyser af deres fordeling og relative forekomst inden for forskellige anatomiske strukturer giver os en masse oplysninger om kernen. For eksempel er det let at identificere kromatin og ribosomerne i kortet repræsenterer fosfor overflod. Den interchromatin plads, nukleare pore komplekser, og nukleare organer, på den anden side, kan let påvises i nitrogen kortbilledet.
Mini singlet oxygen generator-system (miniSOG)
Mens ESI er en kraftfuld teknik til at studere på stedet kromatin struktur, fordi det tagers fordel af de karakteristiske forhold i grundstofsammensætning mellem phosphor og nitrogen, grundstofsammensætningen kan normalt ikke anvendes til at skelne mellem forskellige populationer af protein-komplekser. Antistoffer mærket med små guldpartikler i nanometerområdet er ofte blevet anvendt til at kortlægge placeringen af enkelte molekyler. Da guldpartikler normalt er knyttet til et sekundært antistof, vises den inden for en omkreds på ca. 20 nm omkring epitop detekteres af det primære antistof. I post-embedding prøver kan antistoffer kun afsløre epitoperne, der udsættes på overfladen af sektionerne. Selv om det er muligt at bevise tilstedeværelsen af et antigen og relatere den til en vis anatomisk struktur af cellen, de oplysninger, der opnås, er ufuldstændig, idet de fleste af epitoperne er tilsløret af harpiks. Pre-embedding teknikker, der bruger lignende protokoller til dem, der anvendes til fluorescens mikroskopi, give adgang til antigener i helehele dybden af prøven, men de permeabilisering trin, der er nødvendige for at gøre det muligt for antistoffet at trænge ind i cellen kræver typisk fjernelse af lipidmembraner og fjerne komponenter, der ikke kan fastsættes af aldehyder. Desuden er den foretrukne aldehyd fiksativ for ultrastruktur præservering, glutaraldehyd, almindeligvis ødelægger epitoper og følgelig er paraformaldehyd typisk kræves. Dette er mindre effektive til protein-protein tværbinding. En anden ulempe ved antistoffer, der er mærket med en guld nanopartikel er, at guld er en meget elektron-tætte materiale, der skaber en stærk kontrast, der kan tilsløre interessante strukturelle detaljer af prøven, som har svagere kontrast.
Fremkomsten af grønt fluorescerende protein (GFP) som et udtrykt protein tag har forvandlet anvendelse af fluorescensmikroskopi for at besvare spørgsmål i cellebiologi. Mærkning af et protein med en lille fluorescerende domæne tillader kortlægning af dens fordeling in vivo 9. Reaktionsprodukter af HRP kan også diffundere væk fra det sted, generation, så at deres opløsning er værre end nanogold metode 10. For at omgå disse problemer blev Flash / ReAsH system udviklet 11. Den består af rekombinante fusionsproteiner, som har en tetracysteine motiv. Dette motiv tillader binding afen biarsenic fluorophor. Når den exciteres, den bundne flash eller ReAsH er i stand til at generere meget reaktive singlet oxygen og dermed photoconvert diaminobenzidin (DAB) i en polymer, der præcipiterer straks ved stedet for de mærkede proteiner. DAB polymer kan farves med osmiumtetroxid, som er elektron tæt og kan således anvendes til at kortlægge fordelingen af det rekombinante fusionsprotein i TEM.
I 2011, Shu et al. 10 præsenterede miniSOG, som består af en lille 106 aminosyrer fusion tag afledt af en flavoprotein af Arabidopsis, der er fluorescerende og i stand til at skabe mange singlet oxygenradikaler når den exciteres med 448 nm blå lys. Disse singlet oxygenradikaler kan bruges til foto-oxidere diaminobenzidin til dannelse af polymerer på og nær overfladen af den kodede protein, hvilket er betydeligt tættere end immunoguld mærkede antistoffer 11. Mens flashen / ReAsH system kræver at bringe fluorkrom og diaminobenzidin i cellerne inden man fotoomdannelse, det miniSOG systemet kræver kun diaminobenzidin og lys og derudover er omkring dobbelt så effektiv til polymerisering diaminobenzidin. Her er miniSOG anvendes i kombination med ESI med henblik på at kortlægge ultrastruktur DNA-reparation foci.
DNA-reparation foci (DRF)
Udbedrede DNA dobbelt strengebrud udgør en alvorlig trussel mod cellen, da de kan føre til translokationer og tab af genetisk information. Til gengæld kan det føre til ældning, cancer og celledød. Mange proteiner, som er involveret i DNA dobbeltstrengsbrud reparation ophobes i foci at samle omkring en DNA dobbeltstrengsbrud 12-14. Selv om deres funktion ikke er kendt, de repræsenterer sitet i kernen, der indeholder DNA dobbeltstrengsbrud og er stedet for DNA dobbeltstrengsbrud reparation.
DNA-reparation focI (DRF) er blevet karakteriseret ved fluorescensmikroskopi og de tjener som biomarkører for DNA-skader 12,15. De er massiv i forhold til størrelsen af den dobbelt-strenget pause og blev anset for relativt homogene indtil de seneste mikroskopi studier super-opløsning afslørede visse tegn på sub-opdelingen af molekyler inden for hver fokus 16. For at forstå, hvordan disse steder er organiseret, er det nødvendigt at visualisere alle de underliggende biologiske strukturer i forhold til hinanden. Dette kan ikke opnås ved fluorescens mikroskopi, men er muligt gennem elektronmikroskopi 17,18. Her beskrives en fremgangsmåde, der kombinerer elektron spektroskopiske billeddannelse med miniSOG metode til at illustrere potentialet i denne kombinerede fremgangsmåde til at undersøge ultrastrukturen af DNA dobbelt-strenget pause reparation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generering af miniSOG Cell-linjer
- Grow U2OS (human osteosarkom) celler i en 35 mm skål indeholdende 2 ml lav glucose Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM), der er suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) ved 37 ° C i en befugtet inkubator med 5% CO2 atmosfære.
- Transficere cellerne, når de er 80% sammenflydende ved lipofektion med renset transfektion kvalitet (A269 / 280-forholdet 1,8-2,0) plasmidkonstruktioner indeholder sekvenser for miniSOG og mCherry mærkede reparation proteiner i overensstemmelse med protokollen af producenten af transfektionsreagens 19. De miniSOG ekspressionsplasmider kan bestilles fra Tsien-Lab: http://www.tsienlab.ucsd.edu/Samples.htm
- Sortere de celler, der udtrykker det rekombinante protein med miniSOG og mCherry tag ved fluorescensaktiveret cellesortering to dage efter transfektion. Saml cellermed mellemliggende fluorescensintensitet for at undgå celler, der overudtrykker 20.
