Abstract
Gränserna för optisk upplösning och utmaningen att identifiera specifika proteinpopulationer i transmissionselektronmikroskop har varit hinder i cellbiologi. Många fenomen kan inte förklaras genom in vitro-analys i förenklade system och behöver extra strukturell information på plats, i synnerhet i området mellan 1 nm och 0,1 | im, för att till fullo förstås. Här, elektron spektroskopiska avbildning, ett transmissionselektronmikroskop teknik som möjliggör samtidig kartläggning av fördelningen av proteiner och nukleinsyror, och ett uttryck tag, miniSOG, kombineras för att studera struktur och organisation av DNA dubbelsträngsbrott reparation fokus.
Introduction
Trots de betydande framsteg i ljusmikroskop under de senaste åren 1, cellbiologer lider fortfarande av en lucka i upplösning. Detta begränsar förståelsen av struktur-funktionssamband i fundamentala cellulära processer som involverar en samordnad samspelet mellan makromolekylära komplex (t ex i kromatin remodeling, DNA-reparation, RNA-transkription och DNA-replikation). Även om transmissionselektronmikroskop (TEM) s tillhandahålla den erforderliga upplösningen, har det varit en utmaning att definiera dessa processer strukturellt på grund av oförmågan att märka specifika proteiner och samtidigt kunna bestämma den biokemiska sammansättningen av de visualiserade strukturer. I avsaknad av interna membran för att skilja kärnstrukturer, har kärnan varit särskilt utmanande. Elektron spektroskopisk avbildning (ESI) löser några av dessa begränsningar genom att tillåta samtidig detektion och differentiering av DNA, RNA och protEin-baserade kärnstrukturer 2-5.
Electron spektroskopisk avbildning:
För att kartlägga elementära fördel med hög känslighet och upplösning i elektronmikroskop, kan man använda en avbildande spektrometer som väljer elektroner som har oelastiskt spridda genom interaktioner med inre skal elektroner på ett element i provet 6. Eftersom Elementspecifika energimängder förloras som en följd av jonisering av atomerna i provet, kan dessa elektroner separeras och visualiseras med användning av en spektrometer som är fäst till elektronmikroskop. Således, analys av spektrumet av elektroner som har interagerat med provet visar kvalitativ och kvantitativ information om grundämnessammansättningen av provet 7. Elektroner som inte förlorar energi när tåget passerar genom provet finns i "noll-förlust topp" av energiförlusten elektronspektrum. Överflödet av dessa elektroner är relaterad till massan, densiteten och tjockleken hos provet och består av elektroner som passerar genom provet utan att kollidera med provet eller förlora energi när de passerar genom provstycket. Denna information kan vara användbar för absolut kvantifiering av antalet atomer av en särskild del som föreligger i provet 8.
Eftersom biologiska prover består till största delen av lätta element som är dåligt avböjer elektronerna i den infallande strålen av TEM, färgningsmetoder med hjälp av heavy metal alter måste tillämpas för att generera kontrasten i provet. Avsaknaden av specificitet hos de flesta av dessa kontrasterande medel och oförmåga att visualisera mer än en fläck där specificiteten är möjligt har begränsat värde på konventionell elektronmikroskopi i studien av kärnan. ESI har betydande fördelar jämfört med konventionell TEM, särskilt för studium av strukturer i cellkärnan.Det är möjligt att utnyttja den fosfor-rika naturen hos DNA- och RNA-innehållande makromolekylära komplex att skilja nukleoprotein komplex från proteinkomplex och att lösa olika nukleoprotein komplex baserat på deras densitet av nukleinsyror. Det återstående biologiskt material kan avbildas baserat på dess överflöd av kväve. Kartläggning just dessa två element och analyser av deras fördelning och relativ förekomst inom olika anatomiska strukturer ger oss en hel del information om kärnan. Till exempel, är det lätt att identifiera kromatin och ribosomerna i kartan som representerar fosfor överflöd. Den interchromatin utrymme, nukleära porer komplex, och kärnorgan, å andra sidan, kan lätt detekteras i kväve kartbild.
Mini singletsyre generatorsystem (miniSOG)
Medan ESI representerar en kraftfull teknik för att studera in situ kromatinstruktur eftersom det tars fördel av de karakteristiska förhållandena i elementär sammansättning mellan fosfor och kväve, grundämnessammansättningen kan normalt inte användas för att skilja mellan olika populationer av proteinkomplex. Antikroppar märkta med små guldpartiklar i nanometerområdet har ofta använts för att kartlägga lokaliseringen av individuella molekyler. Eftersom guldpartikel är vanligtvis fäst till en sekundär antikropp, kommer den att visas inom en omkrets på cirka 20 nm runt epitopen detekteras av den primära antikroppen. I efter inbäddning prover kan antikroppar bara upptäcka epitoper som är exponerade på ytan av sektionerna. Även om det är möjligt att bevisa närvaron av ett antigen och koppla denna till en viss anatomisk struktur hos cellen, den information som erhålls är ofullständig, eftersom de flesta av epitoperna skyms av harts. Pre-inbäddning teknik, som använder liknande protokoll till dem som används för fluorescensmikroskopi, ge tillgång till antigener helahela djupet av provet men Permeabilization åtgärder som krävs för att göra det möjligt för antikroppen att penetrera cellen typiskt kräver avlägsnande av lipidmembran och ta bort komponenter som inte kan fastställas av aldehyder. Dessutom är den föredragna aldehyden fixativ för ultrastrukturen konservering, glutaraldehyd, förstör allmänt epitoper och följaktligen är paraformaldehyd typiskt krävs. Detta är mindre effektiv på protein-proteintvärbindning. En annan nackdel med antikroppar som är märkta med en guldnanopartiklar är att guld är en mycket elektrontätt material som skapar en stark kontrast som kan dölja intressanta konstruktionsdetaljer av provet, som har svagare kontrast.
Framväxten av det grönt fluorescerande protein (GFP) som en uttryckt protein tag har förändrat användningen av fluorescensmikroskopi att svara på frågor i cellbiologi. Märka ett protein med en liten fluorescerande domän tillåter kartläggning av dess fördelning in vivo 9. Reaktionsprodukterna av HRP kan också diffundera bort från platsen för generation så att deras upplösning är värre än nanoguld metoden 10. För att kringgå dessa problem, var blixten / ReAsH system utvecklat 11. Den består av rekombinanta fusionsproteiner som uppvisar en tetracysteine motiv. Detta motiv möjliggör bindning aven biarsenic fluorofor. När den exciteras, är den bundna FLASH eller ReAsH kunna generera den mycket reaktiva syre i singlettillstånd och sålunda photoconvert diaminobensidin (DAB) till en polymer som faller ut omedelbart vid stället för de märkta proteinerna. DAB-polymeren kan färgas med osmiumtetroxid, vilket är elektrontätt och kan sålunda användas för att kartlägga fördelningen av det rekombinanta fusionsproteinet i TEM.
