Abstract
ऑप्टिकल संकल्प और संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में विशिष्ट प्रोटीन आबादी की पहचान करने की चुनौती के लिए सीमा कोशिका जीव विज्ञान में बाधाओं किया गया है। कई घटनाएं सरलीकृत प्रणालियों में इन विट्रो विश्लेषण के द्वारा समझाया और पूरी तरह से समझ में आ सकता है, क्रम में विशेष रूप से 1 एनएम और 0.1 माइक्रोन के बीच सीमा में, बगल में अतिरिक्त जानकारी संरचनात्मक जरूरत नहीं किया जा सकता। इधर, इलेक्ट्रॉन स्पेक्ट्रोस्कोपी इमेजिंग, प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड के वितरण के साथ-साथ मानचित्रण की अनुमति देता है कि एक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी तकनीक, और एक अभिव्यक्ति टैग, miniSOG, डीएनए डबल कतरा तोड़ मरम्मत foci की संरचना और संगठन के अध्ययन के लिए संयुक्त रहे हैं।
Introduction
हाल के वर्षों 1 पर प्रकाश माइक्रोस्कोपी में महत्वपूर्ण प्रगति के बावजूद, सेल जीव अभी भी संकल्प में एक अंतराल से पीड़ित हैं। इस macromolecular परिसर के बीच समन्वित परस्पर क्रिया शामिल है कि मौलिक सेलुलर प्रक्रियाओं में संरचना समारोह संबंधों की समझ की सीमा (जैसे, क्रोमेटिन remodeling, डीएनए की मरम्मत, आरएनए प्रतिलेखन और डीएनए प्रतिकृति में)। संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (मंदिर) की आवश्यकता संकल्प प्रदान है, यद्यपि यह भी कल्पना की संरचनाओं के जैव रासायनिक संरचना का निर्धारण करने में सक्षम होने के साथ ही विशिष्ट प्रोटीन लेबल करने के लिए संरचनात्मक रूप से, क्योंकि अक्षमता की इन प्रक्रियाओं को परिभाषित करने के लिए चुनौती रहा है। परमाणु संरचनाओं अंतर करने में मदद करने के लिए आंतरिक झिल्ली के अभाव में, नाभिक विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण हो गया है। इलेक्ट्रॉन स्पेक्ट्रोस्कोपी इमेजिंग (ईएसआई) डीएनए, आरएनए और prot के एक साथ पता लगाने और भेदभाव की अनुमति देकर इन सीमाओं से कुछ हल करती हैपरमाणु संरचनाओं 2-5 ein आधारित।
इलेक्ट्रॉन स्पेक्ट्रोस्कोपी इमेजिंग:
इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में उच्च संवेदनशीलता और संकल्प पर मौलिक वितरण नक्शा करने के लिए आदेश में, एक inelastically नमूना 6 में एक तत्व के भीतरी खोल इलेक्ट्रॉनों के साथ बातचीत के माध्यम से बिखरे हुए किया गया है कि इलेक्ट्रॉनों का चयन करता है कि एक इमेजिंग स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग कर सकते हैं। ऊर्जा के तत्व-विशिष्ट मात्रा नमूना में परमाणुओं के आयनीकरण का एक परिणाम के रूप में खो जाते हैं, क्योंकि इन इलेक्ट्रॉनों अलग कर दिया और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप से जुड़ा हुआ है कि एक स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग कर देखे जा सकते हैं। इस प्रकार, नमूना के साथ बातचीत की है कि इलेक्ट्रॉनों के स्पेक्ट्रम का विश्लेषण नमूना 7 की मौलिक रचना के बारे में गुणात्मक और मात्रात्मक जानकारी का पता चलता है। नमूना के माध्यम से गुजर रहा है जब ऊर्जा खोना नहीं है कि इलेक्ट्रॉनों इलेक्ट्रॉन ऊर्जा नुकसान की "शून्य नुकसान पीक" में पाए जाते हैंस्पेक्ट्रम। इन इलेक्ट्रॉनों की बहुतायत नमूना की बड़े पैमाने पर, घनत्व और मोटाई से संबंधित है और नमूना के साथ टकराने या नमूना के माध्यम से पारित होने के दौरान ऊर्जा को खोने के बिना नमूना के माध्यम से पारित है कि इलेक्ट्रॉनों के शामिल है। यह जानकारी नमूना 8 में एक विशिष्ट तत्व वर्तमान के परमाणुओं की संख्या का पूर्ण मात्रा का ठहराव के लिए उपयोगी हो सकता है।
जैविक नमूने भारी धातु का उपयोग ज्यादातर खराब मंदिर की घटना किरण में इलेक्ट्रॉनों मोड़ना है कि प्रकाश तत्वों, धुंधला तरीकों से मिलकर चूंकि लवण नमूने में विपरीत उत्पन्न करने के क्रम में लागू किया जाना है। इन विषम एजेंटों और अक्षमता का सबसे विशिष्टता संभव है, जहां एक से अधिक दाग कल्पना करने की विशिष्टता की कमी नाभिक के अध्ययन में पारंपरिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का मूल्य सीमित है। ईएसआई विशेष रूप से सेल नाभिक के ढांचे के अध्ययन के लिए, पारंपरिक मंदिर से अधिक महत्वपूर्ण लाभ है।यह प्रोटीन परिसरों से nucleoprotein परिसरों भेद करने के लिए और न्यूक्लिक एसिड के अपने घनत्व के आधार पर अलग अलग nucleoprotein परिसरों को हल करने के लिए डीएनए और आरएनए युक्त macromolecular परिसर की फास्फोरस युक्त प्रकृति का दोहन करने के लिए संभव है। शेष जैविक सामग्री नाइट्रोजन के अपने बहुतायत के आधार पर imaged किया जा सकता है। विभिन्न संरचनात्मक ढांचे के भीतर अपने वितरण और रिश्तेदार बहुतायत की मैपिंग सिर्फ इन दो तत्वों और विश्लेषण नाभिक के बारे में जानकारी का एक बहुत कुछ के साथ हमें प्रदान करता है। उदाहरण के लिए, यह क्रोमेटिन और फास्फोरस बहुतायत का प्रतिनिधित्व नक्शे में राइबोसोम की पहचान करने के लिए आसान है। interchromatin अंतरिक्ष, परमाणु ताकना परिसरों, और परमाणु निकायों, दूसरे हाथ पर, आसानी से नाइट्रोजन नक्शा छवि में पता लगाया जा सकता है।
मिनी स्वेटर ऑक्सीजन जनरेटर प्रणाली (miniSOG)
ईएसआई एक शक्तिशाली तकनीक का प्रतिनिधित्व करता है, वहीं इसे ले क्योंकि सीटू क्रोमेटिन संरचना में अध्ययन करने के लिएफास्फोरस और नाइट्रोजन के बीच मौलिक रचना में विशेषता अनुपात के लाभ, मौलिक रचना सामान्य रूप से प्रोटीन परिसरों के विभिन्न आबादी के बीच भेदभाव करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता। नैनोमीटर रेंज में छोटे से सोने के कणों के साथ लेबल एंटीबॉडी व्यापक रूप से व्यक्तिगत अणुओं के स्थान नक्शा करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। सोने के कण आमतौर पर एक माध्यमिक एंटीबॉडी से जुड़ा हुआ है, इसलिए यह प्राथमिक एंटीबॉडी द्वारा पता लगाया मिलान के आसपास लगभग 20 एनएम की परिधि के भीतर प्रदर्शित होगी। पोस्ट-embedding नमूनों में एंटीबॉडी ही वर्गों की सतह पर उजागर कर रहे हैं कि एपिटोप्स पता लगा सकते हैं। यह, प्राप्त जानकारी है कि एक प्रतिजन की उपस्थिति को साबित करने और सेल की एक निश्चित शारीरिक संरचना से संबंधित करना संभव है एपिटोप्स के सबसे राल से छिप कर रहे हैं, के बाद से अधूरा है। भर एंटीजन लिए उपयोग की अनुमति, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए इस्तेमाल किया उन लोगों के लिए इसी तरह के प्रोटोकॉल का उपयोग तकनीक है, जो पूर्व embeddingनमूने की पूरी गहराई लेकिन आम तौर पर लिपिड झिल्ली को हटाने की आवश्यकता होती है और एल्डीहाइड द्वारा तय नहीं किया जा सकता है कि घटकों को दूर एंटीबॉडी सेल प्रवेश करने की अनुमति के लिए आवश्यक हैं कि permeabilization कदम। इसके अलावा, फैटी संरक्षण, glutaraldehyde के लिए पसंदीदा एल्डिहाइड लगानेवाला, सामान्यतः फलस्वरूप, paraformaldehyde आम तौर पर आवश्यक है, एपिटोप्स को नष्ट कर देता है। यह प्रोटीन, प्रोटीन तिर्यक में कम प्रभावी है। एक सोने nanoparticle के साथ चिह्नित कर रहे हैं कि एंटीबॉडी का एक और नुकसान सोना कमजोर विपरीत है नमूना है, जो की दिलचस्प संरचनात्मक विवरण अस्पष्ट कर सकते हैं कि एक मजबूत विपरीत बनाता है कि एक बहुत ही इलेक्ट्रॉन घने सामग्री है।