- Kultur de positive celler på en 10 cm skål i 10 ml DMEM-medium, der er suppleret med 10% FBS og 0,6 ug / ml selektionsmidlet G418 (Geneticin).
- Efter synlige kolonier er opstået på pladerne, skærm for mCherry positive kolonier under anvendelse af et inverteret fluorescensmikroskop og tegne cirkler omkring dem (på bunden af pladen) med en permanent markør. Brug en lav forstørrelse luften objektivlinsen (f.eks 10x) og samle kloner ved anvendelse af steril teknik ved omhyggeligt skrabe kolonierne ud og langsomt suger dem i en steril 1000 pi pipettespids.
- Expand de valgte kolonier og fryse dele af dem ved hjælp af vækstmediet beskrevet i trin 1.1 suppleret med 10% dimethylsulfoxid. Test cellerne i DRF dannelse ved at dyrke dem på sterile 18 x 18 mm 2 dækglas og udsætte dem for2 Gy stråling. De bestrålede celler, der stabilt udtrykker et miniSOG mCherry mærkede reparation protein skal vise typiske fokale mønster karakteristisk for DSBs når visualiseret med et fluorescensmikroskop ved anvendelse af et filter-sæt til billeddannelse mCherry.
2. Cellekultur
- Kultur U2OS celler, der stabilt udtrykker miniSOG og mCherry mærkede reparation proteiner under betingelserne, der er beskrevet i trin 1.1. Grow celler til 80% sammenflydning i en 35 mm diameter glasbund skål indeholdende 2 ml DMEM. Sørg for, at den lim, der binder dækglasset til plast og den anvendte plast er resistent over for vandige og alkoholiske opløsninger og kunne tåle harpiks brugt!
- Før udførelse af eksperimentet, skitsere et lille område på ca. 1 mm2, som indeholder celler, der udtrykker de ektopiske proteiner ved at skrabe med en steril diamant pennen ved hjælp af et fluorescensmikroskop for at identificere området af interesse. Alternativt kan en glasbund fad that indeholder et dækglas med en pre-ætset gitter indbygget i dækglasset.
BEMÆRK: Hvis ved hjælp af høj kvalitet korrelationsmaalinger mikroskopi kombinerer ESI og fluorescens mikroskopiske billeder 21, skal du sørge for, at tykkelsen af dækglasset er kompatibel med olie nedsænkning mål. Det bør have en tykkelse nr 1,5 (0,16-0,18 mm). Vælg et område tæt på centrum af skålen for området, der skal undersøges i TEM med henblik på at undgå problemer med polymerisation af harpiksen, som kan forekomme i nærheden af kanterne (se punkt 4,10-4,13).
3. DNA-skader Induktion
- Bestråle cellerne med gammastråling, bruge en radiomimetiske lægemiddel eller inducere skade ved laser micro-bestråling på en konfokalt mikroskop (f.eks som beskrevet i 18,22 eller 23).
- I dette eksempel bestråle cellerne med 2 og 6 Gy gamma-bestråling i en cæsium-137 strålekilde eller laser microirradiate ved hjælp af 405 nm solid state laser af et konfokalt mikroskop efter sensibilisering cellerne i 20 minutter med 0,5 ug / ml Hoechst.
4. Prøvefremstilling
- Fikseres cellerne med 1 ml 4% paraformaldehyd forsigtighed 0,1 M natriumcacodylatbuffer eller i 0,1 M phosphatbuffer, pH 7,4 i 30 minutter ved stuetemperatur i mørke.
ADVARSEL: Paraformaldehyd og natriumcacodylat er giftige! Bær handsker og bortskaffe de giftige stoffer i tilstrækkelig grad. - Vask cellerne to gange med 4 ml 0,1 M natriumcacodylat, pH 7,4 eller pH 7,4.
- Behandl fikserede celler med 2 ml 50 mM glycin, 5 mM aminotriazol og 10 mM kaliumcyanid PAS i 0,1 M natriumcacodylatbuffer eller 0,1 M phosphatpuffer (pH 7,4) (pH kontrolleres!) I 30 minutter for at blokere uomsatte aldehydgrupper og at undertrykke de reaktive oxygenarter genereret af hæm-grupper, som kan øge baggrunden.
ADVARSEL: Kaliumcyanid er ekstremt giftigt! Wøre handsker, arbejde under en hætte og bortskaffe de giftige stoffer i tilstrækkelig grad. Reaktionen er meget følsom over for pH, så det er vigtigt, at pH kontrolleres og præcise. - Optag feltet som blev valgt i trin 2.2 i 2D eller 3D på et omvendt fluorescensmikroskop, hvis der ønskes korrelationsmaalinger mikroskopi.
- Der fremstilles en 1 mg / ml diaminobenzidin-hydrochlorid PAS-opløsning ved at placere en 10 mg diaminobenzidin hydrochlorid tablet i et 2 ml mikrocentrifugerør. Tilføj 980 pi destilleret H2O og 20 pi koncentreret saltsyre (11,65 M) og blandes, indtil opløsningen er lysebrun og gennemskinnelige. Denne opløsning i 0,1 M phosphat eller 0,1 M natriumcacodylatbuffer fortyndes til en slutkoncentration på 1 mg / ml, mens justering af pH med natriumhydroxid til en pH på mellem 7,0 og 7,6 (pH 7,4 anbefales).
ADVARSEL: Diaminobenzidin er giftig! Bær handsker og bortskaffe de giftige stoffer i tilstrækkelig grad. - For fotooxidation, replace bufferen med 2 ml af en 1 mg / ml diaminobenzidin-hydrochlorid-opløsning i 0,1 M natriumcacodylatbuffer eller phosphatbuffer. Beskytte denne løsning fra lys og køle den ned på is til 4 ° C med henblik på at forøge opløseligheden af oxygen. Mætte opløsningen med oxygen ved gennembobling oxygen gennem opløsningen (brug en slange, der er indsat i opløsningen og forbindes til et oxygen flaske). PH kontrolleres igen, og juster om nødvendigt.
BEMÆRK: Det er afgørende for fotooxidation reaktion, pH-værdien er mellem pH 7,0 og pH 7,6. - Monter fad med de faste celler omhyggeligt på en omvendt fluorescens mikroskop udstyret med en 40x olie nedsænkning objektiv og flytte det til det område af interesse. Ophidse miniSOG tag med blåt lys ved hjælp af filter terninger for GFP eller fælles fiskeripolitik. MiniSOG har en maksimal excitation ved 448 nm med en skulder ved 473 nm 10.