Under 2011, Shu et al. 10 presenterade miniSOG systemet, som består av en liten 106 aminosyror fusion tag härrör från en flavoprotein av Arabidopsis som är fluorescerande och kunna skapa många singsyreradikaler när den exciteras med 448 nm blått ljus. Dessa singlett syreradikaler kan användas för att foto oxidera diaminobensidin för att bilda polymerer på och nära ytan av det märkta proteinet, vilket är avsevärt närmare än immunoguld märkta antikroppar 11. Medan blixten / ReAsH system kräver att föra fluorkrom och diaminobenzidin in i cellerna innan göra photoconversion det miniSOG systemet kräver bara diaminobensidin och ljus och dessutom är ungefär dubbelt så effektivt på att polymerisera diaminobensidin. Här, är miniSOG används i kombination med ESI för att kartultrastrukturen av DNA-reparations foci.
DNA-reparations fokus (DRF)
Oreparerad DNA-dubbelsträngbrott utgör ett allvarligt hot mot cellen eftersom de kan leda till translokationer och förlust av genetisk information. I sin tur kan detta leda till senescens, cancer och celldöd. Många proteiner som är involverade i DNA-dubbelsträngbrott reparation ackumuleras i fokus som samlas runt en DNA dubbelsträng bryta 12-14. Även om deras funktion inte är känd, de representerar den plats i kärnan som innehåller den DNA-dubbelsträngbrott och är platsen för DNA-dubbelsträngbrott reparation.
DNA-reparations Foki (DRF) har präglats av fluorescensmikroskopi och de tjänar som biomarkörer för DNA-skada 12,15. De är enorma i förhållande till storleken på den dubbelsträngbrott och ansågs relativt homogen fram till de senaste super-upplösning mikroskopi studier visade vissa tecken på sub-uppdelning av molekyler inom varje fokus 16. För att förstå hur dessa platser är organiserade, är det nödvändigt att visualisera alla de underliggande biologiska strukturer i förhållande till varandra. Detta kan inte uppnås genom fluorescensmikroskopi men är möjligt genom elektronmikroskopi 17,18. Här beskrivs en metod som kombinerar elektron spektroskopisk avbildning med miniSOG metoden för att illustrera möjligheterna med denna kombinerade tillvägagångssättet för att undersöka ultrastrukturen av DNA dubbelsträngbrott reparation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generering av miniSOG cellinjer
- Grow U2OS (humant osteosarkom) celler i en 35 mm skål innehållande 2 ml låg glukos Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) som kompletteras med 10% fetalt bovint serum (FBS) vid 37 ° C i en fuktad inkubator med 5% CO2 atmosfär.
- Transfektera cellerna när de är 80% sammanflytande genom lipofektion med renat transfektion kvalitet (A269 / 280 förhållandet 1,8-2,0) plasmidkonstruktioner innehåller sekvenserna för miniSOG och mCherry taggade reparationsproteiner enligt protokollet av tillverkaren av transfektionsreagens 19. De miniSOG expressionsplasmider kan beställas från Tsien-Lab: http://www.tsienlab.ucsd.edu/Samples.htm
- Sortera de celler som uttrycker det rekombinanta proteinet med miniSOG och mCherry tagg genom fluorescensaktiverad cellsortering två dagar efter transfektion. Samla cellernamed mellanliggande fluorescensintensitet för att undvika celler som överuttrycker 20.
- Kultur de positiva celler på en 10 cm skål i 10 ml DMEM-medium som kompletterats med 10% FBS och 0,6 | ig / ml av selektionsmedlet G418 (Geneticin).
- Efter synliga kolonier har uppstått på plattorna, skärm för mCherry positiva kolonier med användning av ett inverterat fluorescensmikroskop och rita cirklar runt dem (på botten av plattan) med en permanent markör. Använd en låg förstoring luft objektiv (t.ex. 10x) och plocka kloner med användning av steril teknik genom att försiktigt skrapa kolonierna bort och långsamt suger in dem i en steril 1000 mikroliter pipettspets.
- Expandera utvalda kolonierna och frysa delar av dem ner med tillväxtmediet som beskrivs i steg 1,1 kompletterat med 10% dimetylsulfoxid. Testa cellerna för DRF bildning genom att odla dem på sterila 18 x 18 mm 2 täckglas och utsätta dem för2 Gy av strålning. De bestrålade celler som stabilt uttrycker en miniSOG mCherry taggade reparation protein måste visa det typiska bränn mönster som är karaktäristiskt för DSB när visualiseras med ett fluorescensmikroskop med ett filter-set för avbildning mCherry.
2. Cellkultur
- Kultur U2OS celler som stabilt uttrycker miniSOG och mCherry taggade reparation proteiner under de villkor som anges i steg 1.1. Odla celler till 80% sammanflytning i en 35 mm diameter glasbottenskål innehållande 2 ml DMEM. Se till att det lim som fäster locket glida till plasten och den använda plasten är resistent mot vattenhaltiga och alkohollösningar och motståndskraftigt mot det använda hartset!
- Före genomförande experimentet skissera ett litet område av ungefär 1 mm 2 som innehåller celler som uttrycker de ektopiska proteiner genom skrapning med en steril diamant penna med användning av ett fluorescensmikroskop för att identifiera regionen av intresse. Alternativt kan du använda en glasbotten maträtt thatt innehåller en täck med en pre-etsade galler som är inbyggt i täck.
OBS: Om du använder högkvalitativa korrelat mikroskopi kombinerar ESI och fluorescens mikroskopiska bilder 21, se till att tjockleken av täck är kompatibel med oljeimmersions mål. Det borde ha tjockleken nr 1,5 (0,16-0,18 mm). Välj ett område nära centrum av skålen för regionen som skall undersökas i TEM för att undvika problem med polymerisation av harts som kan inträffa i närheten av kanterna (se punkt 4,10 till 4,13).
3. DNA-skador Induktion
- Bestråla cellerna med gammastrålning, använd en radiomimetiska läkemedel, eller inducera skada genom lasermikro bestrålning på ett konfokalt mikroskop (t.ex. såsom beskrives i 18,22 eller 23).
- I detta exempel, bestråla cellerna med 2 och 6 Gy gammastrålning i en cesium-137 strålningskälla eller laser microirradiate använder 405 nm solenid state laser med en konfokalmikroskop efter sensibilisering cellerna under 20 minuter med 0,5 ng / ml Hoechst.
4. Provberedning
- Fixera cellerna med 1 ml 4% paraformaldehyd FÖRSIKTIGHET i 0,1 M natriumkakodylatbuffert eller i 0,1 M fosfatbuffert pH 7,4 under 30 min vid RT i mörker.
VARNING: Paraformaldehyd och natriumkakodylat är giftiga! Använd handskar och avyttra giftiga ämnen på lämpligt sätt. - Tvätta cellerna två gånger med 4 ml 0,1 M natrium-kakodylatbuffert pH 7,4 eller fosfatbuffert pH 7,4.