एक व्यक्त प्रोटीन टैग के रूप में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के उद्भव कोशिका जीव विज्ञान में सवालों के जवाब देने प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग तब्दील हो गया है। एक छोटे फ्लोरोसेंट डोमेन के साथ एक प्रोटीन टैगिंग विवो में इसके वितरण की मैपिंग की अनुमति देता है 9 कोशिकाओं की cytosol में catalytically सक्रिय नहीं है। उनके संकल्प nanogold विधि 10 से भी बदतर है कि इतने एचआरपी की प्रतिक्रिया उत्पादों को भी पीढ़ी की साइट से दूर फैलाना कर सकते हैं। इन समस्याओं को बायपास करने के लिए, फ्लैश / ReAsH सिस्टम 11 विकसित किया गया था। यह एक tetracysteine मूल भाव के अधिकारी है कि पुनः संयोजक संलयन प्रोटीन होते हैं। यह मूल भाव के बंधन की अनुमति देता हैएक biarsenic fluorophore। उत्साहित है, तो बाध्य फ़्लैश या ReAsH टैग प्रोटीन के स्थल पर तुरंत अवक्षेप कि एक बहुलक में उच्च प्रतिक्रियाशील स्वेटर ऑक्सीजन और इस तरह photoconvert diaminobenzidine (थपका) उत्पन्न करने में सक्षम है। थपका बहुलक इलेक्ट्रॉन घना है और इस प्रकार मंदिर में पुनः संयोजक संलयन प्रोटीन का वितरण नक्शा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जो आज़मियम tetroxide, साथ दाग जा सकता है।
2011 में, शू एट अल। 10 फ्लोरोसेंट और 448 एनएम नीले प्रकाश के साथ उत्साहित है जब कई स्वेटर ऑक्सीजन कण पैदा करने में सक्षम है कि एराबिडोप्सिस की एक flavoprotein से ली गई एक छोटी सी 106 अमीनो एसिड संलयन टैग के होते हैं जो miniSOG प्रणाली, प्रस्तुत किया। उन स्वेटर ऑक्सीजन कण पर और immunogold लेबल एंटीबॉडी 11 की तुलना में काफी करीब है, जो टैग प्रोटीन, की सतह के पास पॉलिमर फार्म के लिए फोटो-oxidize diaminobenzidine के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। फ्लैश / ReAsH सिस्टम फ्लोरो लाने की आवश्यकता हैक्रोम और photoconversion करने से पहले कोशिकाओं में diaminobenzidine, miniSOG प्रणाली केवल diaminobenzidine और प्रकाश की आवश्यकता है और इसके अलावा में diaminobenzidine polymerizing पर के बारे में दो बार के रूप में प्रभावी है। इधर, miniSOG डीएनए की मरम्मत foci के फैटी नक्शा करने के क्रम में ईएसआई के साथ संयोजन में कार्यरत है।
डीएनए की मरम्मत foci (डीआरएफ)
वे ट्रांसलोकेशन और आनुवंशिक जानकारी का नुकसान हो सकता है, क्योंकि बिना मरम्मत के डीएनए डबल किनारा टूट सेल के लिए एक गंभीर खतरा है। बारी में, यह बुढ़ापा, कैंसर, और सेल मौत हो सकती है। डीएनए डबल कतरा तोड़ मरम्मत में शामिल कर रहे हैं कि कई प्रोटीन 12-14 तोड़ने के एक डीएनए डबल कतरा चारों ओर इकट्ठा कि foci में जमा। उनके कार्य ज्ञात नहीं है, वे डीएनए डबल कतरा तोड़ होता है और डीएनए डबल कतरा तोड़ मरम्मत की साइट है कि नाभिक में साइट का प्रतिनिधित्व करते हैं।
डीएनए की मरम्मत संस्कृति और उसकेमैं (डीआरएफ) प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा विशेषता किया गया है और वे डीएनए की क्षति 12,15 के लिए बायोमार्कर के रूप में काम करते हैं। वे डबल कतरा तोड़ के आकार के लिए बड़े पैमाने पर रिश्तेदार हैं और हाल ही में सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी अध्ययन प्रत्येक 16 ध्यान केंद्रित भीतर अणुओं के उप compartmentalization के कुछ सबूत से पता चला जब तक अपेक्षाकृत सजातीय पर विचार किया गया। इन साइटों का आयोजन कर रहे हैं कि कैसे को समझने के लिए, यह एक दूसरे के लिए अंतर्निहित जैविक संरचनाओं के सभी रिश्तेदार कल्पना करने के लिए आवश्यक है। इस प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा हासिल की लेकिन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 17,18 के माध्यम से संभव है नहीं किया जा सकता। इधर, एक विधि डीएनए डबल कतरा तोड़ मरम्मत की फैटी पता लगाने के लिए इस संयुक्त दृष्टिकोण की क्षमता का वर्णन करने के लिए miniSOG विधि के साथ इलेक्ट्रॉन स्पेक्ट्रोस्कोपी इमेजिंग जोड़ती है कि वर्णित है।
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Protocol
MiniSOG सेल लाइनों के 1. पीढ़ी
- 5% सीओ 2 के साथ एक humidified इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक है कि कम ग्लूकोज Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) के 2 मिलीग्राम से युक्त एक 35 मिमी डिश में U2OS (मानव osteosarcoma) कोशिकाओं को विकसित माहौल।
- वे miniSOG और mCherry के लिए दृश्यों से युक्त प्लाज्मिड निर्माणों अभिकर्मक अभिकर्मक 19 के निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार मरम्मत टैग प्रोटीन शुद्ध अभिकर्मक गुणवत्ता (A269 / 280 अनुपात 1.8-2.0) के साथ lipofection से 80% मिला हुआ है जब कोशिकाओं Transfect। miniSOG अभिव्यक्ति plasmids Tsien-लैब से आदेश दिया जा सकता है: http://www.tsienlab.ucsd.edu/Samples.htm
- दो दिनों के बाद अभिकर्मक प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई द्वारा miniSOG और mCherry टैग के साथ पुनः संयोजक प्रोटीन व्यक्त क्रमबद्ध कोशिकाओं। कोशिकाओं को ले लीजिए20 overexpressing कर रहे हैं कि कोशिकाओं से बचने के लिए मध्यवर्ती प्रतिदीप्ति तीव्रता के साथ।
- संस्कृति 10% FBS और चयन एजेंट G418 (Geneticin) के 0.6 माइक्रोग्राम / एमएल के साथ पूरक है कि DMEM माध्यम के 10 मिलीलीटर में एक 10 सेमी पकवान पर सकारात्मक कोशिकाओं।
- दिखाई दे कालोनियों प्लेटों पर उभरा है के बाद, mCherry सकारात्मक कालोनियों के लिए स्क्रीन एक औंधा प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का उपयोग और एक स्थायी मार्कर के साथ (प्लेट के नीचे पर) उन्हें आसपास हलकों ड्रा। एक कम बढ़ाई हवा उद्देश्य लेंस (जैसे, 10x) का प्रयोग करें और ध्यान से एक बाँझ 1000 μl विंदुक टिप में उन्हें चूसने धीरे धीरे बंद कालोनियों scratching और से बाँझ तकनीक का उपयोग क्लोन उठाओ।
- चयनित कालोनियों का विस्तार और 10% डाइमिथाइल sulphoxide के साथ पूरक 1.1 चरण में वर्णित मध्यम विकास का उपयोग कर उन्हें के कुछ हिस्सों नीचे फ्रीज। बाँझ 18 x 18 मिमी 2 कवर फिसल जाता है पर उन्हें बढ़ रही है और उन्हें उजागर द्वारा डीआरएफ गठन के लिए कोशिकाओं का परीक्षणविकिरण के 2 Gy। स्थिरतापूर्वक एक miniSOG mCherry व्यक्त विकिरणित कोशिकाओं को एक mCherry इमेजिंग के लिए फिल्टर सेट का उपयोग कर एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ कल्पना जब मरम्मत प्रोटीन DSBs की ठेठ फोकल पैटर्न विशेषता दिखाना चाहिए चिह्नित।
2. सेल संस्कृति
- संस्कृति U2OS कोशिकाओं स्थिरतापूर्वक miniSOG व्यक्त और mCherry 1.1 चरण में उल्लिखित शर्तों के तहत मरम्मत टैग प्रोटीन। DMEM के 2 मिलीग्राम से युक्त एक 35 मिमी व्यास गिलास नीचे डिश में 80% confluency करने के लिए कोशिकाओं को विकसित। प्लास्टिक और इस्तेमाल प्लास्टिक को कवर पर्ची देता है कि गोंद का इस्तेमाल किया राल के लिए जलीय और मादक समाधान के लिए प्रतिरोधी और प्रतिरोधी है कि सुनिश्चित करें!