- Fortsæt med belysningen, selv efter den grønne miniSOG fluorescens has helt forsvundet, og indtil den brune fotooxidationen produkt af den polymeriserede diaminobenzidin opstår i transmitteret lys kanal. Når oxidation produkt er synlig i de fleste celler, slukke fluorescensbelysning at stoppe fotooxidationen.
BEMÆRK: Foto-oxidation kan tage op til flere minutter, afhængigt af objektivlinsen, filter transmission bølgelængder og effektivitet og belysningskilden. - Postfix cellerne med 1 ml 2% glutaraldehyd i 0,1 M natriumcacodylat, pH 7,4 buffer eller phosphatbuffer pH 7,4 i 30 minutter.
- Fix membranerne af cellerne med 0,1% -0,5% osmiumtetroxid i 20 minutter i 0,1 M natriumcacodylatbuffer, pH 7,4 eller i 0,1 M phosphatpuffer pH 7,4.
BEMÆRK: Det anbefales at bruge den lavest mulige koncentration af osmiumtetroxid kræves for at stabilisere membranerne. Da de polymeriserede DAB bundfald har en høj tæthed af nitrogen, som kan påvises direkte ved hjælp af ESI, en stærkosmium farvning er ikke nødvendigt at identificere miniSOG-mærkede protein og kan være til skade for ESI. Osmiumtetraoxid er meget giftigt! Arbejde i et stinkskab og bortskaffe giftigt affald tilstrækkeligt. - Dehydrere cellerne gennem en ethanol-serien anvendelse af 30%, 50%, 70%, 90%, 98% 100% ethanol trin (hver 5 min). Efterfølgende inkuberes cellerne i en 1: 1 blanding af 100% ethanol og acrylharpiks (LR White) og sætte skålen på et rysteapparat i 4 timer for at lette infiltration ind i cellerne, før inkubering af cellerne i mindst et 4 timer i 100 % acrylharpiks (LR White).
- For at polymerisere harpiksen, afbrød låget af en mærket 2 ml mikrocentrifugerør med et barberblad og pels randen med acrylharpiks accelerator. Sørg for, at acceleratoren kun omfatter fælgen og ikke flyder ind i røret. Efterfølgende forsigtigt fylde røret ca. to tredjedele med LR White harpiksen ved anvendelse af en Pasteur-pipette. Pas på, at harpiksen ikke kommer i kontakt Vidh acceleratoren på fælgen!
- Fjern harpiks, som infiltrerede celler i skålen og placere skålen hovedet på opretstående mikrocentrifugerør således at bredden af røret næsten fuldstændigt fylder glasset dækket observationsvindue af skålen.
- Vent 1 til 2 min for acceleratoren at forsegle røret og dækglasset, derefter vendes røret, så at harpiksen i røret nu dækker cellerne.
- Sæt fadet med røret i en ovn ved 60 ° C og helbrede den i 12 timer.
- Når blokken er hærdet, fjernes skålen med den vedhæftede harpiks fyldt mikrocentrifugerør fra ovnen og adskille mikrocentrifugerør fra skålen. Lette adskillelsen af fryse-tø cykler i flydende nitrogen og varmt vand.
- Kassér glasbund skålen og omhyggeligt skar mikrocentrifugerør med et barberblad for at fjerne blokken.
- Mærk blok med en permanent markør.
- Brug et barberblad til at trim blokken, at intet andet end 1 mm 2-region, der indeholder området tidligere markeret med diamant eller wolfram pen (eller indeholder området med cellerne af interesse) forbliver.
- Monter blokeret et ultramikrotom, trim blokken med en kniven og skære ultratynde sektioner på ca. 50 nm ved anvendelse af en diamant kniv.
- Saml afsnittene om high-transmission 300 mesh net. Disse gitre har meget små gitter barer og således dækker færre celler i området af interesse.
- Coat afsnittene om gitrene med ca. 0,2-0,4 nm kulstof ved hjælp af en carbon coater at hjælpe med at stabilisere dem under elektronstrålen af TEM.
5. Elektronmikroskopi
- Indlæse net til et TEM, der er udstyret med en energi-filter. Efter at have indstillet mikroskopet og energien filter ifølge producentens anvisninger, inspicere cellerne på sektionerne i lav forstørrelse (normal transmission) og sammenligndem til fluorescensdata når det er hensigtsmæssigt (opnået i trin 4.4).
- Når en kerne med interessante funktioner (DNA-skader spor eller DNA-reparation foci) er fundet, skal du skifte til den energi filtrering mode og optage en tykkelse kort.
BEMÆRK: Denne procedure omfatter registrering af et nul-underskud og en ufiltreret billede. Tykkelser op til 0,3 betyde frit bane (30% af elektronerne i den indfaldende stråle bliver spredt af prøven) er tynde nok til at generere gode elementært kort. - Optag forholdet kort af phosphor og nitrogen under anvendelse af software, der styrer energi filter af mikroskopet anvendes. Optag Phosphor kort efter kantbilleder ved 175 eV energitab med en spaltebredde på 20 eV og præ-kantbilleder ved 120 eV energitab, også med en spaltebredde på 20 eV. For nitrogen- kort, optage indlæg kantbilleder på 447 eV med en spaltebredde på 35 eV og præ-kantbilleder på 358 eV, også med en spaltebredde på 35 eV.
BEMÆRK: Da indholdet af de afbildede elementer (phosphOrus og nitrogen) er relativt lav (ca.. 1%), vælg "Ratio Image" (kvalitativ elementært kort) over "3-vinduet-metoden" (kvantificere elementært kort) for at generere billeder med et bedre signal støjforhold.
6. Billedbehandling
- Åbn elementært forholdet kort i et billedbehandlingsprogram software, der kan håndtere filformatet af de overtagne billederne (fx Digital Micrograph). Kopier kvælstof kortet ind i den røde kanal og fosfor kortet ind i den grønne kanal af et RGB-billede, så oven og tilpasse kortene.
- Eksportere det sammensatte billede som en (TIFF) fil tiff. Åbn billedet i et billedbehandlingsprogram software, der kan bruge lag (f.eks Photoshop).
- Juster det dynamiske område for hver kanal ved at rescaling de minimale og maksimale værdier i billedet til en 8-bit datasæt (0 til 255).
- Fratræk phosphorindhold fra nitrogen kort (ved hjælp af"Lag" vindue) med henblik på at frembringe et kvalitativt kort, der viser fordelingen af protein.
- Konverter kortene af nukleinsyre (phosphor) og protein (nitrogen) oprettet i det forrige trin til "indekseret farve" og skabe et gult opslagstabel i CMYK farverummet for kort, der viser nukleinsyren distribution og en cyan opslagstabel at vise ikke-nukleoprotein kort. Farverne er valgt for at skabe maksimal kontrast mellem de to elementære kort.