- Behandla de fixerade cellerna med 2 ml 50 mM glycin, 5 mM aminotriazol och 10 mM kaliumcyanid FÖRSIKTIGHET i 0,1 M natriumkakodylatbuffert eller 0,1 M fosfatbuffert (pH 7,4) (kontrollera pH-värdet!) För 30 min för att blockera oreagerade aldehydgrupper och att undertrycka de reaktiva syreradikaler genereras av heme-grupper, vilket kan öka bakgrunden.
VARNING: Kaliumcyanid är extremt giftigt! Wöron handskar, arbeta under en huva och avyttra giftiga ämnen på lämpligt sätt. Reaktionen är mycket känslig för pH så det är viktigt att pH kontrolleras och exakt. - Spela det område som valdes i steg 2.2 i 2D eller 3D på ett inverterat fluorescensmikroskop, om korrelat mikroskopi önskas.
- Bered en 1 mg / ml diaminobensidin hydroklorid FÖRSIKTIGHET lösning genom att placera en 10 mg diaminobensidin hydroklorid tablett i en 2 ml mikrocentrifugrör. Lägg 980 il destillerat H2O och 20 pl koncentrerad saltsyra (11,65 M) och blanda tills lösningen är ljusbrun och genomskinlig. Späd denna lösning i 0,1 M fosfat eller 0,1 M natrium-kakodylat-buffert till en slutlig koncentration av 1 mg / ml medan pH reglerades med natriumhydroxid till ett pH mellan 7,0 och 7,6 (pH 7,4 rekommenderas).
VARNING: Diaminobenzidine är giftigt! Använd handskar och avyttra giftiga ämnen på lämpligt sätt. - För fotooxidation, rEPlacera buffert med 2 ml av en 1 mg / ml diaminobensidin-hydroklorid-lösning i 0,1 M natrium-kakodylatbuffert eller fosfatbuffert. Skydda denna lösning från ljus och kyla ner på is till 4 ° C för att öka lösligheten av syre. Mätta lösningen med syre genom att bubbla syre genom lösningen (använd en slang som är införd i lösningen och ansluten till en syreflaska). Kontrollera pH igen och justera vid behov.
OBS: Det är avgörande för fotooxidation reaktion som pH-värdet ligger mellan pH 7,0 och pH 7,6. - Montera skålen med de fixerade cellerna försiktigt på ett inverterat fluorescensmikroskop utrustat med ett 40x oljeimmersionsobjektiv och flytta den till det intressanta området. Excite den miniSOG taggen med blått ljus med hjälp av filter kuber för GFP eller den gemensamma fiskeripolitiken. MiniSOG har en maximal excitation vid 448 nm med en skuldra vid 473 nm 10.
- Fortsätt med belysningen även efter det gröna miniSOG fluorescens has helt försvunnit och tills den bruna fotooxidation produkt av polymeriserade diaminobensidin framträder i den överförda ljuskanalen. När oxidationsprodukten syns i de flesta av cellerna, stänga av fluorescensbelysning för att stoppa fotooxidation.
OBS: Foto-oxidering kan ta upp till flera minuter beroende på objektivlinsen, filtertransmissionsvåglängder och effektivitet, och belysningskällan. - Postfix cellerna med 1 ml av 2% glutaraldehyd i 0,1 M natriumkakodylat pH 7,4 buffert eller fosfatbuffert pH 7,4 under 30 min.
- Fäst membranen hos cellerna med 0,1% -0,5% osmiumtetroxid för 20 min i 0,1 M natrium-kakodylatbuffert pH 7,4 eller i 0,1 M fosfatbuffert pH 7,4.
OBS: Det rekommenderas att använda lägsta möjliga koncentration osmiumtetroxid krävs för att stabilisera membranen. Eftersom de polymeriserade DAB fällningarna har en hög täthet av kväve, som kan detekteras direkt med ESI, en starkosmium färgningen är inte nödvändigt att identifiera miniSOG-märkta proteinet och kan vara skadliga för ESI. Osmiumtetroxid är mycket giftigt! Arbete i ett dragskåp och avyttra giftigt avfall på rätt sätt. - Torka, cellerna genom en etanolserie med användning 30%, 50%, 70%, 90%, 98% 100% etanol steg (varje 5 min). Därefter inkubera cellerna i en 1: 1 blandning av 100% etanol och akrylharts (LR vit) och placera skålen på en skakare under 4 h för att underlätta infiltrering in i cellerna före inkubering av cellerna under ytterligare minst 4 h i 100 % akrylharts (LR vit).
- För att polymerisera hartset, avskurna locket av en märkt 2 ml mikrocentrifugrör med ett rakblad och belägga krans med akrylharts accelerator. Kontrollera att acceleratorn omfattar endast fälgen och inte flödar in i röret. Därefter försiktigt fylla röret ungefär två tredjedelar med LR Vit harts med hjälp av en pasteurpipett. Var noga med att hartset inte komma i kontakt vetth gaspedalen på fälgen!
- Avlägsna hartset som infiltrerade cellerna i skålen och placera skålen upp och ned på den upprättstående mikrocentrifugrör så att bredden av röret fyller nästan helt upp glaset täckt observationsfönster av skålen.
- Vänta ett till två min för gaspedalen för att täta röret och täckglas och sedan invertera röret så att hartset i röret omfattar nu cellerna.
- Placera skålen med röret in i en ugn vid 60 ° C och härda den för 12 timmar.
- När blocket härdas tas skålen med den bifogade hartsfyllda mikrocentrifugrör från ugnen och separera mikrocentrifugrör från skålen. Underlätta separation genom frys-upptiningscykler i flytande kväve och varmvatten.
- Kassera glaset nedre skålen och försiktigt skära upp mikrocentrifugrör med ett rakblad för att avlägsna blocket.
- Märk block med en märkpenna.
- Använd ett rakblad för att trim blocket så att ingenting annat än 1 mm 2 region som innehåller det område som tidigare märkt med diamant eller volfram penna (eller innehåller området med cellerna av intresse) förblir.
- Montera blocket i en ultramikrotom, trimma blocket med en trimning kniv och skär ultratunna sektioner av cirka 50 nm med en diamantkniv.
- Plocka upp avsnitten om hög transmission 300 mesh nät. Dessa galler har mycket små gallerstänger och således omfatta färre celler i området av intresse.
- Coat avsnitten om gallren med omkring 0,2-0,4 nm av kol med hjälp av en kol beläggnings för att stabilisera dem under elektronstrålen av TEM.
5. elektronmikroskopi
- Fyll på galler i en TEM som är utrustad med ett energifilter. Efter avstämning av mikroskop och energi filtret enligt tillverkarens anvisningar, kontrollera cellerna på avsnitt i låg förstoring (normal överföring) och jämfördem att fluorescensdata när så är lämpligt (som erhållits i steg 4,4).
- När en kärna med intressanta funktioner (DNA-skada spår eller DNA-reparations foci) hittas byta till energifiltreringsläge och spela en tjocklek karta.
