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Immunology and Infection

Nanoparticle विषाक्तता परीक्षण के लिए Kupffer सेल अलगाव

doi: 10.3791/52989 Published: August 18, 2015

Abstract

इन विट्रो nanotoxicological पढ़ाई की बड़ी संख्या को उनकी व्यावहारिकता के लिए अमर सेल लाइनों का इस्तेमाल किया है। हालांकि, अमर सेल लाइनों या प्राथमिक कोशिकाओं में nanoparticle विषाक्तता परीक्षण से परिणाम के लिए इन विट्रो assays के लिए प्राथमिक कोशिकाओं के उपयोग का विस्तार करने की आवश्यकता पर प्रकाश डाला, विसंगतियों से पता चला है। इस प्रोटोकॉल माउस जिगर मैक्रोफेज के अलगाव का नाम Kupffer कोशिकाओं, और nanoparticle विषाक्तता अध्ययन करने के लिए उनके उपयोग का वर्णन करता है। Kupffer कोशिकाओं को शरीर में सबसे प्रचुर मात्रा में बृहतभक्षककोशिका आबादी रहे हैं और नैनोकणों परिसंचारी के कब्जा करने के लिए जिम्मेदार reticulo-एन्दोथेलिअल प्रणाली (आरईएस) का हिस्सा बनता है। यहां बताया Kupffer सेल अलगाव विधि घनत्व ढाल पर शुद्धि के बाद एक 2-कदम छिड़काव पद्धति पर आधारित है। collagenase पाचन और घनत्व centrifugation के आधार पर विधि, Smedsrød एट अल द्वारा विकसित मूल प्रोटोकॉल से अनुकूलित है। चूहा जिगर सेल isolatio के लिए बनाया गयाn और उच्च उपज प्रदान करता है और Kupffer कोशिकाओं के उच्च शुद्धता (> 95%) (14 एक्स 10 6 माउस प्रति कोशिकाओं तक)। इस अलगाव विधि परिष्कृत या महंगे उपकरण की आवश्यकता होती है और इसलिए जटिलता और सेल उपज के बीच एक आदर्श समझौता का प्रतिनिधित्व नहीं करता है। भारी चूहों (35-45 ग्राम) का उपयोग अलगाव विधि की उपज में सुधार, लेकिन यह भी उल्लेखनीय पोर्टल शिरा केन्युलेशन की प्रक्रिया की सुविधा। -CNTs Functionalized कार्बन नैनोट्यूब की विषाक्तता संशोधित LDH से परख द्वारा इस मॉडल में मापा गया था। इस विधि -CNTs साथ ऊष्मायन के बाद Kupffer कोशिका झिल्ली के संरचनात्मक अखंडता की कमी को मापने के द्वारा सेल व्यवहार्यता का आकलन है। एफ -CNTs द्वारा प्रेरित विषाक्तता पृथक Kupffer कोशिकाओं nanoparticle विषाक्तता परीक्षण के लिए उपयोगी होते हैं पर प्रकाश डाला, इस परख का उपयोग लगातार मापा जा सकता है। Nanotoxicology के समग्र समझ नैदानिक ​​अनुवाद अधिक effi के लिए nanoparticle चयन कर रही है, इस तरह के मॉडल से फायदा हो सकता हैcient।

Introduction

Nanotoxicology अनुसंधान के क्षेत्र नैनोकणों के जैविक प्रभाव चिह्नित करने के लिए करना है। इन विवो जांच के आधार पर विषाक्तता अध्ययन के लिए सबसे सही तरीकों के रहते हैं। हालांकि, उनके उपयोग उनकी लागत, श्रम और समय की आवश्यकताओं 1 द्वारा सीमित है। विकल्प, इन विट्रो assays क्योंकि उनकी सादगी और इन विट्रो परीक्षण प्लेटफार्मों 2 में उच्च throughput के विकास की संभावना का इस्तेमाल किया गया है के रूप में - तो जांच की शर्तों की संख्या में विस्तार। अधिकांश nanotoxicological पढ़ाई अमर सेल लाइनों के साथ इन विट्रो assays में उपयोग करते हुए प्रदर्शन कर रहे हैं। हालांकि, इन विवो विषाक्तता प्रभाव 3 करने के लिए इन प्रयोगात्मक निष्कर्ष के निष्कर्षों के बारे में चिंता कर रहे हैं। दरअसल, अमर सेल लाइनों के गुणों को वे से प्राप्त किए गए ऊतकों, जैसे आनुवंशिक परिवर्तन 4, कुंजी रूपात्मक सुविधाओं की गिरावट से काफी अलग हो सकता है5, सेलुलर polarity के 6 और इस तरह के भड़काऊ मध्यस्थों 7 के नियमन के रूप में कार्य परिवर्तन का नुकसान।

Kupffer कोशिकाओं को शरीर में सबसे प्रचुर मात्रा में बृहतभक्षककोशिका आबादी होते हैं और जिगर sinusoids की दीवार अस्तर द्वारा रक्त के साथ संपर्क में सीधे हैं। Reticulo-एन्दोथेलिअल प्रणाली (आरईएस) के हिस्से के रूप में, इन मैक्रोफेज नैनोकणों परिसंचारी और इसलिए का कब्जा के लिए जिम्मेदार हैं, nanoparticle विषाक्तता अध्ययन करने के लिए एक अत्यधिक उपयुक्त मॉडल का गठन। में vivo 8 और इन विट्रो में नैनोकणों के संपर्क में Kupffer कोशिकाओं के साथ जुड़े भड़काऊ प्रतिक्रियाओं के 9 पढ़ाई कहीं और प्रकाशित किया गया है। Kupffer कोशिकाओं को भी इस तरह के मादक जिगर की बीमारी के 10, जिगर फाइब्रोसिस 11 या वायरल हैपेटाइटिस के रूप में 12 यकृत रोग के रोगजनन में शामिल किया गया है। यह अलग Kupffer कोशिकाओं सेलुलर तंत्र निवेश संबंधी निर्णय का वर्णन करने के लिए उपयोगी अंतर्दृष्टि प्रदान की सूचना मिली थीजिगर व्यवधान 13,14 में olved।

