Kupffer Cell Isolation for Nanopartikel Toksicitet Testing
Summary
Liver macrophages, named Kupffer cells, are responsible for the capture of circulating nanoparticles. We describe here a method, of high cell purity and yield, for Kupffer cell isolation. The modified LDH assay is used here to measure the toxicity induced by carbon nanotubes in Kupffer cells.
Abstract
Det store flertal af in vitro nanotoxicological studier har brugt udødeliggjort cellelinjer for deres funktionalitet. Imidlertid har resultaterne fra test nanopartikel toksicitet i udødeliggjort cellelinjer eller primære celler vist uoverensstemmelser, hvilket understreger behovet for at udvide anvendelsen af primære celler til in vitro-analyser. Denne protokol beskriver isoleringen af muselever makrofager, navngivne Kupffer-celler, og deres anvendelse til at studere nanopartikeltoksicitet. Kupffer-celler er de mest rigelige makrofag befolkning i kroppen og udgør en del af det retikuloendoteliale system (RES), der er ansvarlig for opsamling af cirkulerende nanopartikler. Kupffer cellerne isoleringsmetode rapporteret her, er baseret på en 2-trins perfusion metode efterfulgt af oprensning på densitetsgradient. Metoden, baseret på collagenasefordøjelse og densitet centrifugering, er tilpasset fra den oprindelige protokol udviklet af Smedsrød et al. designet til rottelever celle isolation og giver højt udbytte (op til 14 x 10 6 celler per mus) og høj renhed (> 95%) af Kupffer-celler. Denne isolation metode kræver ikke sofistikeret eller dyrt udstyr, og derfor repræsenterer en ideel kompromis mellem kompleksitet og celle udbytte. Brugen af tungere mus (35-45 g) forbedrer udbyttet af isolations- fremgangsmåden, men letter også bemærkelsesværdigt fremgangsmåden i portale vene kanyle. Toksiciteten af funktionaliserede kulstof-nanorør f -CNTs blev målt i denne model med den modificerede LDH-assay. Denne metode vurderer cellelevedygtighed ved måling af manglende strukturelle integritet af Kupffer cellemembran efter inkubering med f -CNTs. Toksicitet induceret af f -CNTs kan måles konsekvent anvendelse af dette assay, hvilket understreger, at isolerede Kupffer-celler er nyttige til test nanopartikeltoksicitet. Den overordnede forståelse af nanotoksikologi kunne drage fordel af sådanne modeller, hvilket gør udvælgelsen nanopartikel til klinisk oversættelse flere effektikelig.
Introduction
Feltet af nanotoksikologi forskning har til formål at karakterisere den biologiske effekt af nanopartikler. Toksikologiske undersøgelser er baseret på in vivo undersøgelser er fortsat de mest nøjagtige metoder. Imidlertid er deres anvendelse begrænset af deres omkostninger, arbejdskraft og tid krav 1. Som alternativer, in vitro assays er blevet anvendt på grund af deres enkelhed og muligheden for at udvikle high-throughput in vitro test platforme 2 – så at udvide antallet af testede betingelser. De fleste nanotoxicological undersøgelser udføres under anvendelse af in vitro-assays med immortaliserede cellelinier. Men der er bekymringer vedrørende ekstrapolation af disse eksperimentelle resultater til in vivo toksikologiske virkninger 3. Faktisk kan egenskaberne af immortaliserede cellelinjer være signifikant forskellig fra væv de blev afledt, f.eks genetisk transformation 4, forringelse af vigtige morfologiske træk5, tab af cellulære polaritet 6 og funktionelle ændringer såsom regulering af inflammatoriske mediatorer 7.
Kupffer-celler er de mest rigelige makrofag befolkning i kroppen og er direkte i kontakt med blod ved foring væggen af lever sinuskurver. Som en del af retikuloendoteliale system (RES), disse makrofager er ansvarlige for opsamling af cirkulerende nanopartikler, og derfor udgør en særdeles velegnet model til at studere nanopartikel toksicitet. In vivo 8 og in vitro studier af 9 inflammatoriske reaktioner associeret med Kupffer celler eksponeret for nanopartikler er blevet offentliggjort andetsteds. Kupffer-celler er også blevet involveret i patogenesen af leversygdomme såsom alkoholisk leversygdom 10, leverfibrose 11 eller viral hepatitis 12. Det blev rapporteret, at isolerede Kupffer celler giver nyttig indsigt til at beskrive cellulære mekanismer involved i lever forstyrrelser 13,14.