OBS: Denna procedur innefattar inspelning av en noll förlust och en ofiltrerad bild. Tjocklekar upp till 0,3 innebära fri väg (30% av elektronerna i den infallande strålen blir sprids av provet) är tunn nog att generera goda elementära kartor. - Spela förhållande kartor över fosfor och kväve med hjälp av programvara som styr energi filtret i mikroskop som används. Anteckna de fosfor map inlägget kant bilder vid 175 eV energiförlust med en slitsbredd av 20 eV och pre-kantbilder vid 120 eV energiförlust, också med en slitsbredd av 20 eV. För kväve kartor, spela efter kant bilder på 447 eV med en spaltbredd av 35 eV och pre-kant bilder på 358 eV, också med en slitsbredd på 35 eV.
OBS: Eftersom innehållet i de avbildade elementen (fosfOrus och kväve) är relativt låg (ca. 1%), välj "Ratio Image" (kvalitativ elementärt karta) över "3 fönstermetoden" (kvantifiera elementärt karta) för att generera bilder med bättre signalbrusförhållande.
6. Bildbehandling
- Öppna elementära förhållandet kartor i en programvara för bild som kan hantera filformatet för de förvärvade bilderna (t.ex. Digital Mikrograf). Kopiera kväve kartan i den röda kanalen och fosfor karta på den gröna kanalen av en RGB-bild, sedan överlagra och anpassa kartor.
- Exportera den sammansatta bilden som en taggad bild filformat (TIFF) fil. Öppna bilden i en programvara för bild som kan använda lager (t.ex. Photoshop).
- Justera det dynamiska omfånget för varje kanal genom att skalas de lägsta och högsta värdena i bilden till en 8-bitars datauppsättning (0-255).
- Subtrahera fosforhalten från kväve kartan (med hjälp av"Lager" fönster) för att generera en kvalitativ karta som visar fördelningen av protein.
- Konvertera kartor över nukleinsyra (fosfor) och protein (kväve) skapade i föregående steg i "indexerad färg" och skapa en gul uppslagstabell i CMYK-färgrymden för kartan visar nuk distributions syra och en cyan uppslagstabell att visa icke-nukleoprotein kartan. Färgerna är valda för att ge maximal kontrast mellan de två elementära kartor.
- Skapa en ny bild och importera kartor som visar fördelningen av fosfor och protein som olika skikt. Använd "skärm" öppenhet läge för att se båda skikten ovanpå varandra.
- Öppna nollförlust bild som förvärvats i steg 5.2. Den här bilden föreställer en bild av det inspelade området som ser ut som en vanlig TEM bild, men bara innehåller elektroner som har passerat genom provet utan att kollidera med provet. Exportdenna bild som en TIFF-bild.
- Öppna den exporterade noll förlust bilden i ett foto redaktör och kopiera den till det översta skiktet av bilden visar elementar kartan. Rikta in bilden med hjälp av "screen" öppenhet läge.
- Eventuellt tröskelvärdet noll-förlust bilden för att segmentera signal som härstammar från miniSOG. Lägg den resulterande bilden som ett separat skikt, såsom beskrivits ovan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ESI
Jämföra ESI bilder av kärnan (Figur 1) med de konventionella TEM-bilder (t.ex. Figur 7-1) visar en dramatisk ökning av anatomiska strukturer som lätt kan särskiljas. Kromatinet åsar visas i gult och det är ganska lätt att identifiera chromocenters i musceller. Nukleoler kan lätt skiljas från kromatin genom sin runda struktur och olika färg, eftersom de förmonterade ribosomer innehåller redan höga halter av protein, som är rikt på kväve, förutom RNA, som är rik på fosfor. Den perifera kromatin är bosatt som ett tunt lager på gränsen av kärnan och kärn porer kan ses som kväverika strukturer som avbryter perifera kromatin. Ofta lamina kan ses som en mycket tunn blå skiktet utanför den perifera kromatin. I cytoplasman, många små partiklar rika på fosfor kanbli sedd. Dessa kan identifieras som ribosomer baserat på deras storlek, överflöd och plats utanför kärnan. Den interchromatin utrymme kan ses som den proteinrika område beläget mellan kromatin. Detta innehåller nukleära organ och områden rika på små gula signaler, såsom ribonukleoprotein partiklar och kluster av ribonukleoprotein granulat (Figur 2). Den senare kallas interchromatin granulat kluster och karakteristiskt anrikas i proteiner som krävs för pre-mRNA-splitsning. Figur 1B, C och D illustrerar uppkomsten av andra kända strukturer såsom mitotiska kromosomer, centrosomes, mitokondrier och centromerer. I figur 2, är de steg som används för att generera färgade komposit bilder från rå elementära förhållandet kartor sammanfattas. Sammanslagning av fosfor kartan (grön) och kväve kartan (röd) i RGB-färgrymd (övre raden) gör det möjligt för en bättre bedömning av storleken av dessa element i provet. However, subtrahera fosfor signalen för att utarma bidraget från nukleinsyra-innehållande strukturer från kväve kartan för att i utbyte ge proteinkartan (cyan) och sammanfoga den med fosforkartan (gul) i CYMK färgrymden ger en mer distinkt visuell representation av nukleoprotein och icke-nukleoprotein (nedre raden). Detta gör att data lättare tolkas av personer som är obekanta med tekniken.
Laser microirradiated celler som uttrycker MDC1, 53BP1 och RAD52
På grund av den användardefinierade storleken, formen och placeringen av de laserskada spår, regionen DAB nedfall i laser microirradiated cellerna är mycket lätt att hitta i TEM vid användning av miniSOG systemet. Bilder tagna i låg förstoring sändningsläge (dvs konventionella bright TEM) visar de karakteristiska skador spår och kan jämföras med data som spelades in med ett fluorescensmikroskop före inbäddning.Detta är särskilt användbart om korrelat mikroskopi är avsedd, eftersom det gör det lätt att identifiera och flytt av enskilda kärnor. (Figur 2-4).
Det första exemplet (figur 3) visar en U2OS cellinje som stabilt uttrycker MDC1 miniSOG-mCherry. I en laser microirradiation experiment rekryteringen av MDC1 innehållande miniSOG och mChrerry taggar var mycket lik GFP-märkta versioner av detta protein (data ej visade). Fastställande av cellerna 1 timme efter DNA-skada induktion och förbereda provet för TEM ades MDC1 skada spåren lätt identifieras i ultratunna sektioner i normal TEM läge som mörka ränder över kärnorna, vilket motsvarade mycket väl till fluorescensdata ( Bild 3-5). När man tittar på fördelningen av proteinet, kunde en tydlig ökning av kväve-signal vid de laser skadade platserna. Det måste påpekas att detta i första hand orsakas av den polymeriserade diami nobenzidine, som är rikt på kväve och förstärker signalen för miniSOG taggade reparationsprotein, snarare än enbart genom ackumulering av reparationsproteiner i skada spåret. Vid jämförelse av kromatinstrukturen i resten av kärnan, med strukturen i skadan spår visar en tydlig skillnad. Den skadade kromatin (som visas inom de streckade linjerna i fig 3) visas mer dekondenserad i motsats till den icke-bestrålade kromatin, vilket sker i tjocka åsar i nukleoplasman. Inom skade spår, kunde också observeras nukleära organ (200-300 nm) (markerade med pilar i figur 3 II2, IIb, lic och IIIa) som är rika på MDC1-miniSOG protein men fri från nukleinsyra. Det skulle vara mycket svårt att definiera dessa kärn organ som kromatin fria strukturer utan denna teknik. Det föreslår också en ytterligare nivå av komplexitet till skada webbplatser som inte förutsagts av den kända biokemi MDC1.