कई तरीकों को अलग करने और Kupffer कोशिकाओं को शुद्ध करने के लिए सूचित किया गया है। सेल अलगाव यांत्रिक या एंजाइमी हदबंदी 15 से परिणाम कर सकते हैं। Collagenase पाचन उच्च Kupffer सेल उपज 16 के लिए अग्रणी है, जबकि Kupffer कोशिकाओं के कार्यात्मक अखंडता के संरक्षण का लाभ दर्शाता है। जटिलता और लागत में अलग-अलग कई प्रयोगात्मक दृष्टिकोण, अन्य जिगर सेल आबादी से Kupffer कोशिकाओं को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। उदाहरण के लिए, Kupffer सेल शुद्धता immunoaffinity 17, प्रवाह वैद्युतकणसंचलन 18, चयनात्मक आसंजन 16 द्वारा या उनके आकार और घनत्व के अनुसार कक्षों का चयन करें जो केन्द्रापसारक तकनीक 16 के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। इन तरीकों का एक संयोजन आबादी 16 वर्ष की शुद्धता को बढ़ाने के लिए चुना जा सकता है। यह ज्यादातर आवेदन और उपलब्ध equipmen पर निर्भर करता है के रूप में Kupffer सेल अलगाव के लिए आदर्श विधि के बारे में कोई आम सहमति नहीं है,टी। हालांकि, nanoparticle विषाक्तता परीक्षण के मामले में, सादगी और Kupffer कोशिकाओं के कार्यात्मक संरक्षण के साथ जुड़े तकनीक के उच्च उपज इस आवेदन के लिए सबसे उपयुक्त हो दिखाई दिया।

यहां बताया Kupffer सेल अलगाव विधि घनत्व ढाल पर शुद्धि के बाद एक 2-कदम छिड़काव पद्धति पर आधारित है। विधि Smedsrød एट अल द्वारा विकसित मूल प्रोटोकॉल से संशोधित किया गया था। 16 चूहा जिगर सेल अलगाव के लिए बनाया गया है। अधिकांश अध्ययन की सूचना दी और चूहे यकृत से Kupffer कोशिकाओं के अलगाव का वर्णन किया। इस के साथ साथ, हम एक उच्च उपज और पवित्रता पर, माउस जिगर से Kupffer कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक विधि का वर्णन। चूहों का उपयोग प्रयोग लागत कम कर देता है और कई यकृत के प्रसंस्करण nanoparticle विषाक्तता परीक्षण के लिए Kupffer कोशिकाओं की बड़ी मात्रा में प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है।

निम्नलिखित प्रोटोकॉल में, Kupffer कोशिकाओं (च Functionalized कार्बन नैनोट्यूब के साथ incubated रहे थे अर्थात्। हालांकि, चिंता CNTs 19 की विषाक्तता, और इन विट्रो परीक्षणों में नए के विकास CNT के जैविक प्रभाव की समझ बढ़ाने के उद्देश्य के बारे में उठाया गया है। Kupffer सेल में विषाक्तता कोशिका झिल्ली के संरचनात्मक अखंडता की कमी के साथ जुड़ा हुआ है। इस सतह पर तैरनेवाला में सेल से cytoplasmic एंजाइम LDH के नुकसान से मापा जाता है। इस विधि का सिद्धांत है, इसलिए कोई भी जारी किया LDH से हटाने और कोशिकाओं को 20 में छोड़ दिया है क्या उपाय है। सतह पर तैरनेवाला में CNTs की उपस्थिति परख 21 के साथ हस्तक्षेप क्योंकि इस सतह पर तैरनेवाला में जारी LDH से मापने के लिए पसंद किया जाता है।

हम इस सरल और लागत प्रभावी Kupffer सेल अलगाव metho के उपयोग का प्रस्तावडी कार्यात्मक Kupffer कोशिकाओं की उच्च संख्या अलग करने के लिए। यह एक प्रासंगिक प्राथमिक बृहतभक्षककोशिका मॉडल में, नैनोकणों की एक श्रृंखला की विषाक्तता की स्क्रीनिंग की अनुमति देता है।

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Protocol

सभी पशु प्रयोगों सभी प्रासंगिक दिशा निर्देशों, नियमों और नियामक एजेंसियों के अनुपालन में मार डाला गया। प्रोटोकॉल ब्रिटेन के गृह कार्यालय विनियमन के मार्गदर्शन और अनुमोदन के तहत किया गया था प्रदर्शन किया जा रहा

1. छिड़काव और सेल संग्रह (चित्रा 1)

चित्र 1
चित्रा 1:। लिवर छिड़काव माउस के संज्ञाहरण के बाद, पाचन तंत्र पहलू के बल सुलभ पोर्टल शिरा (पीवी) बनाने के क्रम में पेट के बाईं ओर ले जाया जाता है। पीवी तुरंत जिगर के भीतर किसी भी अतिरिक्त दबाव से बचने के लिए उठी EGTA / HBSS समाधान की एक धीमी गति से प्रवाह की दर (1-3 मिलीग्राम / मिनट) और अवर veina कावा (आईवीसी) का उपयोग कर cannulated है। छिड़काव के पहले मिनट के भीतर, प्रवाह की दर धीरे-धीरे / मिनट 7 मिलीलीटर की वृद्धि हुई है। अपनी पूरी पाचन हासिल की है, जब तक collagenase समाधान तो 10 मिलीग्राम / मिनट पर perfused है।