Er blevet rapporteret adskillige fremgangsmåder til at isolere og oprense Kupffer-celler. Celle isolation kan skyldes mekanisk eller enzymatisk dissociation 15. Collagenasefordøjelse viser den fordel at bevare den funktionelle integritet af Kupffer-celler, mens der fører til høj Kupffer-celle udbytte 16. Mange eksperimentelle metoder, der varierer i kompleksitet og omkostninger, er blevet anvendt til at adskille Kupffer-celler fra andre liver cellepopulationer. For eksempel kan Kupffer-celle renhed opnås ved immunaffinitetskromatografi 17, flow elektroforese 18, selektiv adhæsion 16 eller ved centrifugale teknikker 16, der udvælger celler ifølge deres størrelse og tæthed. En kombination af disse metoder kan vælges til at øge renheden af befolkningen 16. Der er ikke enighed om den ideelle metode til Kupffer celleisolering, da det for det meste afhænger af anvendelsen og tilgængelige equipment. I tilfælde af forsøg nanopartikeltoksicitet, enkelhed og højt udbytte af teknikken i forbindelse med den funktionelle konservering af Kupffer-celler viste sig imidlertid at være mest egnet til denne anvendelse.
Kupffer cellerne isoleringsmetode rapporteret her, er baseret på en 2-trins perfusion metode efterfulgt af oprensning på densitetsgradient. Metoden blev modificeret fra den oprindelige protokol udviklet af Smedsrød et al. 16 konstrueret til rottelever celleisolering. De fleste undersøgelser rapporteret og beskrevet isoleringen af Kupffer-celler fra rottelevere. Heri, beskriver vi en fremgangsmåde til isolering af Kupffer-celler fra muselever, i et højt udbytte og renhed. Anvendelsen af mus reducerer eksperimentet omkostningerne og tillader forarbejdning af flere lever at opnå store mængder af Kupffer-celler til test nanopartikeltoksicitet.
I den følgende protokol blev Kupffer-celler inkuberet med funktionaliserede kulstofnanorør (f </em> -CNTs). De unikke fysisk-kemiske egenskaber CNTs – dvs høje forhold mellem længde diameter og stor overflade, har gjort CNTs interessante kandidater som vektorer for terapi og diagnose formål. Imidlertid er der rejst spørgsmål om toksicitet CNTs 19, samt udvikling af nye in vitro-forsøg har til formål at øge forståelsen af CNT biologisk effekt. Toksicitet i Kupffer-celle er forbundet med en mangel på strukturel integritet af cellemembranen. Dette måles ved tabet af den cytoplasmatiske enzym LDH fra cellen til supernatanten. Princippet i denne metode er derfor at fjerne eventuelle frigivet LDH og måle hvad der er tilbage i cellerne 20. Dette gøres frem for måling af frigivet LDH i supernatanten fordi tilstedeværelsen af CNTs i supernatanten forstyrrer assayet 21.
Vi foreslår brug af denne enkle og omkostningseffektive Kupffer celleisolering method at isolere højt antal funktionelle Kupffer-celler. Dette tillader screening af toksiciteten af en række af nanopartikler, i en relevant primær makrofag model.
Protocol
Representative Results
Discussion
Følgende trin er afgørende for at opnå et højt udbytte og høj levedygtighed Kupffer celler. Bør anvendes aseptiske forhold til at begrænse risikoen for bakteriel og svampe forurening. Alle instrumenter skal steriliseres før brug. Reagenser skal frisklavet inden udførelse af isolation procedure.
Valget af collagenase IV med lav tryptisk aktivitet, er afgørende. Forskellige partier fra samme leverandør har forskellige enzymatisk aktivitet, og de kan have behov for at blive sammenlig…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by EU FP7-ITN Marie-Curie Network program RADDEL. MB and KAJ would like to acknowledge Joe Varguese and Rui Serra Maia for their help and suggestions along the optimization of the Kupffer cell isolation.