ntent "> Om man tittar på skade spåren av 53BP1 (Figur 4) som skapades med samma villkor som det tidigare beskrivna skadan MDC1-transfekterade celler, kan observeras mycket likartade resultat. Signalen som produceras av fotooxidering av den miniSOG var trångt och fyllde upp utrymmet mellan vecken av kromatin. starkt färgade kärnorgan iakttogs också (markerat med en pil i fig 4 D, E, F).Från experiment med RAD52-GFP-konstrukt, är det känt att RAD52 kommer att bilda små ljusa microcompartements 24 längs en laser-inducerad skada banan. På grund av upplösningen gränsen för konventionella ljusmikroskop, har det varit oklart hur stora dessa strukturer verkligen är och hur de förhåller sig till den skadade DNA. Om man tittar på TEM bilden av laserbestrålade U2OS kärnor konstitutivt uttrycker RAD52-miniSOG-mCherry, var storleken på dessa organ uppmättes till i genomsnitt (150-250 nm). det ärännu mer överraskande att titta på dessa härdar med ESI. I motsats till de tidigare exemplen, de RAD52-miniSOG-mCherry foci verkar organiseras helt annorlunda längs skador spåret och verkar vara kompakta kärnkroppsliknande strukturer som är sammansatta av protein och inte har några detekterbara nukleinsyror inom deras inre. Baserat på att titta på nukleinsyra-syra / proteinförhållande på de skadade områdena som erhållits med vår kombinerade miniSOG och ESI strategi föreslår vi att DNA-reparation kan ske på ytan av fokus snarare än i det inre.
Den undre bilden i figur 5 visar resultat som liknar fig 3-III. Kromatinet i det skadade området verkar vara mer dekondenserad jämfört med kromatin i de icke-bestrålade områden (se område beskrivs av röda streck).
Gamma bestrålade celler
Medan laser mikro-strålning är ett praktiskt verktyg för att quickly testa proteiner som innehåller en fluorescerande tagg för rekrytering till områden av DNA-skador, skapar det stora mängder komplexa skador (dubbelsträngbrott, enkelsträngbrott, bas skador, och cyclopyrimidine dimerer) 25. För att studera de avdelningar som mer direkt bildas kring DNA-dubbelsträngbrott har vi granskat DRFs som bildas kring enskilda DSB genom att exponera celler för gammastrålning.
U2OS celler som stabilt uttrycker 53BP1-miniSOG-mCherry exponerades för 2 Gy gammastrålning och fast halv timme efter bestrålningen. Det karakteristiska mönstret för stora foci fördelad genom nukleoplasman kunde observeras (Figur 6Ia). Efter fotooxidation av diaminobensidin, kunde mörka fläckar framväxande vid de platser där de fluorescerande mCherry signaler var belägna i fluorescensmikrofotografier ses i elektronmikrofotografier (fig 6Ib och c). Dessa fläckar kunde korreleras till TEM-bildersom togs vid låg förstoring (Figur 6Id och e). ESI bilder av dessa fokus, som föreföll vara omkring 1-1,5 pm i diameter, visade en intressant struktur. Tunna trådar av kromatinet tycktes vara varvas med 53BP1 protein av ungefär två gånger tjockleken.
I andra experiment exponerades cellerna till en högre mängd strålning och fixerades vid senare tidpunkter (efter 3 h och 6 h, respektive) för att generera större härdar och underlätta lokalisering av dessa i ultratunna sektioner (Figur 7). Eftersom vi har möjlighet att separat kartlägga nukleoprotein och protein, ESI visar att strukturen på de härdar verkar omorganisera över tiden. Den relativa mängden av 53BP1 protein i fokus tycks öka medan kromatinet tar en mer perifer position.
Eftersom 53BP1 fokus visas även i icke-bestrålade celler som "kryptisk fokus" i G1-celler vid ställen för under replikerad DNA 26,27, har dessa fokus också avbildas. Dessa kryptiska härdar tycks hysa höga mängder protein relativt strålnings inducerade foki och visar en intressant regelbunden struktur av kromatin.
Sålunda visualisera DNA-reparations foci beståndsdelar med användning av miniSOG metod hjälper till att identifiera regioner av DNA-skador och för att kartlägga fördelningen av det märkta reparationsproteinet relativt kromatin.
Figur 1. Översikt av strukturer som kan observeras i en ESI bild Klicka här för att se en större version av denna siffra.
(A) ESI bild av en mus embryonala fibroblaster. Kromatin åsar (gul) är omgivna av nukleoplasman (cyan) fylla upp interchromatin spess. Kärnan är omgiven av perifera heterokromatin och chromocenters (nere till vänster) som avbryts av nukleära pore komplex (cyan). Nukleolerna kan tydligt åtskilda av sin färg. Detta beror på det faktum att mängden protein i förhållande till nukleinsyra är högre i nukleolär struktur än den är i kromatin. Utanför kärnan kan mitokondrier och ribosomer (rika på nukleinsyra) lätt identifieras.
(B) Bild av en kärna och centrosomes (se pilar), vilket kan ses som ihåliga proteinrika partiklar i övre vänstra hörnet av bilden.
(C) Tvärsnitt genom en metafas plattan. De starkt kondenserade metafaskromosomer har anpassat till en skiva som sträcker sig från det övre vänstra hörnet till det nedre vänstra hörnet. Höga koncentrationer av kväve är synliga på ytan av vissa kromosomer. Dessa områden är kinetokorer (se pilar).
(Övre raden) De första två bilderna i raden visar förhållandet kartor över fosfor och kväve. Den sista bilden i den övre raden visar dessa elementära kartor lagrade i RGB-färgrymden. Gula strukturer representerar nukleoproteiner, vilket återspeglar förekomsten av både fosfor och kväve. (Nedre raden) Den första bilden visar fosforkartan, som i första hand visar fördelningen av nukleinsyran i provet. Den mellersta bilden visar fördelningen av nukleinsyra utarmade / negativ stru lder. Det beräknades genom subtraktion av fosforkartan från kväve kartan. Den nedre högra bilden visar en sammanfogning av nukleinsyran kartan och proteinet kartan i den subtraktiva färgrymden. Denna färgkomposit bör användas för att hjälpa till att identifiera enskilda strukturer och klassificera dem som nukleoprotein eller inte nukleoproteinet. Den kvantitativa information om fosfor och kväve överflöd bör samlas visuellt från nätet fosfor och nettokväve gråskala kartor eller kompositer som genereras med hjälp av additiva färger, såsom i den översta raden. 
