Liver macrophages, named Kupffer cells, are responsible for the capture of circulating nanoparticles. We describe here a method, of high cell purity and yield, for Kupffer cell isolation. The modified LDH assay is used here to measure the toxicity induced by carbon nanotubes in Kupffer cells.
La grande majorité des études in vitro de nanotoxicological ont utilisé des lignées cellulaires immortalisées pour leur praticité. Cependant, les résultats des tests de toxicité des nanoparticules dans des lignées cellulaires immortalisées ou des cellules primaires ont montré des anomalies, en soulignant la nécessité d'étendre l'utilisation de cellules primaires pour les essais in vitro. Ce protocole décrit l'isolement de macrophages hépatiques de souris, les cellules de Kupffer Nom de famille, ainsi que leur utilisation pour étudier la toxicité des nanoparticules. Les cellules de Kupffer population des macrophages sont les plus abondants dans le corps et constituent une partie du système réticulo-endothélial (RES), responsable de la capture des nanoparticules de circulation. La méthode d'isolement des cellules de Kupffer est question ici est basé sur une méthode de perfusion deux étapes suivi d'une purification sur gradient de densité. La méthode, basée sur la digestion de collagénase et une centrifugation de densité, est une adaptation du protocole d'origine développé par Smedsrød et al. conçu pour les cellules du foie de rat isolation et fournit un rendement élevé (jusqu'à 14 x 10 6 cellules par souris) et de haute pureté (> 95%) des cellules de Kupffer. Cette méthode d'isolement ne nécessite pas d'équipements sophistiqués et coûteux ou représente donc un compromis idéal entre la complexité et le rendement de la cellule. L'utilisation de souris plus lourds (35 à 45 g) permet d'améliorer le rendement du procédé d'isolation, mais aussi facilite remarquablement le mode opératoire de canulation de la veine porte. La toxicité des nanotubes de carbone fonctionnalisés f -CNTs a été mesuré dans ce modèle par le dosage de la LDH modifié. Cette méthode évalue la viabilité des cellules en mesurant le manque d'intégrité structurelle de la membrane des cellules de Kupffer après incubation avec -CNTs f. Toxicité induite par -CNTs f peut être mesurée en utilisant systématiquement ce test, soulignant que les cellules de Kupffer isolées sont utiles pour les tests de toxicité des nanoparticules. La compréhension globale de la nanotoxicologie pourrait bénéficier de ces modèles, ce qui rend la sélection de nanoparticules pour la traduction clinique plus efficace.
Le domaine de la recherche de la nanotoxicologie vise à caractériser l'effet biologique des nanoparticules. Les études toxicologiques basées sur des investigations in vivo restent les méthodes les plus précises. Toutefois, leur utilisation est limitée par leur coût, travail et temps exigences 1. Comme essais alternatives, in vitro ont été utilisées en raison de leur simplicité et de la possibilité de développer à haut débit dans les plateformes de test in vitro 2 – étendant ainsi le nombre de conditions testées. La plupart des études sont effectuées en utilisant nanotoxicological dans des essais in vitro sur des lignées de cellules immortalisées. Cependant, il ya des préoccupations concernant l'extrapolation de ces résultats expérimentaux à des effets toxicologiques in vivo 3. En effet, les propriétés des lignées cellulaires immortalisées peuvent être significativement différents de tissus ils ont été dérivés à partir, par exemple, la transformation génétique 4, la détérioration des caractéristiques morphologiques clés5, la perte de la polarité cellulaire 6 et altérations fonctionnelles telles que la réglementation des médiateurs inflammatoires 7.
Les cellules de Kupffer population des macrophages sont les plus abondants dans le corps et sont directement en contact avec le sang en alignant la paroi de sinusoïdes hépatiques. Dans le cadre du système réticulo-endothélial (RES), les macrophages sont responsables de la capture des nanoparticules de circulation et, par conséquent, constituent un modèle très approprié pour étudier la toxicité des nanoparticules. In vivo 8 et in vitro 9 études de réponses inflammatoires associées à des cellules de Kupffer exposés à des nanoparticules ont été publiés ailleurs. Les cellules de Kupffer ont également été impliqués dans la pathogenèse des maladies du foie telles que la maladie alcoolique du foie 10, la fibrose hépatique ou hépatite virale 11 12. Il a été rapporté que les cellules de Kupffer isolés donnent un aperçu utile de décrire les mécanismes cellulaires involved dans la perturbation du foie 13,14.
