Liver macrophages, named Kupffer cells, are responsible for the capture of circulating nanoparticles. We describe here a method, of high cell purity and yield, for Kupffer cell isolation. The modified LDH assay is used here to measure the toxicity induced by carbon nanotubes in Kupffer cells.
Большинство в пробирке nanotoxicological исследований использовали увековечены клеточных линий для их практичности. Тем не менее, результаты испытаний на токсичность наночастиц в бессмертных клеточных линий или первичных клеток показали расхождения, подчеркнув необходимость расширить использование первичных клеток для анализов в пробирке. Этот протокол описывает выделение макрофагами печени мышей, названные клетки Купфера, и их использование для изучения наночастиц токсичности. Купфер клетки наиболее распространенным населения макрофагов в организме и составляют часть ретикуло-эндотелиальной системы (РЭС), ответственного за захват циркулирующих наночастиц. Способ изоляции клеток Купфера сообщалось здесь, основан на методе 2-ступенчатой перфузии с последующей очисткой по градиенту плотности. Метод, основанный на коллагеназы пищеварения и центрифугирования в градиенте плотности, приспособлен от оригинального протокола, разработанного Smedsrød др. предназначен для крыс isolatio клеток печенин и обеспечивает высокий выход (до 14 × 10 6 клеток на мышь) и высокой чистоты (> 95%) в клетках Купфера. Этот метод изоляции не требует сложного или дорогостоящего оборудования и, следовательно, представляет собой идеальный компромисс между сложностью и выходом клеток. Использование более тяжелых мышей (35-45 г) улучшает выход способа выделени, но также облегчает заметно процедуру катетеризации воротной вены. Токсичность функционализированных углеродных нанотрубок F -CNTs измеряли в этой модели с помощью модифицированного LDH анализа. Этот метод оценивает жизнеспособность клеток путем измерения отсутствие структурной целостности клеточной мембраны купферовских после инкубации с F -CNTs. Токсичность индуцируется F -CNTs может быть измерена с помощью последовательно этот анализ, подчеркнув, что изолированные клетки Купфера полезны для тестирования наночастиц токсичности. Общая понимание нанотоксикологии могли извлечь выгоду из таких моделей, что делает выбор наночастиц для клинического перевода более эффекциент.
Поле нанотоксикологии исследований направлена охарактеризовать биологическое действие наночастиц. Токсикологические исследования, основанные на исследованиях в естественных условиях остаются наиболее точных методов. Тем не менее, их применение ограничено их стоимости, трудовых и временных требований 1. Как анализы альтернатив, в пробирке были использованы из-за их простоты и возможности разработки высокой пропускной в пробирке тестирования платформ 2 – так увеличения количества тестируемых условиях. Большинство nanotoxicological исследования проводили с использованием в анализах пробирке с иммортализованных клеточных линий. Тем не менее, существуют опасения относительно экстраполяции этих экспериментальных данных в естественных условиях токсикологических эффектов 3. Действительно, свойства иммортализованных клеточных линий может быть существенно отличается от тканей они были получены из, например, генетической трансформации 4, ухудшение ключевых морфологических признаков5, потеря сотовой полярности 6 и функциональных изменений, таких как регулирование медиаторов воспаления 7.
Клетки Купфера являются наиболее распространенными население макрофагов в организме и непосредственно в контакте с кровью, выравнивая стенки синусоиды печени. В рамках ретикуло-эндотелиальной системы (РЭС), эти макрофаги несут ответственность за захват циркулирующих наночастиц и поэтому представляют собой весьма подходящую модель для изучения наночастиц токсичности. В естественных условиях 8 и в пробирке были опубликованы в другом месте 9 исследования воспалительных реакций, связанных с клетками Купфера, подверженных наночастиц. Клетки Купфера также участвуют в патогенезе заболеваний печени, таких как алкогольная болезнь печени, 10 фиброза печени 11 или вирусного гепатита 12. Было сообщено, что изолированные клетки Купфера обеспечить полезную информацию для описания клеточных механизмов инвolved к нарушению печени 13,14.
Несколько методов были зарегистрированы для выделения и очистки клетки Купфера. Изолятор может быть результатом механического или ферментативного разложения 15. Коллагеназа пищеварения показывает преимущество сохранения функциональной целостности клеток Купфера, в то время как ведущие к высокой доходности купферовских клеток 16. Многие экспериментальные подходы, различные по сложности и затрат, были использованы, чтобы отделить клетки Купфера от других популяций клеток печени. Например, чистота Купфера клетка может быть достигнуто с помощью иммуноаффинной 17, электрофорез поток 18, селективной адгезии 16 или центробежными методами 16, которые отбирают клетки в зависимости от их размера и плотности. Сочетание этих методов может быть выбран, чтобы повысить чистоту населения 16. Там нет консенсуса о идеального метода для выделения клеток Купфера, а это в основном зависит от применения и имеющихся оборудование длят. Тем не менее, в случае испытаний на токсичность наночастиц, простота и высокий выход техники, связанной с сохранением функциональной клетки Купфера оказались наиболее подходящим для этого применения.