Materials
| Euthatal (pentobarbital sodium) | Merial | ||
| CD1 mice | Charles River | – | Mouse weight should vary from 35 to 45 g. We advise the use of male CD1 mice as their weight increase rapidly (e.g. a male CD1 mouse of 7 weeks old exceeds 35 g in weight). It is also advised to contact the animal supplier in advance to arrange for the delivery of older animals. Alternatively animals can be in-house to reach the desired weight. |
| HBSS (Ca2+ and Mg2+ free, with bicarbonate) | Life Technologies | 14175-053 | HBSS must be Ca2+ free. |
| Ethylene Glycol Tetraacetic Acid (EGTA) tetrasodium salt | Sigma-Aldrich | E8145 | EDTA can also be used but EGTA has the advantage of chelating Ca2+ selectively. |
| HEPES (1M) | Life Technologies | 15630-056 | 100 ml |
| Collagenase type IV | Worthington | CSL-4 | It is advised to test different batches of collagenase or at least mention to the supplier the product has to be suitable for liver cell isolation |
| Low glucose DMEM | Sigma-Aldrich | D5523 | 500 ml |
| RPMI (with sodium pyruvate and Glutamax®) | Life Technologies | 12633-012 | 500 ml |
| Penicillin/Steptomycin | Life Technologies | 15140-122 | 100 ml |
| Fetal Bovine Serum | First-Link | 60-00-850 | 500 ml |
| Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | 100 ml |
| Coated silica particle solution (Percoll®) | GE Healtcare | 17-0891-02 | Percoll® is very stable and can be kept for several years |
| 1x Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010-023 | 500 ml |
| 10x Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 70011-036 | 500 ml |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher | D/4120/PB08 | 500 ml |
| LDH kit (CytoTox 96®) | Promega | G1781 | Keep protected from light |
| DMEM phenol red free | Life Technologies | 31053-028 | 500 ml |
| F4/80 antibody (Alexa 488) | AbD Serotec | MCA497A488 | Do not dilute, used neat for flow cytometry |
| Fluorescent beads | Sigma | L2778 | Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red. 1 ml |
| Name of the Material | Company | Catalog number | Comments/Description |
| Butterfly blood collection set (23G/305mm long tubing) | BD | 367288 | |
| Syringe Filters (0.22 μm Blue Rim) | Minisart | 16534-K | |
| Centrifuge Tubes (50 ml Blue Cap) | BD Biosciences, Falcon | 35 2070 | |
| Petri dish (90 x 15 mm) | Thermo Fisher Scientific | BSN 101VR20 | |
| 100 μm cell strainer | BD | 352360 | |
| Peristaltic pump | Watson Marlow | SciQ 300 | Rinse tubing before and after each usage with sterile PBS and 70% ethanol. |
| 24-well plates | Corning | 3526 | |
| 96-well plates | Corning | 3595 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Plate reader | BMG Labtech | FLUOstar Omega | |
| Serrefine forceps | Hammacher GmbH | Art. Nr. HSE 004-35 / Cat. Nr. 221-0051 | The serrefine forceps allow to clamp the vessel cannulated with the 23G needle without the need of holding the forceps during the perfusion procedure. URL: (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html) |
| Flow cytometry tubes | BD Biosciences, Falcon | 352052 | |
| Microcentrifuge tubes (1.5 ml) | Elkay | 000-MICR-150 | |
| Cell scraper | BD Biosciences, Falcon | 353086 | Cut blade extremities with a pair of scissors to scrape cells in 24-well plates. |
| Name of the Reagent | Company | Catalog number | Comments/Description |
| EGTA (Ethylene Glycol Tetraacetic Acid)/HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) Solution | HBSS containing 0.5 mM EGTA and 25 mM HEPES. Adjust pH to 7.4. Prepare 50 ml for each liver to perfuse. | ||
| Collagenase Solution | DMEM low glucose containing collagenase type IV at 100 UI/ml, 15 mM HEPES and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Adjust pH to 7.4. Prepare 100 ml for each liver to perfuse. After adding the collagenase, it is advised to warm up the solution for 30 min before use. This allows the collagenase activity to be optimum. | ||
| Kupffer Cell Isolation Medium | RPMI containing, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% glutamax® (v/v) and 1% Penicllin/Streptomycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers. | ||
| Kupffer Cell Culture Medium | RPMI containing 10% Fetal Bovine Serum, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% Glutamax® (v/v) and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers. | ||
| SIP (solution of isotonic coated silica particles) | Mix 1.7 ml of 10x Phosphate Buffered Saline with 15.3 ml of Percoll® to obtain 17mL of SIP. | ||
| 25% SIP solution | Mix 5 ml of SIP with 15 ml of 1x Phosphate Buffered Saline | ||
| 50% SIP solution | Mix 10 ml of SIP with 10 ml of 1x Phosphate Buffered Saline | ||
| Lysis Buffer | DMEM media with 0.9% Triton X-100 | ||
| PBS/BSA Solution | Prepare fresh Phosphate Buffered Saline pH 7.4 with 1% Bovine Serum Albumin. | ||
References
- Hoffmann, D., et al. Performance of novel kidney biomarkers in preclinical toxicity studies. Toxicol Sci. 116 (1), 8-22 (2010).
- Nel, A., et al. Nanomaterial Toxicity Testing in the 21st Century: Use of a Predictive Toxicological Approach and High-Throughput Screening. Accounts of Chemical Research. 46 (3), 607-621 (2013).
- Bregoli, L., et al. Toxicity of antimony trioxide nanoparticles on human hematopoietic progenitor cells and comparison to cell lines. Toxicology. 262 (2), 121-129 (2009).