  1. Prepaहौसले सामग्री तालिका में वर्णित सभी अभिकर्मकों रहे हैं।
  2. EGTA (ethylene glycol टेट्रा-एसिटिक एसिड) / HBSS (हांक संतुलित नमक समाधान) समाधान (माउस प्रति 50 मिलीलीटर) और 40 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए collagenase समाधान (माउस प्रति 100 मिलीलीटर) गर्म।
  3. पहले 70% इथेनॉल के साथ पंप लचीला ट्यूबिंग कुल्ला। नहाने के पानी में डूबे एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में EGTA / HBSS समाधान के 40 एमएल डालो और पूर्व गर्म EGTA / HBSS समाधान के साथ पंप लचीला ट्यूबिंग कुल्ला।
  4. मज़बूती से श्वसन अवसाद और मृत्यु से पहले बेहोशी का उत्पादन करने के लिए एक बार्बिटुरेट का उपयोग कर टर्मिनल संज्ञाहरण प्रदर्शन करते हैं। एक महिला या पुरुष CD1 माउस (35-45 ग्राम) में 1 मिलीग्राम / किग्रा, आईपी पर phenobarbitone इंजेक्षन। पैर की अंगुली pinching द्वारा संज्ञाहरण की पुष्टि करें।
  5. पेट बाल दाढ़ी और 70% इथेनॉल समाधान का उपयोग पेट की सतह बाँझ।
  6. उदर गुहा के माध्यम से कट और पेट के बाईं ओर laterally आंत ले जाकर पोर्टल शिरा और अवर रग Cava बेनकाब।
  7. सिताराटी EGTA / HBSS समाधान के साथ 1-3 मिलीग्राम / मिनट की गति से पंप और एक 23 जी तितली सुई का उपयोग पोर्टल नस cannulate (पंख) में कटौती। 23 जी सुई के साथ cannulated पोर्टल शिरा की धारा दबाना और फिर खोला माउस पेट की सतह पर serrefine संदंश फ्लिप। जिगर जल्दी EGTA / HBSS समाधान छिड़काव के पहले 30 सेकंड के भीतर पीला चाहिए।
  8. तेजी से जिगर में अतिरिक्त दबाव इमारत से बचने के लिए निम्न वेना कावा के निचले हिस्से काटकर अलग कर देना, और उसके बाद छिड़काव के पहले मिनट से अधिक, 7 मिलीग्राम / मिनट के लिए धीरे-धीरे प्रवाह की दर में वृद्धि। पशु कारण caval venipuncture रग को माध्यमिक खून बह रहा करने के लिए मर जाता है।
  9. EGTA / HBSS समाधान के कम से कम 5 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में शेष है, जब collagenase समाधान (40-50 मिलीग्राम) के साथ भरने। 30 सेकंड से अधिक, 10 मिलीग्राम / मिनट के लिए धीरे-धीरे प्रवाह दर में वृद्धि।
  10. 5-10 सेकंड के अंतराल के लिए, चिमटी का प्रयोग, अवर रग Cava करने के लिए दबाव लागू करने से जिगर प्रफुल्लित बनाओ। थीएस (पाचन के दौरान 5-10 बार) समय समय पर किया जा सकता है। यह कदम जिगर सेल हदबंदी में सुधार लाने और Collagenase के साथ छिड़काव समय कम हो जाएगा।
  11. Collagenase समाधान के कम से कम 10 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब के भीतर रहता है, अपकेंद्रित्र ट्यूब में पूर्व गर्म collagenase समाधान के 40-50 मिलीलीटर डालना।
  12. छिड़काव के 10-15 मिनट और perfused collagenase समाधान के बारे में 70-80 मिलीलीटर के बाद, एक संदंश के साथ जिगर की सतह पर एक छोटा सा दबाव लागू होते हैं। दबाव का एक प्रिंट जिगर की कोशिकाओं अलग हैं कि इंगित करता है।
  13. एक टुकड़े के रूप में उदर गुहा से जिगर निकालें और Kupffer कोशिकाओं अलगाव मीडियम के 20-30 मिलीलीटर युक्त एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में जगह है। जिगर सेल व्यवहार्यता को प्रभावित करने से बचने के लिए 3 घंटा की अधिकतम अवधि के लिए बर्फ पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर जिगर की कोशिकाओं रखें।
  14. बर्फ पर perfused जिगर रखते हुए, यदि आवश्यक हो तो कई जानवरों पर छिड़काव की प्रक्रिया को दोहराएं। पूल शुद्धि के लिए तीन यकृत के लिए एक और चरण 3 के साथ आगे बढ़ें।

केन्द्रापसारण के लिए घनत्व ढाल 2. तैयारी (चित्रा 2)

चित्र 2
चित्रा 2:। घनत्व ढाल की तैयारी सभी प्रक्रियाओं बाँझ शर्त के तहत किया जाता है। एसआईपी 10 में से 1.7 एमएल एक्स पीबीएस के साथ लेपित सिलिका के कण समाधान के 15.3 मिलीलीटर के मिश्रण से तैयार किया जाता है। एसआईपी के एक 5 मिलीलीटर 20 मिलीलीटर 25% एसआईपी समाधान बनाने के लिए पीबीएस के 15 मिलीलीटर के साथ मिश्रित कर रहे हैं। एसआईपी के 10 एमएल 20 मिलीलीटर 50% एसआईपी समाधान बनाने के लिए पीबीएस के 10 एमएल के साथ मिश्रित कर रहे हैं। 50% एसआईपी समाधान (20 मिलीग्राम) झुका हुआ है और 25% एसआईपी समाधान (20 मिलीलीटर) युक्त एक अपकेंद्रित्र ट्यूब धीरे धीरे एक सीरम वैज्ञानिक 25 एमएल पिपेट का उपयोग कर जोड़ा गया है।

  1. बाँझ शर्त के तहत निम्नलिखित कदम (धारा 2, 3 और 5) के साथ आगे बढ़ें और सी बर्फ पर या 4 डिग्री पर कोशिकाओं रहते हैं। 10 में से 1.7 एमएल एक्स पीबीएस के साथ लेपित सिलिका के कण समाधान के 15.3 मिलीलीटर मिलाकर पीएं (Isotonic लेपित सिलिका के कण का समाधान) तैयार करें। 25% एसआईपी समाधान के 20 मिलीलीटर बनाने पीबीएस के 15 मिलीलीटर के साथ सिप के 5 मिलीलीटर मिश्रण करने के लिए। पीबीएस के 10 एमएल के साथ सिप के 10 एमएल मिश्रण, 50% एसआईपी समाधान के 20 मिलीलीटर करना।
  2. 50% एसआईपी समाधान के 20 मिलीलीटर के साथ एक अपकेंद्रित्र ट्यूब भरें। 90 डिग्री के करीब एक कोण पर अपकेंद्रित्र ट्यूब झुकाएँ और 50% एसआईपी परत की सतह को छूने के बिना, एक 25 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग ट्यूब की ओर दीवार पर धीरे-धीरे 25% एसआईपी समाधान (20 एमएल) जोड़ें। 25% एसआईपी समाधान जोड़ने, उत्तरोत्तर ट्यूब के कोण को कम। बर्फ पर उपयोग करें जब तक घनत्व ढाल रखें।