- Opret et nyt billede, og importere kort, som viser fordelingerne af fosfor og protein som forskellige lag. Brug "skærm" gennemsigtighed tilstand for at se begge lag oven på hinanden.
- Åbn nul-tab billede erhvervet i trin 5.2. Dette billede repræsenterer et billede af det optagede område, der ligner en traditionel TEM billede, men kun indeholder elektroner, der har passeret gennem prøven uden at kollidere med modellen. Eksportdette billede som en TIFF-billede.
- Åbn den eksporterede nul tab billede i et foto editor og kopiere det ind i det øverste lag af billedet viser den elementære kortet. Juster billedet ved hjælp af "skærm" gennemsigtighed tilstand.
- Eventuelt tærskel nul-tab billede til segmentet det signal, der stammer fra miniSOG. Tilføj det resulterende billede som et separat lag som beskrevet ovenfor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ESI
Sammenligning ESI billeder af kernen (figur 1) med de konventionelle TEM billeder (f.eks, figur 7-1) viser en dramatisk stigning i anatomiske strukturer, der let kan skelnes. Kromatin kamme vises i gult, og det er ganske nemt at identificere de chromocenters i muse celler. Nukleoler nemt kan skelnes fra kromatin af deres runde struktur og anden farve, idet den formonterede ribosomer indeholder allerede høje mængder protein, som er rig på nitrogen, i tillæg til den RNA, som er rig på fosfor. Den perifere kromatin bor som et tyndt lag på grænsen mellem kernen og nukleare porer kan ses som nitrogenrige strukturer, der afbryder den perifere kromatin. Ofte hinden kan ses som et meget tyndt lag blå uden for den perifere kromatin. I cytoplasmaet, mange små partikler fosforrige kanses. Disse kan identificeres som ribosomer baseret på deres størrelse, overflod og placering uden for kernen. Den interchromatin rum kan ses som proteinrige område beliggende mellem kromatin. Dette indeholder nukleare organer og områder rige på små gule signaler, såsom ribonucleoprotein partikler og klynger af ribonucleoprotein granulat (figur 2). Sidstnævnte betegnes interchromatin granula-klynger og karakteristisk beriget med proteiner, der er nødvendige for præ-mRNA splejsning. Figur 1B, C og D illustrerer udseendet af andre kendte strukturer, såsom mitotiske kromosomer, centrosomer, mitokondrier og centromerer. I figur 2 er de trin, der anvendes til at generere sammensatte billeder farvede fra de rå elementært forholdet kort samlet. Fletning af fosfor kortet (grøn) og kvælstof kortet (rød) i RGB-farverum (øverste række) giver mulighed for en bedre vurdering af mængderne af de elementer i prøven. HoweveR, subtrahere fosfor signal at nedbryder bidrag nukleinsyreholdige strukturer fra nitrogen kort til opnåelse af proteinkort (cyan) og fusioneres med fosfor kort (gul) i CMYK farverum giver en mere tydelig visuel repræsentation af nukleoprotein og ikke-nukleoprotein (nederste række). Dette gør det muligt data, der skal lettere fortolket af enkeltpersoner uvante med teknologien.
Laser microirradiated celler, der udtrykker MDC1, 53BP1 og RAD52
På grund af brugerdefineret størrelse, form og placering af laser skader spor, regionen DAB aflejring i laser microirradiated celler er meget let at finde i TEM ved brug af miniSOG systemet. Billeder taget i lav forstørrelse transmission tilstand (dvs. konventionel lysfelt TEM) afslører de karakteristiske skader spor og kan sammenlignes med data, der blev optaget med et fluorescens mikroskop før indlejring.Dette er især nyttigt, hvis korrelative mikroskopi er bestemt, da det giver mulighed for nem identifikation og flytning af enkelte kerner. (Figur 2-4).
Det første eksempel (figur 3) viser en U2OS cellelinje stabilt udtrykker MDC1 miniSOG-mCherry. I en laser microirradiation eksperiment, rekruttering af MDC1 indeholder miniSOG og mChrerry tags var meget lig GFP-mærkede versioner af dette protein (data ikke vist). Fastsættelse cellerne 1 time efter DNA skader induktion og forberede prøven til TEM blev MDC1 skader spor let identificeres i de ultra-tynde sektioner i normal TEM-tilstand som mørke striber på tværs af de kerner, hvilket svarede meget godt til fluorescensdata ( Figur 3-5). Når man ser på fordelingen af proteinet, kunne en klar stigning i kvælstof signal observeret ved laser-beskadigede steder. Det skal her påpeges, at det primært er forårsaget af den polymeriserede diami nobenzidine, som er rig på kvælstof og forstærker signalet af miniSOG mærkede reparation protein, og ikke udelukkende gennem akkumulering af reparations proteiner i skaden sporet. Sammenligning af kromatinstrukturen i resten af kernen med strukturen i skaden spor viser en klar forskel. Den beskadigede kromatin (der er vist inden for de stiplede linjer i figur 3) forekommer mere dekondenseret i modsætning til den ikke-bestrålede chromatin, som forekommer i tykke kanter på nucleoplasm. Inden skaden spor, kunne nukleare organer (200-300 nm) (fremhævet med pile i figur 3 II2, IIb, IIc og IIIa), der er rige på MDC1-miniSOG protein, men fri for nukleinsyre også overholdes. Det ville være meget udfordrende at definere disse nukleare organer som kromatin-fri strukturer uden denne teknik. Det tyder også på et ekstra niveau af kompleksitet til skader websteder, der ikke forudsiges af den kendte biokemi MDC1.
ntent "> Ser man på skaden spor 53BP1 (figur 4), der blev oprettet ved hjælp af de samme betingelser som de tidligere beskrevne skader i MDC1-transficerede celler, kan meget lignende resultater observeres. Det signal, der blev produceret af foto-oxidation af Den miniSOG var overfyldt og fyldt op mellemrummet mellem folderne i kromatin. Stærkt farvede nukleare organer kunne også observeres (fremhævet med en pil i figur 4 D, E, F).Fra forsøg med RAD52-GFP konstruktioner, er det kendt, at RAD52 vil danne små lyse microcompartements 24 langs en laser-induceret skade spor. På grund af den resolution grænsen for konventionelle lys mikroskoper, har det været uklart, hvor stor disse strukturer virkelig er, og hvordan de relaterer til det beskadigede DNA. Ser man på TEM billede af laser-bestrålet U2OS kerner konstitutivt udtrykker RAD52-miniSOG-mCherry, blev størrelsen af disse organer målt til at være i gennemsnit (150-250 nm). Det erendnu mere overraskende at se på disse foci med ESI. I modsætning til de foregående eksempler, synes RAD52-miniSOG-mCherry foci skal organiseres helt anderledes langs sporet skader og synes at være kompakte krop-lignende strukturer nukleare der består af protein og har ingen målelig nukleinsyrer inden deres indre. Baseret på at se på nukleinsyre-syre / protein forhold på de beskadigede områder opnået med vores kombinerede miniSOG og ESI tilgang, foreslår vi, at DNA-reparation kan finde sted på overfladen af foci i stedet for i det indre.