Figur 2. Skapande av en flerfärgade ESI bild 
Figur 3. Lasermikro bestrålning av U2OS celler som stabilt uttrycker MDC1-miniSOG-mCherry. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
(II) Området, markeras med en grön fyrkant i Ic var förstoras och visas i normal sändningsmod (Ila) och ESI (IIb). Lic visar en överlagring av ESI bilden med signalen av skadan spåret. Skadan spårsignalen erhölls genom tröskling den övre bilden.
(III) Exempel på strukturen hos lasermikro-irradiated kromatin och kromatin utanför laser skadade området.
Figur 4. Laser mikro bestrålning av celler som stabilt uttrycker 53BP1-miniSOG-mCherry. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Vänstra kolumnen: (A) Fluorescens, (B) Konventionella TEM och (C) ESI bild av samma lasermikrobestrålade kärna.
Höger kolumn: (D) Konventionell TEM, (E) ESI och (F) överlagring av ESI bilden med miniSOG signal som segmenteras efter tröskel av (D) (se steg 6.10)
Figur 5. U2OS cellinje som stabilt uttrycker RAD52-miniSOG-mCherry och skadas av lasermikro bestrålning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
(A) överlagring av en fluorescens bild med en lågförstorande TEM bild som visar en laser microirradiated U2OS kärna med en skada spår längst ned till vänster.
(B) Representativa konfokal fluorescensmikroskopi bild av en lasermikro bestrålas Hoechst-stained kärnan (blå) som uttrycker RAD52-miniSOG-mCherry som visar den karakteristiska mönster av små foci utmed skador spår (röd signal).
(C) Konventionell TEM, (D) ESI,
(G) ESI bild av en annan U2OS kärna som stabilt uttrycker RAD52-miniSOG-mCherry visar en laser-inducerad skada spår i samband med hela kärnan.
Figur 6. U2OS celler som stabilt uttrycker 53BP1-miniSOG-mCherry bestrålas med 2 Gy och fixerades efter 30 min. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
(I) a) Fluorescens bild visar gammastrålning-inducerad 53BP1 fokus. b) Fallande ljus bild efter fotopolymerisation. c) Overlay av fluorescensen med den sända ljusbilden. d) låg förstoring TEM bild (svart band är en TEM galler bar). e) Över av fluorescerande bild med låg förstoring TEM bild.
(II) Skada fokus märkt med en asterisk i den överförda ljusbild registreras i normal TEM och ESI-läge. a) Noll-förlust, b) ESI, c) Fosfor, d) Protein e) Overlay ESI och segmenterade signalen från noll-förlust bilden.
(III) Skada fokus märkt med ett kryss i fluorescens bilder som lagrats i normal TEM och ESI-läge. a) Noll-förlust, b) ESI, c) Fosfor, d) Protein e) Overlay ESI och segmenterade signalen från noll-förlust bilden.
Figur 7. Förändringar i fokus struktur mellan fokus efter olika tider på bestrålning. < / strong> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
U2OS 53BP1 miniSOG mCherry celler exponerade för 6 Gy gammastrålning fast efter 3 timmar (1A-E, FJ) och 6h (2A-E, FJ) respektive. 3 visar en obestrålat U2OS 53BP1 miniSOG mCherry kärna visar en kryptisk fokus (AE). ESI bilder presenteras i ordning-ESI (nukleinsyra och protein), nukleinsyra (ensam), protein (ensam), ESI (nukleinsyra och protein) + segmenterad miniSOG signalen.
Figur 8. DNA-reparations fokus är fortfarande synliga på konventionellt överföringsläge när efterfixering med osmiumtetroxid utelämnas. arge.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Ultratunn sektion (50 nm) för en U2OS kärna som visar två 53BP1 foci från ett prov som inte behandlades med osmiumtetroxid. (A) Vid konventionell TEM-moden, är det möjligt att se platser färgade med DAB polymeren även utan ökar kontrasten med den heavy metal fläck. (B) Kontrasten i fokus kan förbättras ytterligare genom att ta noll förlust bilder (filtrera bort alla elektroner som härstammar från ett flertal spridningsevenemang).
Figur 9. Fastställande av optimala energifönsterinställningar för kartläggning av fosfor
(A) Elementarförhållande karta noterats för fosfor med efterkant vid 155 eV och pre-kant vid 120 eV.
innehåll "> (B) Elementarförhållande karta noterats för fosfor med efterkant vid 175 eV och pre-kant vid 120 eV.(C) Beräkning av fosfor kartor från en konstant för-kant fönstret på 120 eV energiförlust och ett fönster med variabel efter kant som sträcker sig från 140-200eV energiförlust för att bestämma den kombination som är bäst i kontrast. Intensiteten skillnaden mellan de ljusaste och dimmestpixel i en linje-scan som spänner över samma fosfor rika och fosfor fattig region visar högsta kontrastvärden (dynamiskt omfång) när en post-kant bild av 175 eV energiförlust valdes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ESI kan fungera som ett utmärkt verktyg för att undersöka olika tillstånd av kromatin och ribonukleoproteiner i kärnan eftersom den kan specifikt kartlägga områden som är rika på fosfor. Det förstärker djupt hur mycket detaljer som kan erhållas genom ett elektronmikroskop och är inte beroende av ospecifika kontrasterande metoder. En nackdel med ESI är att den kräver tunnare sektioner än konventionell TEM vid samma accelererande spänning. Detta kan övervinnas genom att arbeta med seriesnitt eller använda tomografiska metoder 28.
Även om man kan få en hel del information genom att titta på fördelningen av fosfor och kväve, är det av intresse att också kunna kartlägga fördelningen av vissa proteiner. Med den metod som presenteras i detta dokument, visades det att ESI kan kombineras med metoder som är baserade på platsspecifika polymerisation av diaminobensidin. Även om denna metod inte lägga till en full ny färg till ESI, är det tydligt användbart att kartlägga fördelningen av ett protein. Detta gäller i synnerhet proteiner som interagerar med kromatin. Om en studie måste visualisera mer än ett protein befolkningen, kan de märkningsmetoder som använder immunogold fortfarande användas när de tillämpas som pre-inbäddning färgning, före fotooxidering 9. Jämfört med stabila cellinjer, transienta transfektioner har nackdelen att expressionsnivåer kan variera avsevärt mellan celler och därmed göra det svårt att hitta flera celler som uttrycker liknande mängder av det märkta proteinet. Därför är skapandet av stabila cellinjer rekommenderas. Emellertid är det möjligt att bedöma den relativa mängden av proteinuttryck med användning av fluorescensavbildning och väljer celler med mellanliggande uttryck följande övergående transfektion.
