Nanoparticle विषाक्तता परीक्षण के लिए Kupffer सेल अलगाव
Summary
Liver macrophages, named Kupffer cells, are responsible for the capture of circulating nanoparticles. We describe here a method, of high cell purity and yield, for Kupffer cell isolation. The modified LDH assay is used here to measure the toxicity induced by carbon nanotubes in Kupffer cells.
Abstract
इन विट्रो nanotoxicological पढ़ाई की बड़ी संख्या को उनकी व्यावहारिकता के लिए अमर सेल लाइनों का इस्तेमाल किया है। हालांकि, अमर सेल लाइनों या प्राथमिक कोशिकाओं में nanoparticle विषाक्तता परीक्षण से परिणाम के लिए इन विट्रो assays के लिए प्राथमिक कोशिकाओं के उपयोग का विस्तार करने की आवश्यकता पर प्रकाश डाला, विसंगतियों से पता चला है। इस प्रोटोकॉल माउस जिगर मैक्रोफेज के अलगाव का नाम Kupffer कोशिकाओं, और nanoparticle विषाक्तता अध्ययन करने के लिए उनके उपयोग का वर्णन करता है। Kupffer कोशिकाओं को शरीर में सबसे प्रचुर मात्रा में बृहतभक्षककोशिका आबादी रहे हैं और नैनोकणों परिसंचारी के कब्जा करने के लिए जिम्मेदार reticulo-एन्दोथेलिअल प्रणाली (आरईएस) का हिस्सा बनता है। यहां बताया Kupffer सेल अलगाव विधि घनत्व ढाल पर शुद्धि के बाद एक 2-कदम छिड़काव पद्धति पर आधारित है। collagenase पाचन और घनत्व centrifugation के आधार पर विधि, Smedsrød एट अल द्वारा विकसित मूल प्रोटोकॉल से अनुकूलित है। चूहा जिगर सेल isolatio के लिए बनाया गयाn और उच्च उपज प्रदान करता है और Kupffer कोशिकाओं के उच्च शुद्धता (> 95%) (14 एक्स 10 6 माउस प्रति कोशिकाओं तक)। इस अलगाव विधि परिष्कृत या महंगे उपकरण की आवश्यकता होती है और इसलिए जटिलता और सेल उपज के बीच एक आदर्श समझौता का प्रतिनिधित्व नहीं करता है। भारी चूहों (35-45 ग्राम) का उपयोग अलगाव विधि की उपज में सुधार, लेकिन यह भी उल्लेखनीय पोर्टल शिरा केन्युलेशन की प्रक्रिया की सुविधा। -CNTs च Functionalized कार्बन नैनोट्यूब की विषाक्तता संशोधित LDH से परख द्वारा इस मॉडल में मापा गया था। इस विधि च -CNTs साथ ऊष्मायन के बाद Kupffer कोशिका झिल्ली के संरचनात्मक अखंडता की कमी को मापने के द्वारा सेल व्यवहार्यता का आकलन है। एफ -CNTs द्वारा प्रेरित विषाक्तता पृथक Kupffer कोशिकाओं nanoparticle विषाक्तता परीक्षण के लिए उपयोगी होते हैं पर प्रकाश डाला, इस परख का उपयोग लगातार मापा जा सकता है। Nanotoxicology के समग्र समझ नैदानिक अनुवाद अधिक effi के लिए nanoparticle चयन कर रही है, इस तरह के मॉडल से फायदा हो सकता हैcient।
Introduction