Det nederste billede i figur 5 viser resultater svarende til fig 3-III. Kromatin i det beskadigede område synes at være mere dekondenseret forhold til kromatin i de ikke-bestrålede områder (se område skitseret af røde streger).
Gamma bestrålede celler
Mens laser mikro-bestråling er et praktisk værktøj til at hurtigt vily test proteiner, som indeholder en fluorescerende tag for rekruttering til steder med DNA-læsioner, skaber store mængder af komplekse skader (dobbelt strengbrud, single strengbrud, bund skader, og cyclopyrimidine dimerer) 25. For at undersøge de rum, der dannes omkring DNA dobbelt strengebrud mere direkte, undersøgte vi DRFs der danner omkring individuelle DSB'er ved at udsætte celler for gamma-bestråling.
U2OS celler, der stabilt udtrykker 53BP1-miniSOG-mCherry blev udsat for 2 Gy gamma-bestråling og fastgjort halv time efter bestråling. Det karakteristiske mønster af store foci fordelt over hele nucleoplasm kunne observeres (figur 6Ia). Efter foto-oxidation af diaminobenzidin, kunne mørke pletter ved at opstå de positioner, hvor de fluorescerende signaler blev mCherry placeret i fluorescens mikrofotografier ses i elektronmikrografier (figur 6Ib og c). Disse pletter kan korreleres til TEM billederder blev taget ved lav forstørrelse (figur 6Id og e). ESI billeder af disse foci, som syntes at være ca. 1-1,5 um i diameter, viste en interessant struktur. Tynde tråde af kromatin syntes at være spækket med 53BP1 protein på ca. to gange tykkelsen.
I andre forsøg blev cellerne udsat for en større mængde stråling og fast på senere tidspunkter (efter 3 timer og 6 timer, henholdsvis) for at generere større foci og det nemmere at finde dem i ultra-tynde sektioner (Figur 7). Fordi vi er i stand til separat kort nukleoprotein og protein, ESI viser, at strukturen af foci synes at reorganisere over tid. Den relative mængde af 53BP1 protein i fokus synes at øge mens kromatin tager en mere perifer position.
Da 53BP1 foci forekommer også i ikke-bestrålede celler som "kryptiske foci" i G1 celler på steder med under-replikered DNA 26,27, blev disse foci også afbildet. Disse kryptiske foci synes at harbor store mængder af protein i forhold til strålingsinduceret foci og viser en interessant regelmæssige strukturen af kromatin.
Således visualisere DNA reparation foci bestanddele ved hjælp af miniSOG metode hjælper til at identificere regioner af DNA-skader og at kortlægge fordelingen af mærkede reparation protein i forhold til kromatin.
Figur 1. Oversigt over strukturer, der kan observeres i en ESI billede Klik her for at se en større version af dette tal.
(A) ESI billede af en mus embryonale fibroblast. Kromatin kamme (gul) er omgivet af nucleoplasm (cyan) fylde interchromatin spes. Kernen er omgivet af perifer heterochromatin og chromocenters (nederst til venstre), der er afbrudt af nukleare pore komplekser (cyan). Den nucleoli kan tydeligt adskilt af deres farve. Dette skyldes det faktum, at mængden af protein i forhold til nukleinsyre er højere i nucleolar struktur end det er i kromatin. Uden for kernen, kan mitokondrier og ribosomer (rig på nukleinsyre) let identificeres.
(B) Billede af en kerne og centrosomer (se pile), som kan ses som hule proteinrige partikler i øverste venstre hjørne af billedet.
(C) Tværsnit gennem en metafaseplade. De stærkt kondenseret metafasekromosomer har rettet ind til en disk, der spænder fra det øverste venstre hjørne til nederste venstre hjørne. Høje koncentrationer af nitrogen er synlige på overfladen af nogle kromosomer. Disse områder er de kinetochores (se pile).
(Øverste række) De første to billeder i træk viser forholdet kort over fosfor og kvælstof. Det sidste billede i øverste række viser disse elementært kort overlejret i RGB-farverummet. Gule strukturer repræsenterer nukleoproteiner, afspejler tilstedeværelsen af både phosphor og nitrogen. (Nederste række) Det første billede viser fosfor kort, der primært viser fordelingen af nukleinsyre i prøven. Den midterste billede viser fordelingen af nukleinsyre-depleteret / negative kæmper ctures. Den blev beregnet ved at fratrække fosfor kort fra nitrogen kort. Den nederste højre billede viser en sammenfletning af nukleinsyren kort og proteinet kortet i den subtraktive farverum. Denne farve komposit skal bruges til at hjælpe med at identificere individuelle strukturer og at klassificere dem som nukleoprotein eller ej nukleoprotein. Den kvantitative oplysninger om fosfor og kvælstof overflod skal indsamles visuelt fra nettet fosfor og netto kvælstof gråtoner kort eller fra kompositter genereres ved hjælp af additive farver, såsom i den øverste række. 
Figur 2. Oprettelse af en multi-farve ESI billede 
Figur 3. Laser mikro bestråling af U2OS celler stabilt udtrykker MDC1-miniSOG-mCherry. Klik her for at se en større version af dette tal.
(II) Området, fremhævet af en grøn firkant i Ic blev forstørret og vist i normal transmission tilstand (IIa) og ESI (IIb). IIc viser en overlejring af ESI billedet med signalet fra skader sporet. Skaden track signal blev opnået ved tærsklingsrutine øverste billede.
(III) Eksempler på struktur laser mikro-irradiated kromatin og kromatin uden laser-beskadigede område.
Figur 4. Laser mikro bestråling af celler stabilt udtrykker 53BP1-miniSOG-mCherry. Klik her for at se en større version af dette tal.
Venstre kolonne: (A) fluorescens, (B) Konventionel TEM og (C) ESI billede af den samme laser mikro bestrålet kerne.
Højre kolonne: (D) Konventionel TEM, (E) ESI og (F) overlejring af ESI billedet med miniSOG signal, der blev segmenteret efter tærskelværdiansættelse af (D) (se trin 6.10)
Figur 5. U2OS cellelinje stabilt udtrykker RAD52-miniSOG-mCherry og beskadiget af laser-mikro-bestråling. Klik her for at se en større version af dette tal.