- प्रयोग का आयोजन करने से पहले, ब्याज के क्षेत्र की पहचान करने के लिए एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का उपयोग कर एक बाँझ हीरा कलम के साथ scratching द्वारा अस्थानिक प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं में शामिल है कि लगभग 1 मिमी 2 के एक छोटे से क्षेत्र की रूपरेखा तैयार। वैकल्पिक रूप से एक गिलास नीचे डिश टी का उपयोगटोपी coverslip में निर्मित एक पूर्व etched ग्रिड प्रणाली के साथ एक coverslip शामिल हैं।
नोट: ईएसआई और प्रतिदीप्ति सूक्ष्म चित्रों 21 के संयोजन उच्च गुणवत्ता correlative माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हैं, तो coverslip की मोटाई तेल विसर्जन उद्देश्यों के साथ संगत है कि सुनिश्चित करें। यह मोटाई सं 1.5 (0.16-0.18 मिमी) होना चाहिए। क्षेत्र के किनारों के पास हो सकता है कि राल के polymerization के साथ समस्याओं से बचने के लिए मंदिर में जांच की जा करने के लिए पकवान के केंद्र के पास एक क्षेत्र चुनें (बिंदु 4.10-4.13 देखें)।
3. डीएनए में नुकसान प्रेरण
- गामा विकिरण के साथ कोशिकाओं को चमकाना एक radiomimetic दवा का उपयोग करें, या (18,22 या 23 में वर्णित है, उदाहरण के लिए) एक confocal खुर्दबीन पर लेजर सूक्ष्म विकिरण से नुकसान प्रेरित।
- इस उदाहरण में, 405 एनएम प का उपयोग कर एक सीज़ियम -137 विकिरण स्रोत या लेजर microirradiate में गामा विकिरण के 2 और 6 Gy के साथ कोशिकाओं को चमकाना0.5 माइक्रोग्राम / एमएल Hoechst के साथ 20 मिनट के लिए कोशिकाओं को संवेदनशील के बाद एक confocal खुर्दबीन के आईडी राज्य लेजर।
4. नमूना तैयार
- 0.1 एम सोडियम cacodylate बफर में या अंधेरे में आरटी पर 30 मिनट के लिए 0.1 एम फॉस्फेट बफर 7.4 पीएच में 4% paraformaldehyde सतर्कता का 1 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को ठीक करें।
चेतावनी: paraformaldehyde और सोडियम cacodylate विषाक्त कर रहे हैं! दस्ताने पहनें और पर्याप्त रूप से विषाक्त पदार्थों को निपटाने। - 0.1 एम सोडियम cacodylate बफर पीएच 7.4 या फॉस्फेट बफर पीएच 7.4 से 4 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को दो बार धो लें।
- 2 मिलीलीटर 50 मिमी ग्लाइसिन के साथ तय की कोशिकाओं को समझो, 5 मिमी aminotriazole और 30 मिनट के लिए 0.1 एम सोडियम cacodylate बफर या 0.1 एम फॉस्फेट बफर (7.4 पीएच) में 10 मिमी पोटेशियम साइनाइड सावधानी (पीएच जांच!) Unreacted ब्लॉक करने के क्रम में एल्डिहाइड समूहों और पृष्ठभूमि में वृद्धि कर सकते हैं, जो हीम समूहों द्वारा उत्पन्न प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों को दबाने के लिए।
चेतावनी: पोटेशियम साइनाइड अत्यंत विषैला होता है! डब्ल्यूकान दस्ताने, एक हुड के तहत काम करते हैं और पर्याप्त रूप से विषाक्त पदार्थों को निपटाने। यह पीएच सत्यापित और सटीक महत्वपूर्ण है कि इतनी प्रतिक्रिया पीएच के लिए बहुत संवेदनशील है। - Correlative माइक्रोस्कोपी वांछित है, तो एक औंधा प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी पर 2 डी या 3 डी में 2.2 चरण में चयनित किया गया था कि क्षेत्र रिकार्ड।
- एक 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में एक 10 मिलीग्राम diaminobenzidine हाइड्रोक्लोराइड टैबलेट रखकर एक 1 मिलीग्राम / एमएल diaminobenzidine हाइड्रोक्लोराइड चेतावनी समाधान तैयार है। आसुत एच केंद्रित हाइड्रोक्लोरिक एसिड (11.65 एम) के 2 हे और 20 μl के 980 μl जोड़ें और समाधान हल्के भूरे रंग और पारदर्शी है, जब तक मिश्रण। 7.0 और 7.6 के बीच एक पीएच के लिए सोडियम हाइड्रोक्साइड के साथ पीएच का समायोजन करते हुए 1 मिलीग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए 0.1 एम फॉस्फेट या 0.1 एम सोडियम cacodylate बफर में इस समाधान पतला (7.4 पीएच सिफारिश की है)।
चेतावनी: diaminobenzidine विषैला होता है! दस्ताने पहनें और पर्याप्त रूप से विषाक्त पदार्थों को निपटाने। - Photooxidation, अनुसंधान के लिएeplace 0.1 एम सोडियम cacodylate बफर या फॉस्फेट बफर में एक 1 मिलीग्राम / एमएल diaminobenzidine हाइड्रोक्लोराइड समाधान के 2 मिलीलीटर के साथ बफर। प्रकाश से इस समाधान को सुरक्षित रखें और ऑक्सीजन की घुलनशीलता बढ़ाने के लिए 4 ओ सी के लिए बर्फ पर शांत हो जाओ। (समाधान में डाला और एक ऑक्सीजन बोतल से जुड़ा है कि एक नली का उपयोग करें) समाधान के माध्यम से ऑक्सीजन बुदबुदाती द्वारा ऑक्सीजन के साथ समाधान तर। फिर पीएच की जाँच करें और यदि आवश्यक हो तो समायोजित।
नोट: यह पीएच पीएच 7.0 और पीएच 7.6 के बीच है कि photooxidation प्रतिक्रिया के लिए महत्वपूर्ण है। - ध्यान से एक 40x तेल विसर्जन उद्देश्य लेंस से लैस एक औंधा प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी पर तय की कोशिकाओं के साथ पकवान माउंट और हित के क्षेत्र के लिए यह कदम। GFP या सीएफपी के लिए फिल्टर क्यूब्स का उपयोग करके नीले प्रकाश के साथ miniSOG टैग उत्तेजित। MiniSOG 473 एनएम 10 पर एक कंधे के साथ 448 एनएम पर एक उत्तेजना अधिकतम है।
- यहां तक कि हरी miniSOG प्रतिदीप्ति हेक्टेयर के बाद रोशनी के साथ जारी रखेंपूरी तरह से गायब हो गया और polymerized diaminobenzidine की भूरे रंग की तस्वीर ऑक्सीकरण उत्पाद प्रेषित प्रकाश चैनल में उभर रहे हैं जब तक है। ऑक्सीकरण उत्पाद कोशिकाओं के अधिकांश में दिखाई दे रहा है, तो तस्वीर ऑक्सीकरण रोकने के लिए प्रतिदीप्ति रोशनी बंद कर देते हैं।
नोट: फोटो ऑक्सीकरण उद्देश्य लेंस, फिल्टर संचरण तरंग दैर्ध्य और दक्षता, और रोशनी के स्रोत के आधार पर कई मिनट तक का समय लग सकता है। - पोस्टफिक्स 0.1 एम सोडियम cacodylate पीएच में 2% glutaraldehyde के 1 मिलीलीटर 7.4 बफर या 30 मिनट के लिए फॉस्फेट बफर पीएच 7.4 के साथ कोशिकाओं।
- 0.1 एम सोडियम cacodylate बफर 7.4 पीएच में या 0.1 एम फॉस्फेट बफर 7.4 पीएच में 20 मिनट के लिए 0.1% -0.5% आज़मियम tetroxide के साथ कोशिकाओं की झिल्ली को ठीक करें।
नोट: यह झिल्ली को स्थिर करने के लिए आवश्यक आज़मियम tetroxide के संभव एकाग्रता का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है। Polymerized थपका अवक्षेप ईएसआई, एक मजबूत द्वारा सीधे पता लगाया जा सकता है, जो नाइट्रोजन की एक उच्च घनत्व, चूंकिआज़मियम धुंधला miniSOG टैग प्रोटीन की पहचान करने और ईएसआई के लिए हानिकारक हो सकता है आवश्यक नहीं है। आज़मियम tetroxide बहुत विषैला होता है! एक धूआं हुड में काम करने और पर्याप्त रूप से विषाक्त अपशिष्ट के निपटान के। - 30%, 50%, 70%, 90%, 98% से 100% इथेनॉल कदम (प्रत्येक 5 मिनट) का उपयोग कर एक इथेनॉल श्रृंखला के माध्यम से, कोशिकाओं निर्जलीकरण। बाद में, एक 1 में कोशिकाओं को सेते हैं: 100% इथेनॉल और एक्रिलिक राल (एलआर सफेद) का एक मिश्रण है और 100 में कम से कम एक और 4 घंटे के लिए कोशिकाओं incubating से पहले कोशिकाओं में घुसपैठ की सुविधा के लिए 4 घंटे के लिए एक प्रकार के बरतन पर पकवान डाल % एक्रिलिक राल (एलआर सफेद)।
- राल भाजन करने के लिए, एक रेजर ब्लेड और कोट ऐक्रेलिक राल त्वरक के साथ रिम के साथ एक लेबल 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब के ढक्कन काट दिया। त्वरक केवल रिम को शामिल किया गया और ट्यूब में प्रवाह नहीं है कि सुनिश्चित करें। बाद में, ध्यान से लगभग एलआर सफेद राल एक पाश्चर विंदुक का उपयोग के साथ दो-तिहाई ट्यूब भरना। राल संपर्क बुद्धि में नहीं मिलता है कि अपना ध्यान रखनाज रिम पर त्वरक!