Nanotoxicology अनुसंधान के क्षेत्र नैनोकणों के जैविक प्रभाव चिह्नित करने के लिए करना है। इन विवो जांच के आधार पर विषाक्तता अध्ययन के लिए सबसे सही तरीकों के रहते हैं। हालांकि, उनके उपयोग उनकी लागत, श्रम और समय की आवश्यकताओं 1 द्वारा सीमित है। विकल्प, इन विट्रो assays क्योंकि उनकी सादगी और इन विट्रो परीक्षण प्लेटफार्मों 2 में उच्च throughput के विकास की संभावना का इस्तेमाल किया गया है के रूप में – तो जांच की शर्तों की संख्या में विस्तार। अधिकांश nanotoxicological पढ़ाई अमर सेल लाइनों के साथ इन विट्रो assays में उपयोग करते हुए प्रदर्शन कर रहे हैं। हालांकि, इन विवो विषाक्तता प्रभाव 3 करने के लिए इन प्रयोगात्मक निष्कर्ष के निष्कर्षों के बारे में चिंता कर रहे हैं। दरअसल, अमर सेल लाइनों के गुणों को वे से प्राप्त किए गए ऊतकों, जैसे आनुवंशिक परिवर्तन 4, कुंजी रूपात्मक सुविधाओं की गिरावट से काफी अलग हो सकता है5, सेलुलर polarity के 6 और इस तरह के भड़काऊ मध्यस्थों 7 के नियमन के रूप में कार्य परिवर्तन का नुकसान।
Kupffer कोशिकाओं को शरीर में सबसे प्रचुर मात्रा में बृहतभक्षककोशिका आबादी होते हैं और जिगर sinusoids की दीवार अस्तर द्वारा रक्त के साथ संपर्क में सीधे हैं। Reticulo-एन्दोथेलिअल प्रणाली (आरईएस) के हिस्से के रूप में, इन मैक्रोफेज नैनोकणों परिसंचारी और इसलिए का कब्जा के लिए जिम्मेदार हैं, nanoparticle विषाक्तता अध्ययन करने के लिए एक अत्यधिक उपयुक्त मॉडल का गठन। में vivo 8 और इन विट्रो में नैनोकणों के संपर्क में Kupffer कोशिकाओं के साथ जुड़े भड़काऊ प्रतिक्रियाओं के 9 पढ़ाई कहीं और प्रकाशित किया गया है। Kupffer कोशिकाओं को भी इस तरह के मादक जिगर की बीमारी के 10, जिगर फाइब्रोसिस 11 या वायरल हैपेटाइटिस के रूप में 12 यकृत रोग के रोगजनन में शामिल किया गया है। यह अलग Kupffer कोशिकाओं सेलुलर तंत्र निवेश संबंधी निर्णय का वर्णन करने के लिए उपयोगी अंतर्दृष्टि प्रदान की सूचना मिली थीजिगर व्यवधान 13,14 में olved।
कई तरीकों को अलग करने और Kupffer कोशिकाओं को शुद्ध करने के लिए सूचित किया गया है। सेल अलगाव यांत्रिक या एंजाइमी हदबंदी 15 से परिणाम कर सकते हैं। Collagenase पाचन उच्च Kupffer सेल उपज 16 के लिए अग्रणी है, जबकि Kupffer कोशिकाओं के कार्यात्मक अखंडता के संरक्षण का लाभ दर्शाता है। जटिलता और लागत में अलग-अलग कई प्रयोगात्मक दृष्टिकोण, अन्य जिगर सेल आबादी से Kupffer कोशिकाओं को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। उदाहरण के लिए, Kupffer सेल शुद्धता immunoaffinity 17, प्रवाह वैद्युतकणसंचलन 18, चयनात्मक आसंजन 16 द्वारा या उनके आकार और घनत्व के अनुसार कक्षों का चयन करें जो केन्द्रापसारक तकनीक 16 के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। इन तरीकों का एक संयोजन आबादी 16 वर्ष की शुद्धता को बढ़ाने के लिए चुना जा सकता है। यह ज्यादातर आवेदन और उपलब्ध equipmen पर निर्भर करता है के रूप में Kupffer सेल अलगाव के लिए आदर्श विधि के बारे में कोई आम सहमति नहीं है,टी। हालांकि, nanoparticle विषाक्तता परीक्षण के मामले में, सादगी और Kupffer कोशिकाओं के कार्यात्मक संरक्षण के साथ जुड़े तकनीक के उच्च उपज इस आवेदन के लिए सबसे उपयुक्त हो दिखाई दिया।