(A) Overlay af et fluorescens billede med en lav forstørrelse TEM billede, der viser en laser microirradiated U2OS kerne med en skade track nederst til venstre.
(B) repræsentant konfokal fluorescensmikroskopi billede af en laser mikro bestrålet Hoechst-farvet kerne (blå), der udtrykker RAD52-miniSOG-mCherry viser den karakteristiske mønster af små foci langs skader spor (rødt signal).
(C) Konventionel TEM, (D) ESI,
(G) ESI billede af en anden U2OS kerne stabilt udtrykker RAD52-miniSOG-mCherry viser en laser-induceret skade spor i sammenhæng med hele kernen.
Figur 6. U2OS celler stabilt udtrykker 53BP1-miniSOG-mCherry bestrålet med 2 Gy og fast efter 30 minutter. Klik her for at se en større version af dette tal.
(I) a) Fluorescens billede der viser gammabestråling-induceret 53BP1 foci. b) gennemlysning billede efter fotopolymerisation. c) Overlay af fluorescensen med transmitteret lys billede. d) lav forstørrelse TEM billede (den sorte stribe er en TEM gitter bar). e) overlejring af det fluorescerende billede med lav forstørrelse TEM billede.
(II) Skader fokus mærket med en stjerne i det transmitterede lys billede optaget i normal TEM og ESI-tilstand. a) Zero-tab, b) ESI, c) Fosfor, d) Protein e) Overlay ESI og segmenteret signal fra nul-loss billede.
(III) Skader fokus mærket med et kryds i fluorescens billede optaget i normal TEM og ESI-tilstand. a) Zero-tab, b) ESI, c) Fosfor, d) Protein e) Overlay ESI og segmenteret signal fra nul-loss billede.
Figur 7. Ændringer i foci struktur mellem foci efter forskellige tidspunkter af bestråling. < / strong> Klik her for at se en større version af dette tal.
U2OS 53BP1 miniSOG mCherry celler udsat for 6 Gy gammastråling fast efter 3h (1A-E, FJ) og 6h (2A-E, FJ) hhv. 3 viser et ubestrålet U2OS 53BP1 miniSOG mCherry kerne viser en kryptisk fokus (AE). ESI billeder er vist i rækkefølge ESI (nukleinsyre og protein), nukleinsyre (alene), protein (alene), ESI (nukleinsyre og protein) + segmenteret miniSOG signal.
Figur 8. DNA-reparation foci er stadig synlige i konventionel transmission tilstand, når stillingen fiksering med osmiumtetroxid er udeladt. arge.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Ultratynde afsnit (50 nm) af en U2OS kerne viser to 53BP1 foci fra en prøve, der ikke var behandlet med osmiumtetroxid. (A) I konventionel TEM-tilstand, er det muligt at se sider farvet med DAB polymer selv uden at øge kontrasten med heavy metal pletten. (B) Kontrasten af foci kan yderligere forbedres ved at tage nul-loss billeder (filtrering væk alle elektroner, der stammer fra plural spredningshændelser).
Figur 9. Bestemmelse af de optimale energi vinduesindstillinger for kortlægning fosfor
(A) Elemental forhold kort registreret for fosfor med Post kant ved 155 eV og præ-kant ved 120 eV.
indhold "> (B) Elemental forhold kort registreret for fosfor med Post kant ved 175 eV og præ-kant ved 120 eV.(C) Beregning phosphorforholdet kort fra en konstant pre-kantvindue ved 120 eV energitab og en variabel post-kantvindue spænder fra 140-200eV energitab for at bestemme den kombination, der er bedst i kontrast. Intensiteten forskel på den lyseste og dimmestpixel i en linje-scanning, der spænder over den samme fosfor rige og fosfor fattig region viser højeste kontrast værdier (Dynamic Range), når en post-kant billede af 175 eV energitab blev valgt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ESI kan tjene som et glimrende værktøj til at undersøge forskellige tilstande af kromatin og ribonucleoproteiner i kernen, fordi det er i stand til specifikt at kortlægge områder, der er rige på fosfor. Det dybt øger mængden af detaljer, der kan opnås ved et elektronmikroskop og er ikke afhængig af uspecifikke kontrasterende metoder. En ulempe ved ESI er, at det kræver tyndere sektioner end konventionel TEM på samme accelerationsspænding. Dette kan overvindes ved at arbejde med serielle sektioner eller ved hjælp af tomografiske metoder 28.
Selv om en masse information kan fås ved at kigge på fordelingerne af phosphor og nitrogen, er det af interesse at være i stand til også at kortlægge fordelingen af visse proteiner. Med den metode præsenteres i dette papir blev det påvist, at ESI kunne kombineres med metoder, der er baseret på den stedspecifikke polymerisering af diaminobenzidin. Selv om denne metode ikke tilføjer en full ny farve til ESI, er det klart nyttigt at kortlægge fordelingen af et protein. Dette gælder især for proteiner, der interagerer med kromatin. Hvis en undersøgelse har brug for at visualisere mere end ét protein population, kan stadig anvendes de mærkningsmetoder ved hjælp immunogold når de anvendes som præ-indlejring farvning, før fotooxidering 9. Sammenlignet med stabile cellelinier, transiente transfektioner har den ulempe, at ekspressionsniveauer kan variere betydeligt mellem celler og dermed gøre det vanskeligt at finde flere celler, der udtrykker lignende mængder af mærkede protein. Oprettelsen af stabile cellelinier anbefales derfor. Det er imidlertid muligt at bedømme den relative mængde af protein-ekspression under anvendelse fluorescensafbildning og vælg celler med intermediær ekspression efter transient transfektion.
Selvom miniSOG fusionstag'en er fluorescerende i sig selv, dets kvanteudbytte er betydeligt værre end GFP (0,37 vs. 0,6) 10. For Purpose af korrelative mikroskopi, tilføje en ekstra fluorescerende protein tag som mCherry giver billeddannelse i levende celler uden produktion af singlet oxygen, der opstår med miniSOG excitation. Ekspressionsniveauet af miniSOG-mærkede proteiner, kan mængden af oxygen i DAB-holdige puffer, og pH også påvirke hastigheden af foto-oxidation. Nogle gange kan det være temmelig problematisk at opnå homogen foto-oxidation i området af interesse på grund af lyset afhængighed af foto-oxidationsreaktionen. Langvarig foto-oxidering kan føre til uspecifik farvning og deposition af for meget tungmetal i prøven, hvilket kan komplicere påvisning af element-specifikke signaler ved ESI. Foto-oxidation proces er ganske tidskrævende, så normalt kun en meget lille område, der indeholder nogle få celler på dækglasset normalt farves.