- डिश में कोशिकाओं में घुसपैठ की है कि राल निकालें और ट्यूब की चौड़ाई लगभग पूरी तरह से पकवान की गिलास को कवर किया अवलोकन खिड़की भरता है, ताकि सीधा खड़ा microcentrifuge ट्यूब पर उल्टा पकवान जगह है।
- तो, ट्यूब और coverslip सील ट्यूब में राल अब कोशिकाओं को शामिल किया गया है, ताकि ट्यूब पलटना त्वरक के लिए 1 मिनट से 2 रुको।
- 60 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में ट्यूब के साथ पकवान प्लेस और 12 घंटे के लिए इसे इलाज।
- ब्लॉक ठीक हो जाता है, तो ओवन से जुड़ी राल से भरे microcentrifuge ट्यूब के साथ पकवान हटाने और पकवान से microcentrifuge ट्यूब अलग। तरल नाइट्रोजन और गर्म पानी में फ्रीज पिघलना चक्र से जुदाई की सुविधा।
- गिलास नीचे पकवान त्यागें और ध्यान से ब्लॉक को दूर करने के क्रम में एक धार के साथ microcentrifuge ट्यूब खोलने काटा।
- एक स्थायी मार्कर के साथ ब्लॉक लेबल।
- त्रि एक रेजर ब्लेड का प्रयोग करेंपहले से हीरा या टंगस्टन कलम के साथ चिह्नित क्षेत्र में शामिल है (या ब्याज की कोशिकाओं के साथ क्षेत्र शामिल हैं) कि 1 2 मिमी क्षेत्र है लेकिन कुछ भी नहीं रहता है, ताकि ब्लॉक हूँ।
- , एक ultramicrotome में ब्लॉक माउंट एक trimming चाकू के साथ ब्लॉक ट्रिम और एक हीरे की चाकू का उपयोग करते हुए लगभग 50 एनएम के अति पतली वर्गों में कटौती।
- उच्च संचरण 300 जाल ग्रिड पर वर्गों उठाओ। इन ग्रिडों बहुत छोटे ग्रिड सलाखों है और इस तरह की रुचि के क्षेत्र में कम कोशिकाओं को कवर किया।
- कोट कार्बन के बारे में 0.2-0.4 एनएम मंदिर के इलेक्ट्रॉन बीम के तहत उन्हें स्थिर करने में मदद करने के लिए एक कार्बन coater उपयोग करने के साथ ग्रिड पर वर्गों।
5. इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी
- एक ऊर्जा फिल्टर के साथ सुसज्जित है कि एक मंदिर में ग्रिड लोड करें। माइक्रोस्कोप और निर्माता के निर्देशों के अनुसार ऊर्जा फिल्टर ट्यूनिंग के बाद, कम बढ़ाई मोड में वर्गों पर कक्षों का निरीक्षण (सामान्य संचरण) और तुलना करें(कदम 4.4 में प्राप्त) जब उचित उन्हें डेटा प्रतिदीप्ति।
- दिलचस्प सुविधाओं (डीएनए की क्षति ट्रैक या डीएनए की मरम्मत foci) के साथ एक नाभिक एक बार ऊर्जा छानने मोड के लिए, स्विच पाया और एक मोटाई नक्शा रिकार्ड है।
नोट: यह प्रक्रिया एक शून्य नुकसान और एक अनफ़िल्टर्ड छवि के रिकॉर्डिंग भी शामिल है। 0.3 अप करने के लिए Thicknesses मुक्त पथ (घटना किरण के इलेक्ट्रॉनों का 30% नमूना से बिखरे हुए हो जाता है) अच्छा मौलिक नक्शे उत्पन्न करने के लिए काफी पतली हैं मतलब है। - इस्तेमाल माइक्रोस्कोप की ऊर्जा फिल्टर नियंत्रित करता है कि सॉफ्टवेयर का उपयोग कर तत्वों फास्फोरस और नाइट्रोजन के रिकार्ड अनुपात नक्शे। 20 eV की एक भट्ठा चौड़ाई के साथ भी, 120 eV ऊर्जा नुकसान पर 20 EV और पूर्व किनारे छवियों का एक भट्ठा चौड़ाई के साथ 175 eV ऊर्जा नुकसान में फास्फोरस नक्शा पद किनारे छवियों रिकॉर्ड। यह भी 35 eV की एक भट्ठा चौड़ाई के साथ 358 eV पर 35 EV और पूर्व किनारे छवियों का एक भट्ठा चौड़ाई के साथ 447 eV में नाइट्रोजन नक्शे, रिकॉर्ड पद किनारे छवियों के लिए।
नोट: imaged तत्वों की सामग्री के बाद से (phosphOrus और नाइट्रोजन) (लगभग। 1%), शोर अनुपात करने के लिए एक बेहतर संकेत के साथ छवियों को उत्पन्न करने के लिए "3 खिड़की विधि" पर "अनुपात छवि" (गुणात्मक मौलिक नक्शा) (मौलिक नक्शा quantitate) का चयन अपेक्षाकृत कम है।
6. छवि प्रसंस्करण
- (उदाहरण के लिए, डिजिटल सूक्ष्मछवि) का अधिग्रहण चित्रों की फ़ाइल प्रारूप को संभाल कर सकते हैं कि एक छवि संसाधन सॉफ्टवेयर में मौलिक अनुपात नक्शे खोलें। लाल चैनल और एक आरजीबी छवि के ग्रीन चैनल में फास्फोरस के नक्शे में नाइट्रोजन नक्शे की नकल, तो मिलाना और नक्शे पंक्ति में।
- एक टैग छवि फ़ाइल स्वरूप (झगड़ा) फाइल के रूप में समग्र छवि निर्यात करें। परतों का उपयोग कर सकते हैं कि एक छवि संसाधन सॉफ्टवेयर (जैसे, फ़ोटोशॉप) में छवि खोलें।
- एक 8 बिट डेटा सेट (0-255) करने के लिए छवि में न्यूनतम और अधिकतम मानों rescaling द्वारा प्रत्येक चैनल के गतिशील रेंज को समायोजित करें।
- का उपयोग कर नाइट्रोजन के नक्शे से फास्फोरस सामग्री (घटाएँप्रोटीन के वितरण से पता चलता है कि एक गुणात्मक नक्शा उत्पन्न करने के लिए "परत" विंडो)।
- "सूचीबद्ध रंग" में पिछले चरण में बनाया न्यूक्लिक एसिड (फास्फोरस) और प्रोटीन (नाइट्रोजन) के नक्शे कन्वर्ट और न्यूक्लिक एसिड वितरण और एक सियान देखने की मेज दिखा नक्शे के लिए सीएमवाइके रंग अंतरिक्ष में एक पीले रंग देखने टेबल बना गैर nucleoprotein नक्शा दिखाने के लिए। रंगों दो मौलिक नक्शे के बीच अधिकतम विपरीत उत्पन्न करने के लिए चुना जाता है।
- विभिन्न परतों के रूप में फास्फोरस और प्रोटीन का वितरण दिखा नक्शे एक नई छवि बनाने और आयात करते हैं। एक दूसरे पर आरोपित दोनों परतों को देखने के लिए "स्क्रीन" पारदर्शिता मोड का उपयोग करें।
- कदम 5.2 में अधिग्रहण शून्य नुकसान छवि खोलें। इस छवि को एक पारंपरिक मंदिर छवि की तरह लग रहा है कि दर्ज की गई क्षेत्र की एक छवि का प्रतिनिधित्व करता है, लेकिन केवल नमूना के साथ टकराने के बिना नमूना के माध्यम से पारित कर दिया है कि इलेक्ट्रॉनों में शामिल है। निर्यातएक झगड़ा छवि के रूप में इस छवि।
- एक तस्वीर संपादक में निर्यात शून्य नुकसान छवि खोलें और मौलिक नक्शा दिखा छवि के ऊपरवाला परत में इसे कॉपी। "स्क्रीन" पारदर्शिता मोड का उपयोग कर छवि संरेखित करें।
- वैकल्पिक रूप से सीमा खंड को शून्य नुकसान की छवि miniSOG से निकलती है कि संकेत। ऊपर वर्णित के रूप में एक अलग परत के रूप में जिसके परिणामस्वरूप छवि जोड़ें।
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Representative Results
ईएसआई
पारंपरिक मंदिर छवियों के साथ नाभिक (चित्रा 1) के ईएसआई छवियों की तुलना में (जैसे, चित्रा 7-1) आसानी से प्रतिष्ठित किया जा सकता है कि शारीरिक संरचनाओं में एक नाटकीय वृद्धि का पता चलता है। क्रोमेटिन लकीरें पीले रंग में दिखाई देते हैं और यह माउस कोशिकाओं में chromocenters की पहचान करने के लिए काफी आसान है। पूर्व इकट्ठे राइबोसोम पहले से ही फास्फोरस में समृद्ध है, जो शाही सेना, के अलावा, नाइट्रोजन में समृद्ध है, जो प्रोटीन की उच्च मात्रा में होते हैं, क्योंकि nucleoli आसानी से अपने दौर संरचना और विभिन्न रंग से क्रोमेटिन से प्रतिष्ठित किया जा सकता है। नाभिक और परमाणु छिद्रों की सीमा पर एक पतली परत परिधीय क्रोमेटिन में व्यवधान डाला कि नाइट्रोजन युक्त संरचनाओं के रूप में देखा जा सकता है के रूप में परिधीय क्रोमेटिन रहता है। अक्सर पटल परिधीय क्रोमेटिन के बाहर एक बहुत पतली नीले रंग की परत के रूप में देखा जा सकता है। कोशिका द्रव्य में, फास्फोरस में अमीर कई छोटे कणों कर सकते हैंदेखा गया। ये नाभिक के बाहर उनके आकार, बहुतायत और स्थान के आधार पर राइबोसोम के रूप में पहचाना जा सकता है। interchromatin अंतरिक्ष क्रोमेटिन के बीच स्थित