3. Kupffer सेल शोधन (चित्रा 3)

चित्र तीन
चित्रा 3:। घनत्व ढाल centrifugation और कोशिका आसंजन द्वारा Kupffer कोशिकाओं के शोधन सभी प्रक्रियाओं बाँझ शर्त के तहत किया जाता है। (ए) Glisson कैप्सूल का टूटना के बाद, जिगर की कोशिकाओं में एक 1 के माध्यम से छान रहे हैं00 माइक्रोन झरनी। निलंबन hepatocytes (छर्रों) त्यागने और गैर parenchymal सेल अंश (सतह पर तैरनेवाला) को इकट्ठा करने के लिए x 50 ग्राम पर centrifuged है। यह चरण 3 बार दोहराया है। गैर-parenchymal कोशिकाओं को एक असंतत आइसोटोनिक ढाल के शीर्ष पर जोड़ा गया है और 15 मिनट के लिए 800 XG पर centrifuged हैं। 25% एसआईपी गद्दी से एकत्र Kupffer कोशिकाओं कोशिका आसंजन चयन करके आगे शुद्ध कर रहे हैं। (बी) कोशिकाओं 24 अच्छी तरह से थाली में चढ़ाया और 30 मिनट के लिए सीओ 2 37 डिग्री सेल्सियस पर incubated और 5% कर रहे हैं। गैर पक्षपाती कोशिकाओं HBSS के 500 μl के साथ एक बार धोया जाता है। Kupffer कोशिकाओं -CNTs कोशिकाओं को जोड़ा जा सकता है जब चढ़ाना, के बाद उनके अनुयायी आकृति विज्ञान 4 घंटा प्रदर्शित करते हैं। पैमाने बार 25 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. Kupffer सेल अलगाव मध्यम के 15 मिलीलीटर के साथ एक पेट्री डिश में एक perfused जिगर रखो। (Glisson कैप्सूल टूटनाजिगर की झिल्ली) कैंची का उपयोग और Kupffer सेल अलगाव माध्यम में सभी जिगर की कोशिकाओं जारी। एक 100 माइक्रोन सेल झरनी एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में एकत्र होने के लिए हालांकि समाधान फ़िल्टर। अतिरिक्त perfused यकृत पर छिड़काव प्रक्रिया को दोहराएँ और (तीन चूहों से 45 मिलीलीटर अप करने के लिए एक माउस से 15 मिलीलीटर,) एक ही अपकेंद्रित्र ट्यूब में कोशिकाओं पूल।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 50 XG पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र। गोली और (Kupffer कोशिकाओं सहित) गैर-parenchymal कोशिकाओं सतह पर तैरनेवाला में होगा में parenchymal कोशिकाओं (hepatocytes) हो जाएगा।
  3. 2 मिनट प्रत्येक के लिए 50 XG पर एक साफ अपकेंद्रित्र ट्यूब और अपकेंद्रित्र में सतह पर तैरनेवाला लीजिए। इस चरण में तीन से अधिक बार दोहराएँ।
  4. 15 मिनट के लिए 1350 XG पर अपकेंद्रित्र गैर parenchymal गोली कोशिकाओं। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और Kupffer सेल अलगाव माध्यम के 10 एमएल में गोली resuspend।
  5. 2.3 में वर्णित के रूप में असंतत आइसोटोनिक ढाल पर 25/50% गैर-parenchymal सेल समाधान जोड़ें। प्रतिशतत्वरण या तोड़ने के बिना 15 मिनट के लिए 850 XG पर rifuge।
  6. 25/50% एसआईपी इंटरफ़ेस करने के लिए करीब 25% एसआईपी अंश (चित्रा 3) के भीतर परेशान दिखाई दे रहा समृद्ध Kupffer सेल अंश स्थानीयकरण। एक 10 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट, महाप्राण समृद्ध Kupffer सेल अंश के बारे में 12 मिलीलीटर का उपयोग करना। Kupffer सेल अलगाव मीडियम की 35-40 मिलीग्राम से युक्त एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में कोशिकाओं स्थानांतरण। गोली कोशिकाओं के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 1350 XG पर धीरे और सेंट्रीफ्यूज मिलाएं।
  7. पूर्व गर्म Kupffer सेल संस्कृति के माध्यम से 5-10 मिलीलीटर में सतह पर तैरनेवाला और resuspend कोशिकाओं को त्यागें। कोशिकाओं (रुधिरकोशिकामापी) की गणना और trypan नीले रंग धुंधला का उपयोग व्यवहार्यता को मापने।
  8. अच्छी तरह / 5 x 10 5 कोशिकाओं के घनत्व पर 24 अच्छी तरह से प्लेट में शुद्ध गैर-parenchymal कोशिकाओं थाली। 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 (चित्रा 3) में कोशिकाओं को सेते हैं। 30 मिनट के बाद, धीरे से धो लें, मध्यम हटाने हांक संतुलित नमक समाधान (HbSS) एक बार फिर बदलने के पूर्व गर्मताजा और पूर्व गर्म Kupffer सेल संस्कृति माध्यम के 500 μl के साथ यह अच्छी तरह से (प्रति)।
  9. उन्हें उनके अनुयायी आकृति विज्ञान के अधिग्रहण की अनुमति देने के लिए, नैनोकणों के साथ इलाज से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 4 घंटे और 5% सीओ 2 के लिए Kupffer कोशिकाओं छोड़ दें।