Även om miniSOG fusions taggen fluorescerande sig, är dess kvantutbyte betydligt sämre än GFP (0,37 jämfört med 0,6) 10. För purpose av korrelat mikroskopi, lägga till ytterligare fluorescerande protein tag som mCherry tillåter avbildning i levande celler utan produktion av singlettsyre som uppstår med miniSOG excitation. Expressionsnivån av miniSOG-märkta proteiner, kan mängden syre i DAB-innehållande buffert, och pH-värdet också påverka hastigheten på fotooxidation. Ibland kan det vara ganska problematiskt att uppnå homogen fotooxidation i området av intresse på grund av ljuset beroende av foto oxidationsreaktionen. Långvarig fotooxidation kan leda till icke-specifik färgning och avsättning av alltför mycket heavy metal i provet, vilket kan försvåra upptäckten av elementspecifika signaler från ESI. Den foto oxidationsprocessen är ganska tidskrävande, så att vanligtvis endast en mycket liten region innehållande några celler på täckglas normalt färgas.
Vi har visat att kombinationen av miniSOG taggade proteiner med ESI använder en monolager av en vidhäftande humannen cancer cellinje. I princip kan förfarandet även tillämpas på alla andra prov (jäst, bakterier, vävnad, embryo) så länge som det är möjligt att uttrycka den miniSOG-märkt protein på en rimlig nivå och så länge genomskinlighet och diffusionen av syre och DAB är tillräckligt hög för att möjliggöra korrekt fotooxidering och därmed homogen färgning. För suspensionsceller, skulle det vara fördelaktigt att fastställa läget av celler på ett täckglas med användning av ett lim, såsom poly-L-lysin. För tjockare prover, kommer målen med lägre numerisk öppning uppnå en mer homogen belysning men tar längre tid att foto oxidera.
Vi har presenterat användningen av miniSOG-taggade fusionsproteiner så nära det ursprungliga protokollet publicerad av Shu et al 10 som möjligt -. Inklusive användning av osmiumtetroxid. Där kunde observeras att bortsett från företrädesvis avsättning på DAB-polymerer och membran, visar osmiumtetroxid någon reaktivitet ochavsättning på största delen av det biologiska materialet i provet (10 Figur 3). Osmiumtetroxid har en elementär kant vid 45 eV. Denna signal och dess plasmoner kan överlagras på elektronenergiförlustspektrum som tjockleken på prov ökar och enstaka elektroner genomgår flera energiförlusthändelser under passagen genom provet. Detta kan begränsa kvaliteten på de elementära kartor fosfor om höga OSO4 koncentrationer användes i provframställning. De halter som vi har använt här, som är betydligt lägre än vad som tidigare använts 10, tillät generering av god kvalitet fosfor kartor. I ett experiment med användning miniSOG taggade proteiner som kräver högre OSO4 koncentrationer, kommer den bästa koncentrationen som fortfarande tillåter god fosfor karta skapande måste bestämmas empiriskt.
Vi har funnit att DAB polymer som bildas på DNA-reparations foci är sufficiently tät för att ses i konventionell TEM-moden (eller i noll-förlustläge med ännu bättre kontrast) även när efter fixering med osmiumtetroxid utelämnas (se figur 8). Segmenteringen av de signaler som registrerats på detta sätt var lika robust som att använda de prover som behandlades med osmium. Beroende på det nukleära proteinet som måste visualiseras, storleken på de strukturer den bildar och nödvändigheten att visualisera membransystem, användning av osmiumtetroxid kanske inte vara nödvändigt och dess utelämnande kommer att avlägsna potentialen för maskering av elementär signatur av fosfor.
Jämfört med andra publikationer med hjälp av ESI 18,29,30 har vi använt olika inställningar för före och efter kant bilder i syfte att skapa elementära förhållandet kartor med minsta möjliga buller. Vi har empiriskt fastställt inställningarna som presenteras i manuskriptet (se figur 9). De valda inställningarna runt kanterna bör leda till rätta elementala kartor såvida uppsamlings fönstren överlappar med andra element som finns i provet. I vårt fall kan svavel vara ett sådant element. Eftersom koncentrationen av svavel (som förekommer i aminosyrorna metionin och cystein) är mycket låg och bidrar till den beräknade kartan endast i en försumbar mängd, tror vi bättre S / N-förhållande som vi fått genom att använda de inställningar som används här uppväger nackdelarna som kan uppstå på grund av spår av svavel i provet.
Vi avslöjade ultra av DRFs på nanometer upplösningen med DNA-reparationsproteiner MDC1, 53BP1 och RAD52 kombination med ESI och TEM tekniker. Organisationen av kromatin och individuell DSB-reparation protein lokalisering uppdelades med användning av detta tillvägagångssätt. Deras lokalisering i områden rika på DNA-skador efter laser mikro-bestrålning DNA och tendensen av reparationsproteiner för att fylla utrymmet mellan kromatin åsarna visades. I fallet med RAD52, som plays en roll i homolog rekombination kunde observeras bildningen av kärnkroppsliknande sfäriska strukturer längs laser skadade spåret och detta var i kontrast till de två andra testade proteiner. När skadan appliceras med gammastrålning, 53BP1 bildade fokus kring den skadade kromatin. Den relativa sammansättningen och läget av kromatin och protein i foci verkar förändras över tiden. Förhållandet mellan dessa proteiner och den skadade kromatin samt förändringar i organisationen av kromatin och sammansättningen av kärn organ kan alla lätt erhållas med hjälp av ESI-tekniken, medan konventionella brightmikroskopering med användande av uran och bly som kontrasterande medel kan inte bedöma dessa egenskaper direkt. Således visar denna teknik hög potential för studier av struktur och funktionssamband, i synnerhet för processer som verkar på DNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Gridded 35 mm glass bottom dishes | MatTek | P35G-2-14-CGRD | not made for immersion objectives |
| LR White: acryl resin | emsdiasum | 14381 | |
| LR White accelerator | emsdiasum | 14385 | |
| 3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets | Sigma | D5905 | |
| Slim Bar Grids 300 Mesh | SPI | 1161123 | |
| Tungsten-Point Lab Pen | emsdiasum | 41148 | |
| Osmium Tetroxide | emsdiasum | 19100 | |
| Carbon Coater 208 carbon | Cressington | ||
| Ultra microtome Leica EM UC6 | Leica | ||
| Photoshop CS5 | Adobe | might even work with older versions | |
| Digital Micrograph V.2.30 | Gatan | might even work with older versions | |
| Hoechst 33342 | Sigma | H-1399 | |
| Effectene | Quiagen | ||
| MiniSOG-Constructs | Tsien-Lab | tsienlab@yahoo.com | |
| MDC1 miniSOG mCherry | |||
| 53BP1 miniSOG mCherry | |||
| Rad52 miniSOG mCherry | |||
| cesium 137 radiation source "MARK 1" | (J.L. Shepherd & Associated) | ||
| ImageJ/FiJi | open source | http://fiji.sc/Fiji | |
| 2 ml Eppendorf tubes | Fisherbrand | 05-408-146 | |
| Diamond Knife ultra 35° | Diatome | ||
| Trimming Knife ultratrim | Diatome | ||
| Sodium cacodylate trihydrate | emsdiasum | 12300 | Caution Toxic! |
| Glutaraldehyde EM Grade 8% | emsdiasum | 16020 | Caution Toxic! |
| Sodium phosphate dibasic | emsdiasum | 21180 | |
| Sodium phosphate monobasic | emsdiasum | 21190 | |
| Paraformaldehyde | emsdiasum | 19202 | |
| Osmium tetroxide 4% solution | emsdiasum | 19150 | |
| Inverted Fluorescence Micoscope Axiovert 200M | Zeiss | ||
| Hydrochloric Acid | Fisherbrand | A142-212 | |
| Sodium Hydroxide Solution 10M | Fluka | 72068 | |
| Oxygen | Medigas | ||
| 3-Amino-1,2,4-triazole | Sigma | A8056 | |
| Potassium cyanide | Sigma | 207810 | Caution Toxic! |
| Ethanol | emsdiasum | 15058 | Caution Toxic! |
| Razor blade Single Edge Carbon Steel | emsdiasum | 71960 | Caution Sharp! |
| DMEM | Sigma | D 5546 | |
| FBS | Life Technologies | 16000-044 | |
| G418 | Life Technologies | 11811-023 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Transmission Electron Microscope 200 kV | JEOL | 2100 | |
| GIF Tridiem 863 Energy filter | Gatan |
References
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. The Journal of Cell Biology. 190, 165-175 (2010).