प्रोटीन युक्त क्षेत्र के रूप में देखा जा सकता है। यह परमाणु निकायों और ऐसे ribonucleoprotein कणों और ribonucleoprotein कणिकाओं के समूहों (चित्रा 2) के रूप में छोटे पीले रंग का संकेत है, में समृद्ध क्षेत्रों में शामिल है। उत्तरार्द्ध दाना समूहों interchromatin कहा जाता है और विशेषतया चित्रा 1 बी, सी और डी के इस तरह के mitotic गुणसूत्रों, centrosomes माइटोकांड्रिया और सेंट्रोमीयरों के रूप में अन्य नाम से जाना जाता संरचनाओं की उपस्थिति दर्शाते हैं। पूर्व mRNA splicing के लिए आवश्यक प्रोटीन में समृद्ध कर रहे हैं। चित्रा 2 में, कच्चे मौलिक अनुपात नक्शे से रंग मिश्रित चित्रों को उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल कदम संक्षेप हैं। फास्फोरस नक्शा (हरा) और आरजीबी रंग अंतरिक्ष (ऊपरी पंक्ति) में नाइट्रोजन नक्शा (लाल) के विलय के नमूने में उन तत्वों की मात्रा का एक बेहतर मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है। Howeveआर, CYMK रंग अंतरिक्ष में प्रोटीन का नक्शा (सियान) और फास्फोरस नक्शे के साथ यह विलय (पीला) उपज के लिए नाइट्रोजन के नक्शे से न्यूक्लिक एसिड युक्त संरचनाओं के योगदान को व्यय करना फास्फोरस संकेत घटाकर nucleoprotein का एक और अधिक अलग दृश्य प्रतिनिधित्व प्रदान करता है और गैर nucleoprotein (कम पंक्ति)। इस डाटा को और अधिक आसानी से प्रौद्योगिकी के साथ अपरिचित व्यक्तियों से व्याख्या की जा सकती है।
MDC1, 53BP1 और Rad52 व्यक्त लेजर microirradiated कोशिकाओं
कारण लेजर क्षति पटरियों के उपयोगकर्ता परिभाषित आकार, आकार और स्थान के लिए, लेजर microirradiated कोशिकाओं में थपका बयान के क्षेत्र miniSOG सिस्टम का उपयोग करते समय मंदिर में बहुत आसानी से मिल रहे हैं। कम बढ़ाई संचरण मोड (यानी, पारंपरिक brightfield मंदिर) में लिए गए चित्रों की विशेषता क्षति पटरियों पता चलता है और embedding करने से पहले एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ दर्ज किया गया था कि डेटा के साथ तुलना की जा सकती।Correlative माइक्रोस्कोपी का इरादा है, तो यह आसानी से पहचान और एकल नाभिक के स्थानांतरण की अनुमति देता है, क्योंकि यह विशेष रूप से उपयोगी है। (चित्रा 2-4)।
पहला उदाहरण (चित्रा 3) स्थिरतापूर्वक MDC1 miniSOG-mCherry व्यक्त एक U2OS सेल लाइन से पता चलता है। एक लेजर microirradiation प्रयोग में, miniSOG और mChrerry टैग युक्त MDC1 की भर्ती (नहीं दिखाया डेटा) इस प्रोटीन की GFP टैग संस्करणों के समान था। कोशिकाओं के डीएनए की क्षति शामिल होने के बाद 1 घंटा फिक्सिंग और मंदिर के लिए नमूना तैयार करने, MDC1 क्षति पटरियों आसानी से (प्रतिदीप्ति डेटा को बहुत अच्छी तरह से पत्राचार किया जो नाभिक भर के रूप में अंधेरे धारियों सामान्य मंदिर मोड में अति पतली वर्गों में पहचान की गई है चित्रा 3-5)। प्रोटीन के वितरण को देख, नाइट्रोजन संकेत में एक स्पष्ट वृद्धि लेजर क्षतिग्रस्त स्थलों पर मनाया जा सकता है। यह यह मुख्य रूप से polymerized diami के कारण होता है कि यहाँ से बाहर बताया जा है नाइट्रोजन में समृद्ध है और miniSOG का संकेत amplifies जो nobenzidine, बल्कि पूरी तरह से क्षति ट्रैक में मरम्मत प्रोटीन के संचय के माध्यम से, मरम्मत प्रोटीन चिह्नित। क्षति पटरियों में संरचना के साथ नाभिक के बाकी हिस्सों में क्रोमेटिन संरचना की तुलना में एक स्पष्ट अंतर को दर्शाता है। क्षतिग्रस्त क्रोमेटिन (कि चित्रा 3 में धराशायी लाइनों के भीतर दिखाया गया है) अधिक nucleoplasm में मोटी लकीरें में होता है जो गैर-किरणित क्रोमेटिन के विपरीत decondensed प्रकट होता है। नुकसान पटरियों के भीतर, न्यूक्लिक एसिड से MDC1-miniSOG प्रोटीन से भरपूर लेकिन स्वतंत्र हैं (चित्रा 3 II2, आईआईबी, सेंटर और IIIa में तीर से प्रकाश डाला) परमाणु निकायों (200-300 एनएम) भी मनाया जा सकता है। यह इस तकनीक के बिना क्रोमेटिन मुक्त संरचनाओं के रूप में इन परमाणु शव को परिभाषित करने के लिए बहुत चुनौतीपूर्ण होगा। यह भी MDC1 के नाम से जाना जाता बायोकेमिस्ट्री ने भविष्यवाणी नहीं कर रहा है कि क्षति साइटों के लिए जटिलता के एक अतिरिक्त स्तर पता चलता है।
MDC1 ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में पहले से वर्णित क्षति के रूप में एक ही स्थिति का उपयोग कर बनाया गया था कि 53BP1 (चित्रा 4) का नुकसान पटरियों को देखते ntent ">, बहुत इसी तरह के परिणाम की तस्वीर ऑक्सीकरण द्वारा निर्मित किया गया है। संकेत मनाया जा सकता है miniSOG भीड़ थी और क्रोमेटिन की परतों के बीच की जगह को भरा। भारी दाग परमाणु शव भी (चित्रा 4 डी, ई, एफ में एक तीर से प्रकाश डाला) मनाया जा सकता है।Rad52 GFP के निर्माणों के साथ प्रयोगों से, यह Rad52 छोटे उज्ज्वल microcompartements एक लेजर प्रेरित क्षति ट्रैक के साथ 24 बनेगी कि जाना जाता है। पारंपरिक प्रकाश माइक्रोस्कोप का संकल्प सीमा के कारण, यह है कि वे क्षतिग्रस्त डीएनए से संबंधित हैं कि कैसे बड़े इन संरचनाओं वास्तव में कर रहे हैं और कैसे यह स्पष्ट नहीं किया गया है। अनिवार्यता से Rad52-miniSOG-mCherry व्यक्त लेजर-किरणित U2OS नाभिक के मंदिर छवि को देखते हुए, इन निकायों के आकार के औसत (150-250 एनएम) में होना मापा गया। यह हेइससे भी अधिक आश्चर्य ईएसआई के साथ इन foci को देखने के लिए। पिछले उदाहरण के विपरीत, Rad52-miniSOG-mCherry foci क्षति ट्रैक के साथ काफी अलग तरह का आयोजन होने लगते हैं और प्रोटीन के शामिल है और उनकी इंटीरियर के भीतर नहीं detectable न्यूक्लिक एसिड कर रहे हैं कि कॉम्पैक्ट परमाणु शरीर संरचनाओं की तरह दिखाई देते हैं। हमारे संयुक्त miniSOG और ईएसआई दृष्टिकोण के साथ प्राप्त क्षतिग्रस्त क्षेत्रों में न्यूक्लिक एसिड / प्रोटीन रिश्ते को देख के आधार पर हम डीएनए की मरम्मत foci के सतह पर बजाय इंटीरियर में जगह ले सकती है।
5 शो परिणाम समान चित्रा में कम छवि 3-तृतीय चित्रा के। क्षतिग्रस्त क्षेत्र में क्रोमेटिन अधिक गैर विकिरणित क्षेत्रों में क्रोमेटिन (लाल डैश द्वारा उल्लिखित क्षेत्र देखें) की तुलना में decondensed किया जा रहा है।
गामा विकिरणित कोशिकाओं
लेजर सूक्ष्म विकिरण quickl के लिए एक सुविधाजनक उपकरण हैडीएनए घावों की साइटों पर भर्ती के लिए एक फ्लोरोसेंट टैग होते हैं कि Y परीक्षण प्रोटीन, यह जटिल क्षति (डबल किनारा टूट जाता है, भी कतरा टूटता है, आधार नुकसान, और cyclopyrimidine dimers) 25 की बड़ी मात्रा में पैदा करता है। अधिक सीधे डीएनए डबल किनारा टूट आसपास है कि फार्म के डिब्बों का अध्ययन करने के क्रम में, हम गामा विकिरण करने के लिए कोशिकाओं को प्रकाश में लाने से व्यक्तिगत DSBs के आसपास है कि फार्म DRFs की जांच की।