4. विशेषता

  1. Kupffer कोशिकाओं पवित्रता
    1. Kupffer सेल व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए प्रयोग किया जाता ताजा पीबीएस / बीएसए समाधान तैयार है। पीबीएस / BSA समाधान के 500 μl के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें। पीबीएस / बीएसए समाधान निकालें और कोमल scraping का उपयोग कर नए सिरे से पीबीएस / BSA समाधान के 500 μl में Kupffer कोशिकाओं को अलग। कोशिकाओं 24 अच्छी तरह प्लेटों में चढ़ाया जाता है, तो आगे बढ़ने के लिए सेना की टुकड़ी आसान बनाने के लिए कैंची के साथ खुरचनी ब्लेड के extremities छोटा। ट्यूब प्रवाह cytometry में कोशिकाओं स्थानांतरण।
    2. एक रुधिरकोशिकामापी और सेंट्रीफ्यूज 1350 x जी पर 1 x 10 5 कोशिकाओं का उपयोग कर Kupffer कोशिकाओं की गणना। (स्वच्छ) F4 / 80 एंटीबॉडी के 30 μl में Resuspend Kupffer कोशिकाओं। अच्छी तरह मिक्स और 3 के लिए कमरे के तापमान पर सेते0 मिनट। बर्फ पर बेदाग कोशिकाओं (एंटीबॉडी के साथ incubated नहीं) रहते हैं।
    3. 5 मिनट के लिए 1,350 ग्राम पर, दाग कोशिकाओं में अपकेंद्रित्र पीबीएस / बीएसए समाधान के 2 मिलीलीटर जोड़ें और जिसके परिणामस्वरूप सतह पर तैरनेवाला त्यागें। पीबीएस / BSA के 200 μl में दाग कोशिकाओं Resuspend।
    4. प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए, गेट 10,000 उनके आकार (आगे तितर बितर) और विघटन (पक्ष स्कैटर) के अनुसार Kupffer कोशिकाओं बेदाग। फ्लोरिडा -1 चैनल में gated कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति का विश्लेषण करें।
    5. बेदाग Kupffer कोशिकाओं के प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए इस्तेमाल एक ही सेटिंग रखने के दाग Kupffer कोशिकाओं के लिए प्रक्रिया को दोहराएँ। का चयन करें और Kupffer सेल की शुद्धता का आकलन करने के लिए दाग कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति यों।
  2. Kupffer सेल phagocytic गतिविधि
    1. 0.5% के साथ मीडिया बदलें (वी / वी) Kupffer सेल संस्कृति माध्यम में फ्लोरोसेंट माला और 37 डिग्री सेल्सियस से कम 4 घंटे के लिए सेते और 5% सीओ 2।
    2. 1350 XG, डि पर गैर-भाँति मोती, अपकेंद्रित्र Kupffer कोशिकाओं को हटाने के आदेश में500 μl पीबीएस / BSA समाधान में सतह पर तैरनेवाला और resuspend कोशिकाओं scard। इस चरण 2 से अधिक बार दोहराएँ।
    3. ट्यूब cytometry के एक प्रवाह में पीबीएस / BSA समाधान और हस्तांतरण कोशिकाओं के 500 μl में परिमार्जन Kupffer कोशिकाओं।
    4. अपकेंद्रित्र Kupffer कोशिकाओं 1350 XG पर, पीबीएस / BSA समाधान के 200 μl में सतह पर तैरनेवाला और resuspend कोशिकाओं को त्यागें।
    5. प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए, गेट 10,000 उनके आकार (आगे तितर बितर) और विघटन (पक्ष स्कैटर) के अनुसार Kupffer कोशिकाओं बेदाग। फ्लोरिडा -2 चैनल में gated कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति का विश्लेषण करें।

(-CNTs च) और रासायनिक Functionalized कार्बन नैनोट्यूब का 5. ऊष्मायन

  1. उपयोग करने से पहले 15 मिनट के लिए sonication द्वारा पानी में -CNTs (1 मिलीग्राम / एमएल) के फैलाव तैयार करें। एफ -CNTs घर में 22 से तैयार कर रहे हैं।
  2. 2x केंद्रित एफ CNTs की तैयारी Kupffer सेल संस्कृति माध्यम में फैलाव। के लिए माध्यम में छितरी हुई Sonicate एफ CNTs2 मिनट) 5.3 कदम के साथ आगे बढ़ने से पहले।
  3. प्रत्येक के लिए अच्छी तरह, 2x -CNTs फैलाव के 250 μl के साथ पुराने मीडिया के 250 μl की जगह। इलाज कुओं (ताजा Kupffer सेल संस्कृति के माध्यम से वातानुकूलित माध्यम + 250 μl के 250 μl) और 10% DMSO के साथ इलाज कुओं क्रमशः, नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता है।
  4. 24 या 72 घंटे के लिए सीओ 2 37 डिग्री सेल्सियस पर Kupffer कोशिकाओं को सेते हैं और 5%।

संशोधित लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज (LDH) परख द्वारा Kupffer कोशिकाओं में -CNTs 6. विषाक्तता आकलन

  1. सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  2. Lysis बफर के (24 अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से) 200 μl जोड़ें और 30 मिनट-1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  3. 10 मिनट कोशिकाओं और सेल मलबे द्वारा लिया गया है कि एफ -CNTs गोली के लिए जोरदार pipetting के बाहर ले जाने के बाद, 40,000 XG पर microcentrifuge ट्यूब और अपकेंद्रित्र में Kupffer कोशिकाओं lysed लीजिए।
  4. Supernatants (ƒ-CNT के नि: शुल्क) में लीजिएmicrocentrifuge ट्यूब और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर या) 6.5 कदम आगे बढ़ना।
  5. एक 96 अच्छी तरह से थाली में स्थानांतरण 50 μl और अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए सब्सट्रेट मिश्रण समाधान (LDH से किट) के एक बराबर मात्रा में जोड़ें। प्लेट कवर और बंद समाधान (LDH से किट) के 50 μl जोड़ने से पहले 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं। Lysis बफर के 50 μl, सब्सट्रेट मिश्रण समाधान के 50 μl और स्थान पर समाधान के 50 μl युक्त खाली कुओं की triplicates जोड़ें।
  6. एक microplate रीडर में 490 एनएम पर absorbance पढ़ें और (%) सेल व्यवहार्यता की गणना करने के लिए निम्न सूत्र का उपयोग करें।

1 समीकरण

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Representative Results

गैर शुद्ध parenchymal कोशिकाओं की संख्या में लगातार था और (17 isolations प्रदर्शन किया गया) माउस प्रति 6 से 10 के बीच 8 और 14 एक्स कोशिकाओं बताया गया। प्रत्येक माउस अलगाव 16-28 कुओं थाली करने के लिए पर्याप्त था। Trypan नीले रंग धुंधला द्वारा सेल व्यवहार्यता सेल व्यवहार्यता ~ 95% से पता चला है। Kupffer कोशिकाओं को उनके अधूरे पक्षपाती आकृति विज्ञान (चित्रा -4 ए) से संबंधित, 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन के 30 मिनट के भीतर एक गोल आकार दिखाया। 4 घंटे ऊष्मायन की और बाद में, कोशिकाओं में फैला है और सेल समूहों के गठन करने के लिए शुरू किए गए।