यहां बताया Kupffer सेल अलगाव विधि घनत्व ढाल पर शुद्धि के बाद एक 2-कदम छिड़काव पद्धति पर आधारित है। विधि Smedsrød एट अल द्वारा विकसित मूल प्रोटोकॉल से संशोधित किया गया था। 16 चूहा जिगर सेल अलगाव के लिए बनाया गया है। अधिकांश अध्ययन की सूचना दी और चूहे यकृत से Kupffer कोशिकाओं के अलगाव का वर्णन किया। इस के साथ साथ, हम एक उच्च उपज और पवित्रता पर, माउस जिगर से Kupffer कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक विधि का वर्णन। चूहों का उपयोग प्रयोग लागत कम कर देता है और कई यकृत के प्रसंस्करण nanoparticle विषाक्तता परीक्षण के लिए Kupffer कोशिकाओं की बड़ी मात्रा में प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है।
निम्नलिखित प्रोटोकॉल में, Kupffer कोशिकाओं (च Functionalized कार्बन नैनोट्यूब के साथ incubated रहे थे </उन्हें> -CNTs)। CNTs की अद्वितीय भौतिक-रासायनिक गुणों – चिकित्सा और निदान के प्रयोजनों के लिए वैक्टर के रूप में CNTs दिलचस्प उम्मीदवारों बना दिया है, व्यास अनुपात और बड़े सतह क्षेत्र के लिए उच्च लंबाई अर्थात्। हालांकि, चिंता CNTs 19 की विषाक्तता, और इन विट्रो परीक्षणों में नए के विकास CNT के जैविक प्रभाव की समझ बढ़ाने के उद्देश्य के बारे में उठाया गया है। Kupffer सेल में विषाक्तता कोशिका झिल्ली के संरचनात्मक अखंडता की कमी के साथ जुड़ा हुआ है। इस सतह पर तैरनेवाला में सेल से cytoplasmic एंजाइम LDH के नुकसान से मापा जाता है। इस विधि का सिद्धांत है, इसलिए कोई भी जारी किया LDH से हटाने और कोशिकाओं को 20 में छोड़ दिया है क्या उपाय है। सतह पर तैरनेवाला में CNTs की उपस्थिति परख 21 के साथ हस्तक्षेप क्योंकि इस सतह पर तैरनेवाला में जारी LDH से मापने के लिए पसंद किया जाता है।
हम इस सरल और लागत प्रभावी Kupffer सेल अलगाव metho के उपयोग का प्रस्तावडी कार्यात्मक Kupffer कोशिकाओं की उच्च संख्या अलग करने के लिए। यह एक प्रासंगिक प्राथमिक बृहतभक्षककोशिका मॉडल में, नैनोकणों की एक श्रृंखला की विषाक्तता की स्क्रीनिंग की अनुमति देता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
निम्न चरणों के उच्च उपज और Kupffer कोशिकाओं के उच्च व्यवहार्यता को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। सड़न रोकनेवाला शर्तों बैक्टीरियल और फंगल संक्रमण के जोखिम को सीमित करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चा…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by EU FP7-ITN Marie-Curie Network program RADDEL. MB and KAJ would like to acknowledge Joe Varguese and Rui Serra Maia for their help and suggestions along the optimization of the Kupffer cell isolation.