स्थिरतापूर्वक 53BP1-miniSOG-mCherry कि एक्सप्रेस U2OS कोशिकाओं गामा विकिरण के 2 Gy से अवगत कराया और विकिरण के बाद आधे घंटे तय किया गया। nucleoplasm भर में वितरित बड़े foci के विशेषता पैटर्न (चित्रा 6Ia) मनाया जा सकता है। Diaminobenzidine की तस्वीर ऑक्सीकरण के बाद, फ्लोरोसेंट mCherry संकेतों प्रतिदीप्ति micrographs में स्थित थे, जहां पदों पर उभरते काले धब्बे इलेक्ट्रॉन micrographs (चित्रा 6Ib और ग) में देखा जा सकता है। इन स्थानों छवियों मंदिर के लिए सहसंबद्ध किया जा सकता हैकि (चित्रा 6Id और ई) कम बढ़ाई ले जाया गया। व्यास में लगभग 1-1.5 माइक्रोन होना को दिखाई दिया, जो इन foci के ईएसआई छवियों, एक दिलचस्प संरचना दिखाया। क्रोमेटिन की पतली किस्में लगभग दो बार मोटाई की 53BP1 प्रोटीन के साथ बीच-बीच में जा रहा था।
अन्य प्रयोगों में, कोशिकाओं को विकिरण के एक उच्च राशि से अवगत कराया गया और बाद में समय बिंदुओं बड़ा foci पैदा करते हैं और अति पतली वर्गों में उन्हें पता लगाने की सुविधा के लिए (3 घंटा और 6 घंटा, क्रमशः के बाद) (चित्रा 7) में तय की। हम अलग से nucleoprotein और प्रोटीन मैप करने में सक्षम होते हैं, क्योंकि ईएसआई foci के ढांचे को समय के साथ पुनर्निर्माण करने के लिए दिखाई देते हैं कि पता चलता है। ध्यान में 53BP1 प्रोटीन के रिश्तेदार राशि क्रोमेटिन एक अधिक परिधीय स्थिति लेता है, जबकि बढ़ाने के लिए प्रकट होता है।
53BP1 foci भी दिखाई चूंकि तहत दोहराने के स्थलों पर G1 कोशिकाओं में "गुप्त foci" के रूप में कोशिकाओं को गैर-किरणितडी डीएनए 26,27, उन foci भी imaged थे। इन गुप्त foci विकिरण प्रेरित foci के लिए प्रोटीन रिश्तेदार की उच्च मात्रा में बंदरगाह करने लगते हैं और क्रोमेटिन का एक दिलचस्प नियमित संरचना दिखाने के लिए।
इस प्रकार, miniSOG विधि का उपयोग डीएनए की मरम्मत foci घटक visualizing डीएनए की क्षति के क्षेत्रों की पहचान करने और क्रोमेटिन के लिए टैग मरम्मत प्रोटीन रिश्तेदार के वितरण नक्शा करने के लिए मदद करता है।
एक ईएसआई छवि में देखा जा सकता है कि संरचनाओं की चित्रा 1. अवलोकन यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
एक माउस भ्रूण fibroblast (ए) ईएसआई छवि। क्रोमेटिन लकीरें (पीला) nucleoplasm (सियान) interchromatin सपा को भरने से घिरे रहे हैंऐस। नाभिक परमाणु ताकना परिसरों (सियान) द्वारा बाधित कर रहे हैं कि परिधीय heterochromatin और chromocenters (निचले बाएं) से घिरा हुआ है। nucleoli स्पष्ट रूप से उनके रंग से अलग किया जा सकता है। यह न्यूक्लिक एसिड के लिए प्रोटीन रिश्तेदार की राशि यह क्रोमेटिन में है की तुलना nucleolar संरचना में अधिक है कि इस तथ्य के कारण है। नाभिक के बाहर माइटोकांड्रिया और (न्यूक्लिक एसिड में अमीर) राइबोसोम आसानी से पहचाना जा सकता है।
छवि के ऊपरी बाएँ में खोखले प्रोटीन युक्त कणों के रूप में देखा जा सकता है जो एक नाभिक और centrosomes (तीर देखें), (बी) छवि।
एक मेटाफ़ेज़ प्लेट के माध्यम से (सी) पार अनुभाग। अत्यधिक सघन मेटाफ़ेज़ गुणसूत्रों निचले बाएं कोने में ऊपरी बाएं कोने से फैला है कि एक डिस्क के लिए गठबंधन किया है। नाइट्रोजन की उच्च सांद्रता कुछ गुणसूत्रों की सतह पर दिखाई दे रहे हैं। इन क्षेत्रों में गुणसूत्रबिंदुओं (तीर देखें) कर रहे हैं।
(ऊपरी पंक्ति) पंक्ति में पहले दो चित्रों फास्फोरस और नाइट्रोजन के अनुपात नक्शे दिखा। ऊपरी पंक्ति में पिछले चित्र आरजीबी रंग अंतरिक्ष में आरोपित इन मौलिक नक्शे से पता चलता है। पीला संरचनाओं फास्फोरस और नाइट्रोजन दोनों की उपस्थिति दर्शाती है, nucleoproteins प्रतिनिधित्व करते हैं। (लोअर पंक्ति) पहली तस्वीर मुख्य रूप से नमूने में न्यूक्लिक एसिड के वितरण का पता चलता है जो फास्फोरस नक्शे को दिखाती है। मध्य चित्र न्यूक्लिक एसिड समाप्त / नकारात्मक stru के वितरण से पता चलता है ctures। यह नाइट्रोजन के नक्शे से फास्फोरस नक्शे को घटाकर की गणना की गई। निचले सही तस्वीर न्यूक्लिक एसिड नक्शा और subtractive रंग अंतरिक्ष में प्रोटीन नक्शे की एक मर्ज से पता चलता है। यह रंग मिश्रित व्यक्ति संरचनाओं की पहचान करने में सहायता करने के लिए और nucleoprotein के रूप में उन्हें वर्गीकृत करने के लिए या nucleoprotein नहीं किया जाना चाहिए। फास्फोरस और नाइट्रोजन बहुतायत पर मात्रात्मक जानकारी नेट फास्फोरस और शुद्ध नाइट्रोजन greyscale नक्शे से या इस तरह के शीर्ष पंक्ति के रूप में additive रंग, का उपयोग करके उत्पन्न कंपोजिट से नेत्रहीन इकट्ठा किया जाना चाहिए। 
एक बहु रंग ईएसआई तस्वीर के चित्रा 2. निर्माण 
स्थिरतापूर्वक MDC1-miniSOG-mCherry व्यक्त U2OS कोशिकाओं की चित्रा 3. लेजर सूक्ष्म विकिरण। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
आईसी में एक हरे वर्ग से प्रकाश डाला (द्वितीय) क्षेत्र, बढ़ाया और सामान्य प्रसारण विधा (आईआईए) और ईएसआई (IIb) में दिखाया गया था। सेंटर क्षति ट्रैक के संकेत के साथ ईएसआई छवि का एक ओवरले से पता चलता है। क्षति ट्रैक संकेत ऊपरी छवि thresholding द्वारा प्राप्त किया गया था।
(तृतीय) लेजर सूक्ष्म की संरचना के उदाहरणलेजर क्षतिग्रस्त क्षेत्र के बाहर -irradiated क्रोमेटिन और क्रोमेटिन।
स्थिरतापूर्वक 53BP1-miniSOG-mCherry व्यक्त कोशिकाओं की चित्रा 4. लेजर सूक्ष्म विकिरण। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
वाम स्तंभ: (ए) प्रतिदीप्ति, (बी) पारंपरिक मंदिर और नाभिक किरणित ही लेजर सूक्ष्म (सी) ईएसआई छवि।
सही कॉलम: (डी) पारंपरिक मंदिर, (ई) ईएसआई और (डी) के thresholding द्वारा खंडित किया गया था कि miniSOG संकेत के साथ ईएसआई छवि के (एफ) ओवरले (कदम 6.10 देखें)
स्थिरतापूर्वक Rad52-miniSOG-mCherry व्यक्त करने और लेजर सूक्ष्म विकिरण से क्षतिग्रस्त चित्रा 5. U2OS सेल लाइन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
निचले बाएँ पर एक नुकसान ट्रैक के साथ एक microirradiated लेजर U2OS नाभिक दिखा एक कम बढ़ाई मंदिर छवि के साथ एक प्रतिदीप्ति छवि (ए) ओवरले।
एक लेजर सूक्ष्म (बी) प्रतिनिधि confocal प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी छवि को नुकसान पहुंचा ट्रैक (लाल संकेत) के साथ छोटे foci के विशेषता पैटर्न दिखा Rad52-miniSOG-mCherry व्यक्त Hoechst से सना हुआ नाभिक (नीला) किरणित।
(सी) पारंपरिक मंदिर, (डी) ईएसआई,
पूरे नाभिक के संदर्भ में एक लेजर प्रेरित क्षति ट्रैक दिखा स्थिरतापूर्वक Rad52-miniSOG-mCherry व्यक्त एक और U2OS नाभिक (G) ईएसआई छवि।
चित्रा स्थिरतापूर्वक 53BP1-miniSOG-mCherry व्यक्त 6. U2OS कोशिकाओं 2 Gy के साथ विकिरणित और 30 मिनट के बाद तय की। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
(मैं) एक) प्रतिदीप्ति छवि गामा विकिरण प्रेरित 53BP1 foci दिखा। ख) photopolymerization के बाद प्रकाश छवि प्रेषित किया। ग) Ovप्रेषित प्रकाश छवि के साथ प्रतिदीप्ति की erlay। घ) कम बढ़ाई मंदिर छवि (काली पट्टी) एक मंदिर ग्रिड पट्टी है। कम बढ़ाई मंदिर छवि के साथ फ्लोरोसेंट छवि के ई) ओवरले।
सामान्य मंदिर में और ईएसआई मोड में दर्ज प्रेषित प्रकाश छवि में एक तारांकित के साथ लेबल (द्वितीय) क्षति ध्यान केंद्रित। क) शून्य-हानि, ख) ईएसआई, ग) फास्फोरस, घ) प्रोटीन ई) ओवरले ईएसआई और शून्य नुकसान छवि से खंडों संकेत।