Vi har vist, at kombinationen af miniSOG mærkede proteiner med ESI hjælp et monolag af en adhærent humand cancer cellelinie. I princippet kan fremgangsmåden også anvendes til enhver anden prøve (gær, bakterier, væv, embryo), så længe det er muligt at udtrykke miniSOG-mærkede protein på et rimeligt niveau, og så længe gennemskinnelighed og diffusion af oxygen og DAB er tilstrækkelig høj til at muliggøre korrekt foto-oxidation og dermed homogen farvning. For suspensionsceller, ville det være fordelagtigt at fastsætte placeringen af cellerne på et dækglas under anvendelse af et klæbemiddel, såsom poly-L-lysin. For tykkere prøver, vil målsætningerne med en lavere blændetal opnå en mere homogen belysning, men tager længere tid at foto-oxidere.
Vi har præsenteret anvendelsen af miniSOG-mærkede fusionsproteiner så tæt på den oprindelige protokol offentliggjort af Shu et al 10 som muligt -. Herunder anvendelse af osmiumtetroxid. Der kunne det bemærkes, at bortset fra fortrinsvis deponering på DAB-polymerer og membraner, osmiumtetroxid viser nogle reaktivitet ogaflejring på de fleste af det biologiske materiale i prøven (10 figur 3). Osmiumtetroxid har en elementær kant ved 45 eV. Dette signal og dets plasmoner kan overlejres på elektron energitabet spektrum som tykkelsen af prøven stiger og enkelte elektroner gennemgår flere energi tab begivenheder under passage gennem prøven. Dette kan begrænse kvaliteten af fosfor elementært kort, hvis høje OSO 4 koncentrationer anvendes ved prøvefremstilling. Koncentrationerne, som vi har brugt her, som er betydeligt lavere end hvad der blev brugt tidligere 10, tillod dannelsen af kvalitet fosfor maps gode. I et forsøg under anvendelse af miniSOG mærkede proteiner, der kræver højere OsO4 koncentrationer, vil det bedste koncentration, der tillader stadig god fosfor kort skabelse skal bestemmes empirisk.
Vi har fundet, at DAB polymer, som danner ved DNA-reparation foci er sufficiently tætte skal ses i konventionelle TEM-tilstand (eller i nul-tab mode med endnu bedre kontrast), selv når post-fiksering med osmiumtetroxid udelades (se figur 8). Segmenteringen af signalerne, der blev optaget på denne måde var så robust som ved hjælp af de prøver, der blev behandlet med osmium. Afhængigt af den kerneprotein, der skal visualiseres, størrelsen af de strukturer, som den danner, og nødvendigheden af at visualisere membransystemer, måske ikke være nødvendigt at anvende osmiumtetroxid og udeladelse vil fjerne potentialet for maskering af elementært underskrift fosfor.
Sammenlignet med andre publikationer ESI 18,29,30 har vi brugt forskellige indstillinger for før og efter edge billeder for at generere elementært forholdet kort med den mindste mængde af støj. Vi har empirisk indstillingerne vist i manuskript (se figur 9). De valgte indstillinger omkring kanterne bør føre til rette elementale kort medmindre indsamling vinduer er overlapning med andre elementer, der er til stede i prøven. I vores tilfælde kunne svovl være et sådant element. Da koncentrationen af svovl (som forekommer i aminosyrerne methionin og cystein) er meget lav, og bidrager til den beregnede kort kun en ubetydelig mængde, vi mener, at bedre S / N-forhold, som vi opnåede under anvendelse af de indstillinger, der anvendes her opvejer ulemperne der måtte opstå som følge af spor af svovl i prøven.
Vi afslørede ultrastruktur af DRFs på nanometer resolutioner ved hjælp af DNA-reparation proteiner MDC1, 53BP1 og RAD52 kombineret med ESI og TEM teknikker. Organiseringen af kromatin og individuelle DSB reparation protein lokalisering blev løst ved hjælp af denne metode. Deres lokalisering i områder rige på DNA-læsioner efter laser mikro-bestråling DNA, og tendensen til reparation proteiner til at fylde rummet mellem chromatin kamme blev vist. I tilfælde af RAD52, som plays en rolle i homolog rekombination, kan dannelsen af nukleare body-lignende sfæriske strukturer langs laser-beskadigede spor skal overholdes, og dette var i modsætning til de to andre afprøvede proteiner. Når skaden påføres ved gammastråling, 53BP1 dannede foci omkring den beskadigede kromatin. Den relative sammensætning og placering af kromatin og protein i foci synes at ændre sig over tid. Forholdet mellem disse proteiner og den beskadigede kromatin samt ændringer i tilrettelæggelsen af kromatin og sammensætningen af nukleare organer kan alle let opnås ved hjælp af ESI teknikken mens konventionel brightfield mikroskopi hjælp uran og bly som modsatrettede agenter kan ikke vurdere disse egenskaber direkte. Således er denne teknik viser stort potentiale til undersøgelse af struktur og funktion, især for processer, der virker på DNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Gridded 35 mm glass bottom dishes | MatTek | P35G-2-14-CGRD | not made for immersion objectives |
| LR White: acryl resin | emsdiasum | 14381 | |
| LR White accelerator | emsdiasum | 14385 | |
| 3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets | Sigma | D5905 | |
| Slim Bar Grids 300 Mesh | SPI | 1161123 | |
| Tungsten-Point Lab Pen | emsdiasum | 41148 | |
| Osmium Tetroxide | emsdiasum | 19100 | |
| Carbon Coater 208 carbon | Cressington | ||
| Ultra microtome Leica EM UC6 | Leica | ||
| Photoshop CS5 | Adobe | might even work with older versions | |
| Digital Micrograph V.2.30 | Gatan | might even work with older versions | |
| Hoechst 33342 | Sigma | H-1399 | |
| Effectene | Quiagen | ||
| MiniSOG-Constructs | Tsien-Lab | tsienlab@yahoo.com | |
| MDC1 miniSOG mCherry | |||
| 53BP1 miniSOG mCherry | |||
| Rad52 miniSOG mCherry | |||
| cesium 137 radiation source "MARK 1" | (J.L. Shepherd & Associated) | ||
| ImageJ/FiJi | open source | http://fiji.sc/Fiji | |
| 2 ml Eppendorf tubes | Fisherbrand | 05-408-146 | |
| Diamond Knife ultra 35° | Diatome | ||
| Trimming Knife ultratrim | Diatome | ||
| Sodium cacodylate trihydrate | emsdiasum | 12300 | Caution Toxic! |
| Glutaraldehyde EM Grade 8% | emsdiasum | 16020 | Caution Toxic! |
| Sodium phosphate dibasic | emsdiasum | 21180 | |
| Sodium phosphate monobasic | emsdiasum | 21190 | |
| Paraformaldehyde | emsdiasum | 19202 | |
| Osmium tetroxide 4% solution | emsdiasum | 19150 | |
| Inverted Fluorescence Micoscope Axiovert 200M | Zeiss | ||
| Hydrochloric Acid | Fisherbrand | A142-212 | |
| Sodium Hydroxide Solution 10M | Fluka | 72068 | |
| Oxygen | Medigas | ||
| 3-Amino-1,2,4-triazole | Sigma | A8056 | |
| Potassium cyanide | Sigma | 207810 | Caution Toxic! |
| Ethanol | emsdiasum | 15058 | Caution Toxic! |
| Razor blade Single Edge Carbon Steel | emsdiasum | 71960 | Caution Sharp! |
| DMEM | Sigma | D 5546 | |
| FBS | Life Technologies | 16000-044 | |
| G418 | Life Technologies | 11811-023 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Transmission Electron Microscope 200 kV | JEOL | 2100 | |
| GIF Tridiem 863 Energy filter | Gatan |
References
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. The Journal of Cell Biology. 190, 165-175 (2010).