Materials
| Euthatal (pentobarbital sodium) | Merial | ||
| CD1 mice | Charles River | – | Mouse weight should vary from 35 to 45 g. We advise the use of male CD1 mice as their weight increase rapidly (e.g. a male CD1 mouse of 7 weeks old exceeds 35 g in weight). It is also advised to contact the animal supplier in advance to arrange for the delivery of older animals. Alternatively animals can be in-house to reach the desired weight. |
| HBSS (Ca2+ and Mg2+ free, with bicarbonate) | Life Technologies | 14175-053 | HBSS must be Ca2+ free. |
| Ethylene Glycol Tetraacetic Acid (EGTA) tetrasodium salt | Sigma-Aldrich | E8145 | EDTA can also be used but EGTA has the advantage of chelating Ca2+ selectively. |
| HEPES (1M) | Life Technologies | 15630-056 | 100 ml |
| Collagenase type IV | Worthington | CSL-4 | It is advised to test different batches of collagenase or at least mention to the supplier the product has to be suitable for liver cell isolation |
| Low glucose DMEM | Sigma-Aldrich | D5523 | 500 ml |
| RPMI (with sodium pyruvate and Glutamax®) | Life Technologies | 12633-012 | 500 ml |
| Penicillin/Steptomycin | Life Technologies | 15140-122 | 100 ml |
| Fetal Bovine Serum | First-Link | 60-00-850 | 500 ml |
| Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | 100 ml |
| Coated silica particle solution (Percoll®) | GE Healtcare | 17-0891-02 | Percoll® is very stable and can be kept for several years |
| 1x Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010-023 | 500 ml |
| 10x Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 70011-036 | 500 ml |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher | D/4120/PB08 | 500 ml |
| LDH kit (CytoTox 96®) | Promega | G1781 | Keep protected from light |
| DMEM phenol red free | Life Technologies | 31053-028 | 500 ml |
| F4/80 antibody (Alexa 488) | AbD Serotec | MCA497A488 | Do not dilute, used neat for flow cytometry |
| Fluorescent beads | Sigma | L2778 | Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red. 1 ml |
| Name of the Material | Company | Catalog number | Comments/Description |
| Butterfly blood collection set (23G/305mm long tubing) | BD | 367288 | |
| Syringe Filters (0.22 μm Blue Rim) | Minisart | 16534-K | |
| Centrifuge Tubes (50 ml Blue Cap) | BD Biosciences, Falcon | 35 2070 | |
| Petri dish (90 x 15 mm) | Thermo Fisher Scientific | BSN 101VR20 | |
| 100 μm cell strainer | BD | 352360 | |
| Peristaltic pump | Watson Marlow | SciQ 300 | Rinse tubing before and after each usage with sterile PBS and 70% ethanol. |
| 24-well plates | Corning | 3526 | |
| 96-well plates | Corning | 3595 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Plate reader | BMG Labtech | FLUOstar Omega | |
| Serrefine forceps | Hammacher GmbH | Art. Nr. HSE 004-35 / Cat. Nr. 221-0051 | The serrefine forceps allow to clamp the vessel cannulated with the 23G needle without the need of holding the forceps during the perfusion procedure. URL: (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html) |
| Flow cytometry tubes | BD Biosciences, Falcon | 352052 | |
| Microcentrifuge tubes (1.5 ml) | Elkay | 000-MICR-150 | |
| Cell scraper | BD Biosciences, Falcon | 353086 | Cut blade extremities with a pair of scissors to scrape cells in 24-well plates. |
| Name of the Reagent | Company | Catalog number | Comments/Description |
| EGTA (Ethylene Glycol Tetraacetic Acid)/HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) Solution | HBSS containing 0.5 mM EGTA and 25 mM HEPES. Adjust pH to 7.4. Prepare 50 ml for each liver to perfuse. | ||
| Collagenase Solution | DMEM low glucose containing collagenase type IV at 100 UI/ml, 15 mM HEPES and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Adjust pH to 7.4. Prepare 100 ml for each liver to perfuse. After adding the collagenase, it is advised to warm up the solution for 30 min before use. This allows the collagenase activity to be optimum. | ||
| Kupffer Cell Isolation Medium | RPMI containing, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% glutamax® (v/v) and 1% Penicllin/Streptomycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers. | ||
| Kupffer Cell Culture Medium | RPMI containing 10% Fetal Bovine Serum, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% Glutamax® (v/v) and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers. | ||
| SIP (solution of isotonic coated silica particles) | Mix 1.7 ml of 10x Phosphate Buffered Saline with 15.3 ml of Percoll® to obtain 17mL of SIP. | ||
| 25% SIP solution | Mix 5 ml of SIP with 15 ml of 1x Phosphate Buffered Saline | ||
| 50% SIP solution | Mix 10 ml of SIP with 10 ml of 1x Phosphate Buffered Saline | ||
| Lysis Buffer | DMEM media with 0.9% Triton X-100 | ||
| PBS/BSA Solution | Prepare fresh Phosphate Buffered Saline pH 7.4 with 1% Bovine Serum Albumin. | ||
References
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