सामान्य मंदिर में और ईएसआई मोड में दर्ज प्रतिदीप्ति छवि में एक क्रॉस के साथ लेबल (तृतीय) क्षति ध्यान केंद्रित। क) शून्य-हानि, ख) ईएसआई, ग) फास्फोरस, घ) प्रोटीन ई) ओवरले ईएसआई और शून्य नुकसान छवि से खंडों संकेत।
विकिरण के अलग अलग समय के बाद foci के बीच foci संरचना में चित्रा 7. परिवर्तन। < / Strong> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
U2OS 53BP1 miniSOG mCherry कोशिकाओं 3 ज (1 ए-ई, एफजे) और क्रमश: 6 (2 ए-ई, एफजे) के बाद तय गामा विकिरण के 6 Gy से अवगत कराया। 3 एक गुप्त फोकस (एई) दिखा एक unirradiated U2OS 53BP1 miniSOG mCherry नाभिक से पता चलता है। ईएसआई चित्रों आदेश ईएसआई (न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन), न्यूक्लिक एसिड (अकेले), प्रोटीन (अकेले), ईएसआई (न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन) में प्रस्तुत + miniSOG संकेत खंडित होते हैं।
आज़मियम tetroxide के साथ पोस्ट निर्धारण छोड़ा जाता है जब 8 चित्रा डीएनए की मरम्मत foci अभी भी परंपरागत प्रसारण विधा में दिखाई दे रहे हैं। arge.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
आज़मियम tetroxide के साथ इलाज नहीं किया गया था कि एक नमूना से दो 53BP1 foci दिखा एक U2OS नाभिक की Ultrathin धारा (50 एनएम)। (ए) पारंपरिक मंदिर मोड में, यह भी साथ इसके विपरीत बढ़ाने के बिना थपका बहुलक द्वारा दाग साइटों को देखने के लिए संभव है भारी धातु दाग। (बी) foci के विपरीत आगे (बहुवचन बिखरने की घटनाओं से लगता है कि मूल सभी इलेक्ट्रॉनों दूर छानने) शून्य नुकसान छवियों को लेने से बढ़ाया जा सकता है।
मानचित्रण फास्फोरस के लिए इष्टतम ऊर्जा खिड़की सेटिंग्स की 9 चित्रा निर्धारण
(ए) 120 eV पर 155 eV पर पोस्ट बढ़त के साथ फास्फोरस और पूर्व में बढ़त के लिए दर्ज मौलिक अनुपात नक्शा।
सामग्री "> (बी) के मौलिक अनुपात नक्शा 120 eV पर 175 eV पर पोस्ट बढ़त के साथ फास्फोरस और पूर्व बढ़त के लिए दर्ज की गई।(सी) 120 eV ऊर्जा नुकसान और इसके विपरीत में सबसे अच्छा है कि संयोजन निर्धारित करने के लिए 140-200eV ऊर्जा नुकसान से लेकर एक चर के बाद बढ़त खिड़की पर एक निरंतर पूर्व किनारे खिड़की से फास्फोरस अनुपात नक्शे गिना जा रहा है। एक ही फास्फोरस अमीर और फास्फोरस गरीब क्षेत्र में फैले एक पंक्ति स्कैन में प्रतिभाशाली की तीव्रता का अंतर और dimmestpixel 175 eV ऊर्जा नुकसान की एक के बाद बढ़त के चित्र के लिए चुना गया था जब उच्चतम विपरीत मूल्यों (गतिशील रेंज) से पता चलता है।
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Discussion
ईएसआई यह विशेष रूप से फास्फोरस में अमीर हैं कि क्षेत्रों के नक्शे में सक्षम है क्योंकि नाभिक में क्रोमेटिन और ribonucleoproteins के विभिन्न राज्यों की जांच के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण के रूप में काम कर सकते हैं। यह गहराई से एक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के द्वारा प्राप्त की और अविशिष्ट विषम तरीकों पर निर्भर नहीं है कि हो सकता है विस्तार की राशि बढाती है। ईएसआई का एक नुकसान यह उसी को बढ़ाने वोल्टेज पर पारंपरिक मंदिर की तुलना में पतली वर्गों की आवश्यकता है। इस धारावाहिक वर्गों के साथ काम करने या tomographic तरीकों 28 का उपयोग करके दूर किया जा सकता है।
जानकारी का एक बहुत फास्फोरस और नाइट्रोजन के वितरण को देखकर प्राप्त किया जा सकता है, यह भी निश्चित प्रोटीन का वितरण नक्शा करने के लिए सक्षम होने के लिए ब्याज की है। विधि इस अखबार में प्रस्तुत के साथ, यह ईएसआई diaminobenzidine की साइट विशेष polymerization के आधार पर कर रहे हैं कि तरीकों के साथ जोड़ा जा सकता है कि प्रदर्शन किया गया। इस पद्धति का एक फू जोड़ नहीं है यद्यपिईएसआई के लिए करूँगा नए रंग, यह एक प्रोटीन का वितरण नक्शा करने के लिए स्पष्ट रूप से उपयोगी है। इस क्रोमेटिन के साथ बातचीत कि प्रोटीन के लिए विशेष रूप से लागू होता है। एक अध्ययन के एक से अधिक प्रोटीन आबादी कल्पना करने की जरूरत है से पहले फोटो ऑक्सीकरण से 9, पूर्व embedding धुंधला के रूप में लागू है, जब immunogold का उपयोग कर लेबलिंग तरीकों अभी भी प्रयोग किया जा सकता है। स्थिर सेल लाइनों की तुलना में, क्षणिक transfections अभिव्यक्ति के स्तर कोशिकाओं के बीच काफी भिन्न है और इस प्रकार यह मुश्किल टैग प्रोटीन की समान मात्रा में व्यक्त कई कोशिकाओं को खोजने के लिए कर सकते हैं कि नुकसान है। इसलिए, स्थिर सेल लाइनों के निर्माण की सिफारिश की है। हालांकि, यह प्रतिदीप्ति इमेजिंग का उपयोग प्रोटीन अभिव्यक्ति के रिश्तेदार राशि न्यायाधीश और क्षणिक अभिकर्मक निम्नलिखित मध्यवर्ती अभिव्यक्ति के साथ कोशिकाओं का चयन करने के लिए संभव है।
MiniSOG संलयन टैग ही फ्लोरोसेंट है हालांकि, इसकी क्वांटम उपज GFP (0.37 बनाम 0.6) 10 की तुलना में काफी बदतर है। Purp के लिएmCherry की तरह एक अतिरिक्त फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैग जोड़ने correlative माइक्रोस्कोपी के ose, miniSOG उत्तेजना के साथ होता है कि स्वेटर ऑक्सीजन के उत्पादन के बिना जीवित कोशिकाओं में इमेजिंग की अनुमति देता है। miniSOG टैग प्रोटीन की अभिव्यक्ति के स्तर, थपका युक्त बफर में ऑक्सीजन की मात्रा, और पीएच भी फोटो ऑक्सीकरण की गति को प्रभावित कर सकते हैं। कभी कभी यह क्योंकि तस्वीर ऑक्सीकरण प्रतिक्रिया के प्रकाश निर्भरता के हित के क्षेत्र में समरूप फोटो ऑक्सीकरण प्राप्त करने के लिए काफी समस्याग्रस्त हो सकता है। लम्बे समय तक तस्वीर ऑक्सीकरण अविशिष्ट धुंधला और ईएसआई द्वारा तत्व-विशिष्ट संकेतों का पता लगाने जटिल हो सकता है, जो नमूने में बहुत ज्यादा भारी धातु के बयान करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। फोटो ऑक्सीकरण प्रक्रिया इतनी है कि आमतौर पर coverslip पर कुछ कोशिकाओं से युक्त केवल एक बहुत छोटे से क्षेत्र में सामान्य रूप से दाग रहे हैं काफी समय लगता है।
हम miniSOG का संयोजन एक पक्षपाती की हू एक monolayer का उपयोग कर ईएसआई के साथ टैग प्रोटीन से पता चला हैआदमी कैंसर कोशिका लाइन। प्रिंसिपल, विधि भी जब तक यह miniSOG टैग उचित स्तर पर प्रोटीन और जब तक translucency और ऑक्सीजन के प्रसार को व्यक्त करने के लिए संभव है और थपका है के रूप में किसी अन्य नमूना (खमीर, बैक्टीरिया, ऊतक, भ्रूण) को लागू किया जा सकता समुचित फोटो ऑक्सीकरण और इस तरह समरूप धुंधला अनुमति देने के लिए पर्याप्त रूप से उच्च। निलंबन कोशिकाओं के लिए, यह एक ऐसी पाली एल लाइसिन के रूप में एक चिपकने का उपयोग एक कवर पर्ची पर कोशिकाओं के स्थान तय करने के लिए फायदेमंद होगा। मोटा नमूने के लिए, एक कम संख्यात्मक एपर्चर के साथ उद्देश्यों के लिए एक अधिक समरूप रोशनी को प्राप्त होगा, लेकिन तस्वीर-oxidize के लिए लंबे समय तक ले।