Kupffer कोशिकाओं तो उनकी शुद्धता और phagocytic गतिविधि पुष्टि करने के लिए विशेषता थे। प्रकोष्ठों Kupffer सेल शुद्धता का प्रदर्शन करने के लिए F4 / 80 एंटीबॉडी के साथ दाग रहे थे। प्रवाह cytometry विश्लेषण के 95% (4B चित्रा) से ऊपर Kupffer सेल शुद्धता दिखाया। प्रकोष्ठों बड़े कण को ​​लेने के लिए उनकी क्षमता की पुष्टि करने के लिए 1 माइक्रोन फ्लोरोसेंट मोती, चढ़ाना के बाद 12 घंटा, साथ incubated रहे थे। था दिखाया प्रवाह cytometry विश्लेषणटी Kupffer कोशिकाओं के 85% से अधिक 1 माइक्रोन मोती (चित्रा 4C) तक लग सकते हैं, यानी phagocytic हैं। संस्कृति के 72 घंटे के बाद, Kupffer कोशिकाओं के 40% Kupffer कोशिकाओं आंशिक रूप से उनके phagocytic गतिविधि खो दिया है, यह दर्शाता है phagocytic थे।

24 और 72 घंटे के लिए एफ -CNTs के साथ incubated Kupffer कोशिकाओं के माइक्रोस्कोपी इमेजिंग भोले कोशिकाओं (चित्रा 5 ए) की तुलना में इसी तरह के सेल आकृति विज्ञान का पता चला। 10% DMSO के सकारात्मक (नियंत्रण) के साथ incubated Kupffer कोशिकाओं परिगलित आकृति विज्ञान (चित्रा 5 ए) का प्रदर्शन किया। संशोधित LDH से परख के विश्लेषण के बाद, Kupffer कोशिकाओं 24 के लिए 10% DMSO के सकारात्मक (नियंत्रण) के साथ इलाज किया और 72 घंटा उच्च विषाक्तता (चित्रा 5 ब) दिखाया। इसकी तुलना में, एफ -CNTs कोशिकाओं 72 घंटा (चित्रा 5 ब) के लिए 50 माइक्रोग्राम / एमएल में अवगत कराया गया है केवल जब सेल व्यवहार्यता में मामूली लेकिन महत्वपूर्ण कमी प्रेरित किया।

चित्रा 4
चित्रा 4: Kupffer कोशिकाओं की पवित्रता और तेज क्षमताओं (ए) 30 मिनट या 5% सीओ 2 के माहौल के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के बाद चढ़ाया Kupffer कोशिकाओं के सूक्ष्म छवियों।। पैमाने बार 50 माइक्रोन प्रस्तुत करता है। (बी) Kupffer कोशिकाओं के प्रवाह cytometry विश्लेषण एफएससी / एसएससी सेल gating के निम्न बाहर किया गया था। Kupffer सेल शुद्धता F4 / 80 एंटीबॉडी धुंधला का उपयोग निर्धारित किया है और 95% से ऊपर होने के लिए दिखाया गया था। (सी) Kupffer कोशिकाओं को उनके phagocytic गतिविधि का आकलन करने के लिए 1 माइक्रोन फ्लोरोसेंट मोतियों की उपस्थिति में 4 घंटे के लिए incubated रहे थे। Kupffer के कार्यात्मक संपत्तियों हौसले से 3 दिनों के बाद जांच की कोशिकाओं की तुलना में (12 घंटा चढ़ाना के बाद) अलग कक्षों में बेहतर बनाए रखा गया।

चित्रा 5
चित्रा 5: तेज और की विषाक्तता <Kupffer कोशिकाओं में उन्हें> एफ CNTs। (ए) Kupffer कोशिकाओं के माइक्रोस्कोपी छवियों। छवियाँ 24 और 72 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर -CNTs का 10% DMSO और 50 माइक्रोग्राम / एमएल के साथ इलाज किया Kupffer कोशिकाओं दिखा। पैमाने बार 50 माइक्रोन प्रस्तुत करता है। (बी) के संशोधित LDH से परख। कम सेल व्यवहार्यता -CNTs काफी केवल 72 घंटे के लिए 50 माइक्रोग्राम / एमएल प्रदर्शनी के बाद सेल व्यवहार्यता प्रभावित है, जबकि 10% DMSO के इलाज कोशिकाओं (सकारात्मक नियंत्रण) में देखा गया था। * पी <Tukey परीक्षण द्वारा पोस्ट हॉक विश्लेषण के साथ विचरण (एक तरह से एनोवा) का विश्लेषण का उपयोग कर भोले हालत (10% DMSO के हालत को छोड़कर) के लिए 0.05 रिश्तेदार। पैमाने बार 50 माइक्रोन से मेल खाती है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

निम्न चरणों के उच्च उपज और Kupffer कोशिकाओं के उच्च व्यवहार्यता को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। सड़न रोकनेवाला शर्तों बैक्टीरियल और फंगल संक्रमण के जोखिम को सीमित करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। सभी उपकरणों का उपयोग करने से पहले निष्फल करने की आवश्यकता है। अभिकर्मकों हौसले से अलगाव की प्रक्रिया से बाहर ले जाने से पहले तैयार किया जाना चाहिए।

collagenase चतुर्थ की पसंद, कम tryptic गतिविधि के साथ, महत्वपूर्ण है। एक ही आपूर्तिकर्ता से अलग बहुत से अलग enzymatic गतिविधि है और वे Kupffer सेल अलगाव के लिए सबसे उपयुक्त बैच का चयन करने के लिए शुरू में तुलना करने की जरूरत पड़ सकती है। यह सेल उपज और सेल व्यवहार्यता का आकलन करने से आंका जा सकता है। यह भी इसी तरह के अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया गया है कि बैचों प्रदान करने के लिए आपूर्तिकर्ता से संपर्क करने की सिफारिश की है। एक बार इस्तेमाल किया, भविष्य में उपयोग के लिए इसे आरक्षित किए जाने की बैच पर फैसला किया।

केन्युलेशन प्रक्रिया प्रशिक्षण की आवश्यकता है। पोर्टल शिरा के साथ विश्वास बनने के लिए कई जानवरों के इस्तेमाल की योजनाकेन्युलेशन प्रक्रिया। अभ्यास के साथ, सफल केन्युलेशन आसानी से हासिल हो जाएगा और प्रक्रिया के एक व्यक्ति द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है। भारी जानवरों के इस्तेमाल पोर्टल शिरा के व्यास बढ़ जाती है और इसलिए प्रक्रिया की सुविधा है कि ध्यान दें। पोर्टल शिरा के पीछे की दीवार छेदा जाता है, यह आप इस प्रक्रिया के साथ नए हैं, खासकर अगर फिर से नस का उपयोग करने के लिए तकनीकी रूप से कठिन है और इसलिए, यह एक नया जानवर के साथ शुरू करने के लिए बेहतर है।