Plusieurs procédés ont été rapportés pour isoler et purifier des cellules de Kupffer. l'isolement cellulaire peut causer de la dissociation mécanique ou enzymatique 15. Digestion collagénase montre l'intérêt de la conservation de l'intégrité fonctionnelle des cellules de Kupffer, tout en conduisant à haute Kupffer rendement de la cellule 16. De nombreuses approches expérimentales différentes, la complexité et les coûts, ont été utilisées pour séparer les cellules de Kupffer les autres populations de cellules du foie. Par exemple, des cellules de Kupffer pureté peut être obtenue par immunoaffinite 17, le flux 18 électrophorèse, l'adhérence sélective 16 ou par des techniques d'épandage 16, qui sélectionnent les cellules selon leur taille et leur densité. Une combinaison de ces méthodes peut être choisie pour augmenter la pureté de la population 16. Il n'y a pas de consensus sur la méthode idéale pour l'isolation des cellules de Kupffer, car elle dépend principalement sur les applications disponibles et équipemt. Toutefois, dans le cas des essais de toxicité de nanoparticules, la simplicité et un rendement élevé de la technique associée à la conservation fonctionnelle des cellules de Kupffer ont semblé être plus approprié pour cette application.
La méthode d'isolement des cellules de Kupffer est question ici est basé sur une méthode de perfusion deux étapes suivi d'une purification sur gradient de densité. Le procédé a été modifié par rapport au protocole initial développé par Smedsrød et al. 16 conçus pour l'isolement des cellules de foie de rat. La plupart des études ont rapporté et décrit l'isolement de cellules de Kupffer du foie de rat. Ici, nous décrivons une méthode pour isoler les cellules de Kupffer du foie de la souris, avec un rendement élevé et de pureté. L'utilisation de souris réduit le coût de l'expérimentation et permet le traitement de plusieurs foies d'obtenir de grandes quantités de cellules de Kupffer pour les tests de toxicité des nanoparticules.
Dans le protocole suivant, les cellules de Kupffer ont été incubées avec des nanotubes de carbone fonctionnalisés (f </em> -CNTs). Les propriétés physico-chimiques uniques de NTC – c.-à-haute rapport de longueur à diamètre et grande surface, ont fait NTC candidats intéressants comme vecteurs pour des fins de thérapie et de diagnostic. Toutefois, des préoccupations ont été soulevées concernant la toxicité des nanotubes de carbone 19, et le développement de nouveaux tests in vitro vise à accroître la compréhension des effets biologiques CNT. Toxicité chez les cellules de Kupffer est associé à un manque d'intégrité structurelle de la membrane cellulaire. Elle est mesurée par la perte de l'enzyme LDH cytoplasmique de la cellule dans le surnageant. Le principe de cette méthode est donc de supprimer tout LDH libérée et de mesurer ce qui reste dans les cellules 20. Ceci est réalisé de préférence à la mesure de la LDH libérée dans le surnageant parce que la présence de nanotubes de carbone dans le surnageant interfère avec l'essai 21.
Nous vous proposons l'utilisation de ce métho d'isolement des cellules de Kupffer efficace simple et économiqued pour isoler nombre élevé de cellules fonctionnelles Kupffer. Ceci permet le criblage de la toxicité d'une gamme de nanoparticules, dans un modèle de macrophage primaire pertinente.
Les étapes suivantes sont essentielles pour atteindre un rendement élevé et une haute viabilité des cellules de Kupffer. Des conditions d'asepsie doivent être utilisés pour limiter le risque de contamination bactérienne et fongique. Tous les instruments doivent être stérilisés avant utilisation. Les réactifs doivent être fraîchement préparées avant d'effectuer la procédure d'isolement.
Le choix de la collagénase IV, avec une faible activité tryptique, est crucia…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by EU FP7-ITN Marie-Curie Network program RADDEL. MB and KAJ would like to acknowledge Joe Varguese and Rui Serra Maia for their help and suggestions along the optimization of the Kupffer cell isolation.