। आज़मियम tetroxide के उपयोग सहित - हम संभव के रूप से शू एट अल 10 प्रकाशित मूल प्रोटोकॉल के करीब के रूप miniSOG टैग संलयन प्रोटीन का उपयोग प्रस्तुत किया है। वहाँ यह अलग अधिमान्यतया थपका-पॉलिमर और झिल्ली पर जमा करने से, आज़मियम tetroxide कुछ जेट से पता चलता है, कि मनाया जा सकता है औरनमूना में जैविक सामग्री (10 चित्रा 3) के अधिकांश पर बयान। आज़मियम tetroxide 45 eV में एक मौलिक बढ़त है। यह संकेत है और इसके plasmons नमूना के माध्यम से पारित होने के दौरान कई ऊर्जा नुकसान की घटनाओं से गुजरना नमूना बढ़ जाती है और एकल इलेक्ट्रॉनों की मोटाई के रूप में इलेक्ट्रॉन ऊर्जा नुकसान स्पेक्ट्रम पर आरोपित किया जा सकता है। उच्च Oso 4 सांद्रता नमूना तैयार करने में इस्तेमाल कर रहे हैं तो यह फास्फोरस मौलिक नक्शे की गुणवत्ता में सीमित कर सकते हैं। पहले से 10 का इस्तेमाल किया गया है की तुलना में काफी कम हैं, जो हम यहाँ का इस्तेमाल किया है कि सांद्रता, अच्छी गुणवत्ता फास्फोरस नक्शे की पीढ़ी की अनुमति दी। का उपयोग करते हुए एक प्रयोग में miniSOG उच्च Oso 4 सांद्रता की मांग है कि टैग प्रोटीन, अभी भी अच्छा फास्फोरस नक्शा निर्माण की अनुमति देता है कि सबसे अच्छा एकाग्रता अनुभव से निर्धारित करना होगा।
हम डीएनए की मरम्मत foci पर कि रूपों थपका बहुलक sufficie है कि मिल गया हैआज़मियम tetroxide के साथ पोस्ट-निर्धारण छोड़ा जाता है, तब भी जब (यहां तक कि बेहतर विपरीत के साथ या शून्य नुकसान मोड में) ntly पारंपरिक मंदिर मोड में देखा जाना चाहिए घने (8 चित्रा देखें)। इस तरह से दर्ज किए गए संकेतों के विभाजन आज़मियम साथ इलाज किया गया है कि नमूने का उपयोग कर के रूप में मजबूत था। कल्पना की हो गया है कि परमाणु प्रोटीन पर निर्भर करता है, यह रूपों संरचनाओं के आकार और झिल्ली प्रणालियों कल्पना करने के लिए आवश्यकता है, आज़मियम tetroxide का उपयोग आवश्यक नहीं हो सकता है और अपनी चूक फास्फोरस की मौलिक हस्ताक्षर मास्किंग की क्षमता को हटा देगा।
ईएसआई 18,29,30 का उपयोग अन्य प्रकाशनों की तुलना में हम शोर कम से कम राशि के साथ मौलिक अनुपात नक्शे उत्पन्न करने के क्रम में पूर्व और बाद के किनारे चित्रों के लिए विभिन्न सेटिंग्स का इस्तेमाल किया है। हम अनुभव से पांडुलिपि में प्रस्तुत सेटिंग्स निर्धारित किया है (9 चित्रा देखें)। किनारों के आसपास चुना सेटिंग्स हाथी सही करने के लिए नेतृत्व करना चाहिएसंग्रह खिड़कियों जब तक मानसिक नक्शे नमूने में मौजूद हैं कि अन्य तत्वों के साथ ओवरलैपिंग कर रहे हैं। हमारे मामले में, सल्फर इस तरह के एक तत्व हो सकता है। (अमीनो एसिड methionine और सिस्टीन में होता है) सल्फर की एकाग्रता बहुत कम है और केवल एक नगण्य राशि में गणना नक्शा करने के लिए योगदान देता है के बाद से, हम नुकसान outweighs यहां इस्तेमाल सेटिंग्स का उपयोग कर प्राप्त बेहतर है कि एस / एन अनुपात का मानना है कि नमूने में सल्फर के निशान से पैदा हो सकता है।
हम ईएसआई और मंदिर तकनीक के साथ संयुक्त डीएनए की मरम्मत प्रोटीन MDC1, 53BP1 और Rad52 का उपयोग कर नैनोमीटर प्रस्तावों पर DRFs के फैटी का पता चला। क्रोमेटिन और व्यक्तिगत डीएसबी मरम्मत प्रोटीन स्थानीयकरण के संगठन इस दृष्टिकोण का उपयोग कर हल किया गया था। क्रोमेटिन लकीरें के बीच की जगह को भरने के लिए लेजर सूक्ष्म विकिरण डीएनए और मरम्मत प्रोटीन की प्रवृत्ति निम्नलिखित डीएनए घावों में अमीर डोमेन में उनके स्थानीयकरण दिखाया गया था। Rad52 का मामला है, जो पीएलए मेंवाईएस मुताबिक़ पुनर्संयोजन में एक भूमिका, लेजर क्षतिग्रस्त ट्रैक के साथ परमाणु शरीर की तरह गोलाकार संरचना के गठन मनाया जा सकता है और यह अन्य दो का परीक्षण किया प्रोटीन के विपरीत था। क्षति गामा विकिरण से लागू किया जाता है, 53BP1 क्षतिग्रस्त क्रोमेटिन के आसपास foci गठन किया था। foci में क्रोमेटिन और प्रोटीन के रिश्तेदार रचना और स्थिति समय के साथ बदल रहा है। ये प्रोटीन और क्रोमेटिन के संगठन में क्षतिग्रस्त क्रोमेटिन रूप में भी परिवर्तन और परमाणु निकायों की संरचना के बीच संबंधों को सभी को आसानी से सीधे इन गुणों का आकलन नहीं कर सकते हैं के रूप में विषम एजेंटों यूरेनियम का उपयोग करने और नेतृत्व पारंपरिक brightfield माइक्रोस्कोपी जबकि ईएसआई तकनीक का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है। इस प्रकार, इस तकनीक को विशेष रूप से डीएनए पर अभिनय प्रक्रियाओं के लिए संरचना समारोह संबंधों के अध्ययन के लिए उच्च क्षमता का पता चलता।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Gridded 35 mm glass bottom dishes | MatTek | P35G-2-14-CGRD | not made for immersion objectives |
| LR White: acryl resin | emsdiasum | 14381 | |
| LR White accelerator | emsdiasum | 14385 | |
| 3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets | Sigma | D5905 | |
| Slim Bar Grids 300 Mesh | SPI | 1161123 | |
| Tungsten-Point Lab Pen | emsdiasum | 41148 | |
| Osmium Tetroxide | emsdiasum | 19100 | |
| Carbon Coater 208 carbon | Cressington | ||
| Ultra microtome Leica EM UC6 | Leica | ||
| Photoshop CS5 | Adobe | might even work with older versions | |
| Digital Micrograph V.2.30 | Gatan | might even work with older versions | |
| Hoechst 33342 | Sigma | H-1399 | |
| Effectene | Quiagen | ||
| MiniSOG-Constructs | Tsien-Lab | tsienlab@yahoo.com | |
| MDC1 miniSOG mCherry | |||
| 53BP1 miniSOG mCherry | |||
| Rad52 miniSOG mCherry | |||
| cesium 137 radiation source "MARK 1" | (J.L. Shepherd & Associated) | ||
| ImageJ/FiJi | open source | http://fiji.sc/Fiji | |
| 2 ml Eppendorf tubes | Fisherbrand | 05-408-146 | |
| Diamond Knife ultra 35° | Diatome | ||
| Trimming Knife ultratrim | Diatome | ||
| Sodium cacodylate trihydrate | emsdiasum | 12300 | Caution Toxic! |
| Glutaraldehyde EM Grade 8% | emsdiasum | 16020 | Caution Toxic! |
| Sodium phosphate dibasic | emsdiasum | 21180 | |
| Sodium phosphate monobasic | emsdiasum | 21190 | |
| Paraformaldehyde | emsdiasum | 19202 | |
| Osmium tetroxide 4% solution | emsdiasum | 19150 | |
| Inverted Fluorescence Micoscope Axiovert 200M | Zeiss | ||
| Hydrochloric Acid | Fisherbrand | A142-212 | |
| Sodium Hydroxide Solution 10M | Fluka | 72068 | |
| Oxygen | Medigas | ||
| 3-Amino-1,2,4-triazole | Sigma | A8056 | |
| Potassium cyanide | Sigma | 207810 | Caution Toxic! |
| Ethanol | emsdiasum | 15058 | Caution Toxic! |
| Razor blade Single Edge Carbon Steel | emsdiasum | 71960 | Caution Sharp! |
| DMEM | Sigma | D 5546 | |
| FBS | Life Technologies | 16000-044 | |
| G418 | Life Technologies | 11811-023 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Transmission Electron Microscope 200 kV | JEOL | 2100 | |
| GIF Tridiem 863 Energy filter | Gatan |
References
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