HBSS और Collagenase समाधान उनकी 7.4 पीएच को समायोजित किया है और 37 डिग्री सेल्सियस के क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप से एक उत्पादन तापमान को प्राप्त करने के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व गरम हो जाना चाहिए था। EGTA / HBSS समाधान के साथ छिड़काव (सीए 2 + और ​​2 मिलीग्राम + मुक्त) युक्त EGTA सेल सेल बातचीत कमजोर, सीए 2 + निर्भर आसंजन अणुओं का नाम desmosome के विघटन के लिए आवश्यक है। Collagenase प्रकार चतुर्थ बाह्य मैट्रिक्स से जिगर की कोशिकाओं को अलग है और इसलिए जिगर का नेतृत्व करने के लिए किया जाता हैसेल हदबंदी। दो समाधान के लिए छिड़काव समय, CD1 चूहों लेकिन इस तरह के C57BL / 6 के रूप में अन्य उपभेदों के लिए 15 मिनट से अधिक अब थोड़ा जिगर पाचन समय की आवश्यकता नहीं होनी चाहिए।

एक सफल अलगाव को प्राप्त करने के लिए, यह उच्च सेल उपज और व्यवहार्यता प्राप्त करने के लिए आवश्यक है। प्रयोगकर्ता जिगर सेल अलगाव में कोई अनुभव नहीं है, यह trypan नीले बहिष्कार परख द्वारा कोशिकाओं को 50 XG पर पहले 3 centrifugations से hepatocytes छर्रों गठबंधन और गिनती की सलाह दी है। hepatocyte उपज> 20 x 10 6 कोशिकाओं और hepatocyte व्यवहार्यता> 50% होना चाहिए। कम पैदावार Kupffer सेल उपज कम करने के लिए परोक्ष रूप से अग्रणी गरीब सेल हदबंदी से अनिवार्य रूप से परिणाम। यह यकृत ठीक से छिड़काव कदम के अंत में पच जाता है कि इस बात की पुष्टि की जानी चाहिए। उपयुक्त hepatocyte उपज कम hepatocyte व्यवहार्यता के साथ संयोजन में हासिल की है, जब यह एक अत्यधिक collagenase पाचन से परिणाम कर सकते हैं, लेकिन और अधिक होने की संभावना एक अनुचित जिगर द्वारा समझाया गया हैछिड़काव प्रक्रिया या एक दूषित अभिकर्मक / सामग्री का उपयोग करें।

चढ़ाना के बाद, Kupffer कोशिकाओं के प्रति संवेदनशील हैं और धीरे से धोया जाना चाहिए। कम से कम 4 घंटे उनके अनुयायी आकृति विज्ञान के अधिग्रहण की Kupffer कोशिकाओं के लिए आवश्यक हैं। Kupffer कोशिकाओं चढ़ाना के बाद 1 दिन के भीतर उनकी अधिकतम phagocytic गतिविधि दिखाने के रूप में इलाज आम तौर पर, चढ़ाना के बाद 4-24 घंटा बाहर किया जाता है।

हमारे प्रोटोकॉल में, हम आसंजन द्वारा घनत्व ढाल centrifugation और चयन से Kupffer कोशिकाओं की शुद्धि के बाद CD1 माउस जिगर की कोशिकाओं की हदबंदी का वर्णन है। Kupffer कोशिकाओं के लक्षण, प्रवाह cytometry द्वारा, Kupffer कोशिकाओं की उच्च उपज और पवित्रता के लिए इस विधि का प्रयोग कर प्राप्त किया जा सकता है कि यह दर्शाता है।

इस Kupffer सेल अलगाव विधि जटिलता और सेल उपज के बीच एक मूल्यवान समझौता का प्रतिनिधित्व करता है। हालांकि, यह निश्चित Kupffer सेल के तरीकों में इस तरह से वर्णित प्रोटोकॉल के रूप में, आचरण करने के लिए आसान हो सकता है कि सूचना दी हैवू एट अल।, जिगर पूर्व vivo 23 से पच जाता है। हालांकि, वू एट अल द्वारा वर्णित विधि। एक कोशिकाओं की सीमित मात्रा में और कम सेल शुद्धता की ओर जाता है। उच्च उपज और पवित्रता प्राप्त की है, लेकिन आवश्यकता होती है महंगा और / या अत्याधुनिक उपकरण और समय लग सकता है किया जा सकता है।

Smedsrød एट अल। 16 द्वारा विकसित मूल प्रोटोकॉल Percoll ढाल और सतह आसंजन द्वारा आगे की शुद्धि के लिए कम Percoll तकिया के चयन पर centrifugation द्वारा पीछा 2-कदम छिड़काव विधि (HbSS + collagenase पाचन) के आधार पर एक तुलनीय प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया। Centrifugation प्रक्रिया को संशोधित करने और ऊपरी Percoll तकिया इकट्ठा करके, हम जिगर के प्रति ग्राम 8.2 x 10 6 कोशिकाओं को 5.25 एक्स 10 6 से समृद्ध Kupffer सेल अंश में वृद्धि हुई। इस सुधार जिगर की कोशिकाओं की हदबंदी को सुविधाजनक बनाने के क्रम में जल्दी छिड़काव चरण के दौरान EGTA के उपयोग के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। एमoreover, प्रवाह cytometry विश्लेषण के उपयोग Kupffer सेल शुद्धता और phagocytic गतिविधि के विश्वसनीय मात्रात्मक लक्षण वर्णन की अनुमति दी। माउस जिगर प्रति 14 एक्स 10 6 शुद्ध गैर parenchymal कोशिकाओं की एक अधिकतम उपज के साथ। वर्तमान अलगाव विधि साहित्य 24 में सूचित किया गया है क्या करने के लिए माउस जिगर प्रति Kupffer कोशिकाओं की उच्च राशि प्राप्त करने के। इस सुधार अन्य तरीकों 24 की तुलना में भारी माउस (35-45 ग्राम) के उपयोग के द्वारा समझाया जा सकता है। सेल उपज में इस वृद्धि के अलावा, बड़े जानवरों के उपयोग उल्लेखनीय पोर्टल शिरा केन्युलेशन की प्रक्रिया की सुविधा।