- Bazett-Jones, D. P., Hendzel, M. J., Kruhlak, M. J. Stoichiometric analysis of protein- and nucleic acid-based structures in the cell nucleus. Micron (Oxford, England: 1993). 30, 151-157 (1999).
- Michael J Hendzel, F. M. B., Bazett-Jones, D. P. Direct Visualization of a Protein Nuclear Architecture. Molecular biology of the cell. 10, 2051 (1999).
- Ottensmeyer, F. P., Andrew, J. W. High-resolution microanalysis of biological specimens by electron energy loss spectroscopy and by electron spectroscopic imaging. Journal of ultrastructure research. 72, 336-348 (1980).
- Leapman, R. D., Ornberg, R. L. Quantitative electron energy loss spectroscopy in biology. Ultramicroscopy. 24, 251-268 (1988).
- Simon, G. T. Electron spectroscopic imaging. Ultrastructural pathology. 11, 705-710 (1987).
- Egerton, R. Electron Energy-Loss Spectroscopy in the Electron Microscope. , Springer. (2011).
- Aronova, M. A., Kim, Y. C., Zhang, G., Leapman, R. D. Quantification and thickness correction of EFTEM phosphorus maps. Ultramicroscopy. 107, 232-244 (2007).
- Hopkins, C., Gibson, A., Stinchcombe, J., Futter, C. Chimeric molecules employing horseradish peroxidase as reporter enzyme for protein localization in the electron microscope. Methods in enzymology. 327, 35-45 (2000).
- Shu, X., et al. A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms. PLoS biology. 9, e1001041 (2011).
- Gaietta, G., et al. Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking. Science (New York, NY). 296, 503-507 (2002).
- Fernandez-Capetillo, O., Celeste, A., Nussenzweig, A. Focusing on foci: H2AX and the recruitment of DNA-damage response factors. Cell cycle (Georgetown, Tex). 2, 426-427 (2003).
- Haaf, T., Golub, E. I., Reddy, G., Radding, C. M., Ward, D. C. Nuclear foci of mammalian Rad51 recombination protein in somatic cells after DNA damage and its localization in synaptonemal complexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 2298-2302 (1995).
- Maser, R. S., Monsen, K. J., Nelms, B. E., Petrini, J. H. hMre11 and hRad50 nuclear foci are induced during the normal cellular response to DNA double-strand breaks. Molecular and Cellular Biology. 17, 6087-6096 (1997).
- Bekker-Jensen, S., Mailand, N. Assembly and function of DNA double-strand break repair foci in mammalian cells. DNA repair. 9, 1219-1228 (2010).
- Chapman, J. R., Sossick, A. J., Boulton, S. J., Jackson, S. P. BRCA1-associated exclusion of 53BP1 from DNA damage sites underlies temporal control of DNA repair. Journal of cell science. 125, 3529-3534 (2012).
- Dellaire, G., Kepkay, R., Bazett-Jones, D. P. High resolution imaging of changes in the structure and spatial organization of chromatin, gamma-H2A.X and the MRN complex within etoposide-induced DNA repair foci. Cell cycle (Georgetown, Tex). 8, 3750-3769 (2009).
- Kruhlak, M. J., et al. Changes in chromatin structure and mobility in living cells at sites of DNA double-strand breaks. The Journal of Cell Biology. 172, 823-834 (2006).
- Goodson, H. V., Dzurisin, J. S., Wadsworth, P. Generation of stable cell lines expressing GFP-tubulin and photoactivatable-GFP-tubulin and characterization of clones. Cold Spring Harbor protocols. 2010, (2010).
- Zeyda, M., Borth, N., Kunert, R., Katinger, H. Optimization of sorting conditions for the selection of stable, high-producing mammalian cell lines. Biotechnology progress. 15, 953-957 (1999).
- Dellaire, G., Nisman, R., Bazett-Jones, D. P. Correlative light and electron spectroscopic imaging of chromatin in situ. Methods in enzymology. , 375-456 (2004).
- Campbell, S., Ismail, I. H., Young, L. C., Poirier, G. G., Hendzel, M. J. Polycomb repressive complex 2 contributes to DNA double-strand break repair. Cell cycle. 12, 2675-2683 (2013).
- Mortusewicz, O., et al. Recruitment of RNA polymerase II cofactor PC4 to DNA damage sites. J Cell Biol. 183, 769-776 (2008).
- Bekker-Jensen, S., et al. Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks. The Journal of Cell Biology. 173, 195-206 (2006).
- Ferrando-May, E., et al. Highlighting the DNA damage response with ultrashort laser pulses in the near infrared and kinetic modeling. Frontiers in genetics. 4, 135 (2013).
- Lukas, C., et al. 53BP1 nuclear bodies form around DNA lesions generated by mitotic transmission of chromosomes under replication stress. Nature. 13, 243-253 (2011).
- Harrigan, J. A., et al. Replication stress induces 53BP1-containing OPT domains in G1 cells. The Journal of Cell Biology. 193, 97-108 (2011).
- Aronova, M. A., et al. Reprint of 'Three-dimensional elemental mapping of phosphorus by quantitative electron spectroscopic tomography (QuEST). J. Struct. Biol. 161, 322-335 (2007).
- Fussner, E., et al. Constitutive heterochromatin reorganization during somatic cell reprogramming. The EMBO journal. 30, 1778-1789 (2011).
- Kepkay, R., Attwood, K. M., Ziv, Y., Shiloh, Y., Dellaire, G. KAP1 depletion increases PML nuclear body number in concert with ultrastructural changes in chromatin. Cell cycle. 10, Georgetown, Tex. 308-322 (2011).