- Yamasaki, K., et al. Genomic Aberrations and Cellular Heterogeneity in SV40-Immortalized Human Corneal Epithelial Cells. Investigative Ophthalmology, & Visual Science. 50 (2), 604-613 (2009).
- Motoyoshi, Y., et al. Megalin contributes to the early injury of proximal tubule cells during nonselective proteinuria. Kidney International. 74 (10), 1262-1269 (1038).
- Prozialeck, W. C., Edwards, J. R., Lamar, P. C., Smith, C. S. Epithelial barrier characteristics and expression of cell adhesion molecules in proximal tubule-derived cell lines commonly used for in vitro toxicity studies. Toxicology in Vitro. 20 (6), 942-953 (2006).
- Chamberlain, L. M., Godek, M. L., Gonzalez-Juarrero, M., Grainger, D. W. Phenotypic non-equivalence of murine (monocyte-) macrophage cells in biomaterial and inflammatory models. J Biomed Mater Res A. 88 (4), 858-871 (2009).
- Kermanizadeh, A., et al. The role of Kupffer cells in the hepatic response to silver nanoparticles. Nanotoxicology. , (2013).
- Fischer, H. C., Hauck, T. S., Gomez-Aristizabal, A., Chan, W. C. W. Exploring Primary Liver Macrophages for Studying Quantum Dot Interactions with Biological Systems. Advanced Materials. 22 (23), 2520-2524 (2010).
- Wan, J. H., et al. M2 Kupffer Cells Promote M1 Kupffer Cell Apoptosis: A Protective Mechanism Against Alcoholic and Nonalcoholic Fatty Liver Disease. Hepatology. 59 (1), 130-142 (2014).
- Matsuoka, M., Tsukamoto, H. Stimulation of hepatic lipocyte collagen production by Kupffer cell-derived transforming growth factor β: Implication for a pathogenetic role in alcoholic liver fibrogenesis. Hepatology. 11 (4), 599-605 (1990).
- Polakos, N. K., et al. Kupffer Cell-Dependent Hepatitis Occurs during Influenza Infection. The American Journal of Pathology. 168 (4), 1169-1178 (2006).
- Tanner, A., Keyhani, A., Reiner, R., Holdstock, G., Wright, R. Proteolytic enzymes released by liver macrophages may promote hepatic injury in a rat model of hepatic damage. Gastroenterology. 80 (4), 647-654 (1981).
- Knittel, T., et al. Expression patterns of matrix metalloproteinases and their inhibitors in parenchymal and non-parenchymal cells of rat liver: regulation by TNF-α and TGF-β1. Journal of Hepatology. 30 (1), 48-60 (1999).
- Branster, M. V., Morton, R. K. Isolation of Intact Liver Cells. Nature. 180 (4597), 1283-1284 (1038).
- Smedsrød, B., Pertoft, H. Preparation of pure hepatocytes and reticuloendothelial cells in high yield from a single rat liver by means of Percoll centrifugation and selective adherence. Journal of Leukocyte Biology. 38 (2), 213-230 (1985).
- Morin, O., Patry, P., Lafleur, L. Heterogeneity of endothelial cells of adult rat liver as resolved by sedimentation velocity and flow cytometry. J Cell Physiol. 119 (3), 327-334 (1984).
- Miller, S. B., et al. Purification of cells from livers of carcinogen-treated rats by free-flow electrophoresis. Cancer Res. 43 (9), 4176-4179 (1983).
- Firme, C. P., Bandaru, P. R. Toxicity issues in the application of carbon nanotubes to biological systems. Nanomedicine. 6 (2), 245-256 (2010).
- Ali-Boucetta, H., Al-Jamal, K. T., Kostarelos, K. Cytotoxic assessment of carbon nanotube interaction with cell cultures. Methods in Molecular Biology. 726, 299-312 (2011).
- Wang, G., et al. Understanding and correcting for carbon nanotube interferences with a commercial LDH cytotoxicity assay. Toxicology. 299 (2-3), 99-111 (2012).
- Wang, J. T. -. W., et al. Magnetically Decorated Multiwalled Carbon Nanotubes as Dual MRI and SPECT Contrast Agents. Advanced Functional Materials. 24 (13), 1880-1894 (2014).
- Li, P. Z., Li, J. Z., Li, M., Gong, J. P., He, K. An efficient method to isolate and culture mouse Kupffer cells. Immunol Lett. 158 (1-2), 52-56 (2014).
- Froh, M., Konno, A., Thurman, R. G. Isolation of liver Kupffer cells. Curr Protoc Toxicol. Chapter 14, Unit14 14 (2003).