इन विट्रो परीक्षण में उच्च throughput इसलिए नैनोकणों के vivo विषाक्तता प्रभाव नकल उतार, इस प्राथमिक phagocytic मॉडल का उपयोग किया जा सकता है। Nanotoxicology के समग्र समझ नैदानिक ​​अनुवाद के लिए nanoparticle के चयन और अधिक कुशल बनाने, इस तरह के मॉडल से फायदा हो सकता है। इसके अलावा, यह साथ कतार में हैपशु जैव चिकित्सा अनुसंधान में 3 आर (कमी, शोधन और प्रतिस्थापन) की अवधारणा को लागू करने।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Euthatal (pentobarbital sodium) Merial
CD1 mice Charles River   - Mouse weight should vary from 35 to 45 g. We advise the use of male CD1 mice as their weight increase rapidly (e.g. a male CD1 mouse of 7 weeks old exceeds 35 g in weight). It is also advised to contact the animal supplier in advance to arrange for the delivery of older animals. Alternatively animals can be in-house to reach the desired weight. 
HBSS (Ca2+ and Mg2+ free, with bicarbonate)   Life Technologies   14175-053 HBSS must be  Ca2+ free. 
Ethylene Glycol Tetraacetic Acid (EGTA) tetrasodium salt  Sigma-Aldrich   E8145   EDTA can also be used but EGTA has the advantage of chelating Ca2+ selectively. 
HEPES (1 M)  Life Technologies   15630-056  100 ml 
Collagenase type IV  Worthington  CSL-4  It is advised to test different batches of collagenase or at least mention to the supplier the product has to be suitable for liver cell isolation 
 Low glucose DMEM  Sigma-Aldrich   D5523  500 ml 
RPMI (with sodium pyruvate and Glutamax)  Life Technologies   12633-012  500 ml
Penicillin/Steptomycin  Life Technologies   15140-122 100 ml
Fetal Bovine Serum  First-Link   60-00-850  500 ml 
Trypan blue solution  Sigma-Aldrich  T8154  100 ml 
Coated silica particle solution (Percoll) GE Healtcare   17-0891-02  Percoll® is very stable and can be kept for several years 
1x Phosphate Buffered Saline   Life Technologies   10010-023 500 ml 
10x Phosphate Buffered Saline   Life Technologies   70011-036 500 ml
Dimethyl sulfoxide  Fisher  D/4120/PB08  500 ml 
LDH kit (CytoTox 96)  Promega  G1781  Keep protected from light 
DMEM phenol red free Life Technologies   31053-028  500 ml 
F4/80 antibody (Alexa 488) AbD Serotec MCA497A488 Do not dilute, used neat for flow cytometry
Fluorescent beads Sigma L2778 Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red. 1 ml
Name of the Material Company  Catalog number  Comments/Description 
Butterfly blood collection set (23 G/305 mm long tubing)   BD  367288
Syringe Filters (0.22 μm Blue Rim)  Minisart  16534-K 
Centrifuge Tubes (50 ml Blue Cap)  BD Biosciences, Falcon  35 2070 
Petri dish (90 x 15 mm)  Thermo Fisher Scientific   BSN 101VR20 
100 μm cell strainer   BD   352360
Peristaltic pump  Watson Marlow  SciQ 300   Rinse tubing before and after each usage with sterile PBS and 70% ethanol.
24-well plates Corning   3526
96-well plates  Corning   3595
Centrifuge  Eppendorf 5810R
Plate reader BMG Labtech FLUOstar Omega
Serrefine forceps Hammacher GmbH  Art. Nr. HSE 004-35 / Cat. Nr. 221-0051 The serrefine forceps allow to clamp the vessel cannulated with the 23 G needle without the need of holding the forceps during the perfusion procedure. URL: (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html) 
Flow cytometry tubes BD Biosciences, Falcon  352052
Microcentrifuge tubes (1.5 ml) Elkay   000-MICR-150
Cell scraper BD Biosciences, Falcon 353086 Cut blade extremities with a pair of scissors to scrape cells in 24-well plates.
Name of the Reagent Company  Catalog number  Comments/Description 
 EGTA (Ethylene Glycol Tetraacetic Acid)/HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) Solution  HBSS containing 0.5 mM EGTA and 25 mM HEPES. Adjust pH to 7.4. Prepare 50 ml for each liver to perfuse.  
Collagenase Solution  DMEM low glucose containing collagenase type IV at 100 UI/ml, 15 mM HEPES and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Adjust pH to 7.4. Prepare 100 ml for each liver to perfuse. After adding the collagenase, it is advised to warm up the solution for 30 min before use. This allows the collagenase activity to be optimum. 
Kupffer Cell Isolation Medium  RPMI containing, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% glutamax® (v/v) and 1% Penicllin/Streptomycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers.  
Kupffer Cell Culture Medium  RPMI containing 10% Fetal Bovine Serum, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% Glutamax® (v/v) and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers.  
SIP (solution of isotonic coated silica particles) Mix 1.7 ml of 10x Phosphate Buffered Saline  with 15.3 ml of Percoll® to obtain 17mL of SIP.
25% SIP solution  Mix 5 ml of SIP with 15 ml of 1x Phosphate Buffered Saline  
50% SIP solution  Mix 10 ml of SIP with 10 ml of 1x Phosphate Buffered Saline 
Lysis Buffer DMEM media with 0.9% Triton X-100
PBS/BSA Solution Prepare fresh Phosphate Buffered Saline pH 7.4 with 1% Bovine Serum Albumin. 

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References

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Nanoparticle विषाक्तता परीक्षण के लिए Kupffer सेल अलगाव
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Bourgognon, M., Klippstein, R., Al-Jamal, K. T. Kupffer Cell Isolation for Nanoparticle Toxicity Testing. J. Vis. Exp. (102), e52989, doi:10.3791/52989 (2015).More

Bourgognon, M., Klippstein, R., Al-Jamal, K. T. Kupffer Cell Isolation for Nanoparticle Toxicity Testing. J. Vis. Exp. (102), e52989, doi:10.3791/52989 (2015).

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