- Bazett-Jones, D. P., Hendzel, M. J., Kruhlak, M. J. Stoichiometric analysis of protein- and nucleic acid-based structures in the cell nucleus. Micron (Oxford, England: 1993). 30, 151-157 (1999).
- Michael J Hendzel, F. M. B., Bazett-Jones, D. P. Direct Visualization of a Protein Nuclear Architecture. Molecular biology of the cell. 10, 2051 (1999).
- Ottensmeyer, F. P., Andrew, J. W. High-resolution microanalysis of biological specimens by electron energy loss spectroscopy and by electron spectroscopic imaging. Journal of ultrastructure research. 72, 336-348 (1980).
- Leapman, R. D., Ornberg, R. L. Quantitative electron energy loss spectroscopy in biology. Ultramicroscopy. 24, 251-268 (1988).
- Simon, G. T. Electron spectroscopic imaging. Ultrastructural pathology. 11, 705-710 (1987).
- Egerton, R. Electron Energy-Loss Spectroscopy in the Electron Microscope. , Springer. (2011).
- Aronova, M. A., Kim, Y. C., Zhang, G., Leapman, R. D. Quantification and thickness correction of EFTEM phosphorus maps. Ultramicroscopy. 107, 232-244 (2007).
- Hopkins, C., Gibson, A., Stinchcombe, J., Futter, C. Chimeric molecules employing horseradish peroxidase as reporter enzyme for protein localization in the electron microscope. Methods in enzymology. 327, 35-45 (2000).
- Shu, X., et al. A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms. PLoS biology. 9, e1001041 (2011).
- Gaietta, G., et al. Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking. Science (New York, NY). 296, 503-507 (2002).
- Fernandez-Capetillo, O., Celeste, A., Nussenzweig, A. Focusing on foci: H2AX and the recruitment of DNA-damage response factors. Cell cycle (Georgetown, Tex). 2, 426-427 (2003).
- Haaf, T., Golub, E. I., Reddy, G., Radding, C. M., Ward, D. C. Nuclear foci of mammalian Rad51 recombination protein in somatic cells after DNA damage and its localization in synaptonemal complexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 2298-2302 (1995).
- Maser, R. S., Monsen, K. J., Nelms, B. E., Petrini, J. H. hMre11 and hRad50 nuclear foci are induced during the normal cellular response to DNA double-strand breaks. Molecular and Cellular Biology. 17, 6087-6096 (1997).
- Bekker-Jensen, S., Mailand, N. Assembly and function of DNA double-strand break repair foci in mammalian cells. DNA repair. 9, 1219-1228 (2010).
- Chapman, J. R., Sossick, A. J., Boulton, S. J., Jackson, S. P. BRCA1-associated exclusion of 53BP1 from DNA damage sites underlies temporal control of DNA repair. Journal of cell science. 125, 3529-3534 (2012).
- Dellaire, G., Kepkay, R., Bazett-Jones, D. P. High resolution imaging of changes in the structure and spatial organization of chromatin, gamma-H2A.X and the MRN complex within etoposide-induced DNA repair foci. Cell cycle (Georgetown, Tex). 8, 3750-3769 (2009).
- Kruhlak, M. J., et al. Changes in chromatin structure and mobility in living cells at sites of DNA double-strand breaks. The Journal of Cell Biology. 172, 823-834 (2006).
- Goodson, H. V., Dzurisin, J. S., Wadsworth, P. Generation of stable cell lines expressing GFP-tubulin and photoactivatable-GFP-tubulin and characterization of clones. Cold Spring Harbor protocols. 2010, (2010).
- Zeyda, M., Borth, N., Kunert, R., Katinger, H. Optimization of sorting conditions for the selection of stable, high-producing mammalian cell lines. Biotechnology progress. 15, 953-957 (1999).
- Dellaire, G., Nisman, R., Bazett-Jones, D. P. Correlative light and electron spectroscopic imaging of chromatin in situ. Methods in enzymology. , 375-456 (2004).
- Campbell, S., Ismail, I. H., Young, L. C., Poirier, G. G., Hendzel, M. J. Polycomb repressive complex 2 contributes to DNA double-strand break repair. Cell cycle. 12, 2675-2683 (2013).
- Mortusewicz, O., et al. Recruitment of RNA polymerase II cofactor PC4 to DNA damage sites. J Cell Biol. 183, 769-776 (2008).
- Bekker-Jensen, S., et al. Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks. The Journal of Cell Biology. 173, 195-206 (2006).
- Ferrando-May, E., et al. Highlighting the DNA damage response with ultrashort laser pulses in the near infrared and kinetic modeling. Frontiers in genetics. 4, 135 (2013).
- Lukas, C., et al. 53BP1 nuclear bodies form around DNA lesions generated by mitotic transmission of chromosomes under replication stress. Nature. 13, 243-253 (2011).
- Harrigan, J. A., et al. Replication stress induces 53BP1-containing OPT domains in G1 cells. The Journal of Cell Biology. 193, 97-108 (2011).
- Aronova, M. A., et al. Reprint of 'Three-dimensional elemental mapping of phosphorus by quantitative electron spectroscopic tomography (QuEST). J. Struct. Biol. 161, 322-335 (2007).
- Fussner, E., et al. Constitutive heterochromatin reorganization during somatic cell reprogramming. The EMBO journal. 30, 1778-1789 (2011).
- Kepkay, R., Attwood, K. M., Ziv, Y., Shiloh, Y., Dellaire, G. KAP1 depletion increases PML nuclear body number in concert with ultrastructural changes in chromatin. Cell cycle. 10, Georgetown, Tex. 308-322 (2011).