Euthatal (pentobarbital sodium) | Merial | ||
CD1 mice | Charles River | – | Mouse weight should vary from 35 to 45 g. We advise the use of male CD1 mice as their weight increase rapidly (e.g. a male CD1 mouse of 7 weeks old exceeds 35 g in weight). It is also advised to contact the animal supplier in advance to arrange for the delivery of older animals. Alternatively animals can be in-house to reach the desired weight. |
HBSS (Ca2+ and Mg2+ free, with bicarbonate) | Life Technologies | 14175-053 | HBSS must be Ca2+ free. |
Ethylene Glycol Tetraacetic Acid (EGTA) tetrasodium salt | Sigma-Aldrich | E8145 | EDTA can also be used but EGTA has the advantage of chelating Ca2+ selectively. |
HEPES (1M) | Life Technologies | 15630-056 | 100 ml |
Collagenase type IV | Worthington | CSL-4 | It is advised to test different batches of collagenase or at least mention to the supplier the product has to be suitable for liver cell isolation |
Low glucose DMEM | Sigma-Aldrich | D5523 | 500 ml |
RPMI (with sodium pyruvate and Glutamax®) | Life Technologies | 12633-012 | 500 ml |
Penicillin/Steptomycin | Life Technologies | 15140-122 | 100 ml |
Fetal Bovine Serum | First-Link | 60-00-850 | 500 ml |
Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | 100 ml |
Coated silica particle solution (Percoll®) | GE Healtcare | 17-0891-02 | Percoll® is very stable and can be kept for several years |
1x Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010-023 | 500 ml |
10x Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 70011-036 | 500 ml |
Dimethyl sulfoxide | Fisher | D/4120/PB08 | 500 ml |
LDH kit (CytoTox 96®) | Promega | G1781 | Keep protected from light |
DMEM phenol red free | Life Technologies | 31053-028 | 500 ml |
F4/80 antibody (Alexa 488) | AbD Serotec | MCA497A488 | Do not dilute, used neat for flow cytometry |
Fluorescent beads | Sigma | L2778 | Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red. 1 ml |
Name of the Material | Company | Catalog number | Comments/Description |
Butterfly blood collection set (23G/305mm long tubing) | BD | 367288 | |
Syringe Filters (0.22 μm Blue Rim) | Minisart | 16534-K | |
Centrifuge Tubes (50 ml Blue Cap) | BD Biosciences, Falcon | 35 2070 | |
Petri dish (90 x 15 mm) | Thermo Fisher Scientific | BSN 101VR20 | |
100 μm cell strainer | BD | 352360 | |
Peristaltic pump | Watson Marlow | SciQ 300 | Rinse tubing before and after each usage with sterile PBS and 70% ethanol. |
24-well plates | Corning | 3526 | |
96-well plates | Corning | 3595 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
Plate reader | BMG Labtech | FLUOstar Omega | |
Serrefine forceps | Hammacher GmbH | Art. Nr. HSE 004-35 / Cat. Nr. 221-0051 | The serrefine forceps allow to clamp the vessel cannulated with the 23G needle without the need of holding the forceps during the perfusion procedure. URL: (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html) |
Flow cytometry tubes | BD Biosciences, Falcon | 352052 | |
Microcentrifuge tubes (1.5 ml) | Elkay | 000-MICR-150 | |
Cell scraper | BD Biosciences, Falcon | 353086 | Cut blade extremities with a pair of scissors to scrape cells in 24-well plates. |
Name of the Reagent | Company | Catalog number | Comments/Description |
EGTA (Ethylene Glycol Tetraacetic Acid)/HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) Solution | HBSS containing 0.5 mM EGTA and 25 mM HEPES. Adjust pH to 7.4. Prepare 50 ml for each liver to perfuse. | ||
Collagenase Solution | DMEM low glucose containing collagenase type IV at 100 UI/ml, 15 mM HEPES and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Adjust pH to 7.4. Prepare 100 ml for each liver to perfuse. After adding the collagenase, it is advised to warm up the solution for 30 min before use. This allows the collagenase activity to be optimum. | ||
Kupffer Cell Isolation Medium | RPMI containing, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% glutamax® (v/v) and 1% Penicllin/Streptomycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers. | ||
Kupffer Cell Culture Medium | RPMI containing 10% Fetal Bovine Serum, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% Glutamax® (v/v) and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers. | ||
SIP (solution of isotonic coated silica particles) | Mix 1.7 ml of 10x Phosphate Buffered Saline with 15.3 ml of Percoll® to obtain 17mL of SIP. | ||
25% SIP solution | Mix 5 ml of SIP with 15 ml of 1x Phosphate Buffered Saline | ||
50% SIP solution | Mix 10 ml of SIP with 10 ml of 1x Phosphate Buffered Saline | ||
Lysis Buffer | DMEM media with 0.9% Triton X-100 | ||
PBS/BSA Solution | Prepare fresh Phosphate Buffered Saline pH 7.4 with 1% Bovine Serum Albumin. | ||