Способ изоляции клеток Купфера сообщалось здесь, основан на методе 2-ступенчатой перфузии с последующей очисткой по градиенту плотности. Этот метод был модифицирован из исходной протоколу, разработанному Smedsrød др. 16 предназначен для выделения клеток печени крысы. Большинство исследований сообщает и описал изоляции клеток Купфера печени крыс с. При этом мы опишем метод, чтобы изолировать клетки Купфера печени от мыши, с высоким выходом и чистотой. Использование мышей снижает стоимость эксперимента и позволяет обработка нескольких печени, чтобы получить большие количества клеток Купфера для тестирования наночастиц токсичности.
В следующем протоколе, клетки Купфера инкубировали с функционализированных углеродных нанотрубок (е </EM> -CNTs). Уникальные физико-химические свойства УНТ – т.е. высокое отношение длины к диаметру и большой площадью поверхности, сделали УНТ интересных кандидатов в качестве векторов для целей терапии и диагностики. Тем не менее, проблемы были подняты о токсичности УНТ 19 и разработке новых в пробирке тесты направлена на повышение понимания УНТ биологического эффекта. Токсичность в Клетка Купфера связано с отсутствием структурной целостности клеточных мембран. Этот процесс измеряется потерей цитоплазматического фермента ЛДГ из клетки в супернатанте. Принцип этого метода, таким образом, чтобы удалить любой выпущенный ЛДГ и измерить то, что осталось в клетках 20. Это делается в предпочтении к измерению выпущенный ЛДГ в супернатанте, так как наличие нанотрубок в надосадочной жидкости мешает анализа 21.
Мы предлагаем использовать этот простой и экономически эффективной мето изоляции Купфера клеткиd, чтобы изолировать большое количество функциональных клеток Купфера. Это позволяет скрининг токсичности в диапазоне наночастиц, в соответствующей первичной модели макрофагов.
Следующие шаги имеют решающее значение для достижения высокой урожайности и высокой жизнеспособности клеток Купфера. Асептических условиях должны быть использованы, чтобы снизить риск бактериального и грибкового загрязнения. Все инструменты должны быть стерилизованы перед использ…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by EU FP7-ITN Marie-Curie Network program RADDEL. MB and KAJ would like to acknowledge Joe Varguese and Rui Serra Maia for their help and suggestions along the optimization of the Kupffer cell isolation.
Euthatal (pentobarbital sodium) | Merial | ||
CD1 mice | Charles River | – | Mouse weight should vary from 35 to 45 g. We advise the use of male CD1 mice as their weight increase rapidly (e.g. a male CD1 mouse of 7 weeks old exceeds 35 g in weight). It is also advised to contact the animal supplier in advance to arrange for the delivery of older animals. Alternatively animals can be in-house to reach the desired weight. |
HBSS (Ca2+ and Mg2+ free, with bicarbonate) | Life Technologies | 14175-053 | HBSS must be Ca2+ free. |
Ethylene Glycol Tetraacetic Acid (EGTA) tetrasodium salt | Sigma-Aldrich | E8145 | EDTA can also be used but EGTA has the advantage of chelating Ca2+ selectively. |
HEPES (1M) | Life Technologies | 15630-056 | 100 ml |
Collagenase type IV | Worthington | CSL-4 | It is advised to test different batches of collagenase or at least mention to the supplier the product has to be suitable for liver cell isolation |
Low glucose DMEM | Sigma-Aldrich | D5523 | 500 ml |
RPMI (with sodium pyruvate and Glutamax®) | Life Technologies | 12633-012 | 500 ml |
Penicillin/Steptomycin | Life Technologies | 15140-122 | 100 ml |
Fetal Bovine Serum | First-Link | 60-00-850 | 500 ml |
Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | 100 ml |
Coated silica particle solution (Percoll®) | GE Healtcare | 17-0891-02 | Percoll® is very stable and can be kept for several years |
1x Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010-023 | 500 ml |
10x Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 70011-036 | 500 ml |
Dimethyl sulfoxide | Fisher | D/4120/PB08 | 500 ml |
LDH kit (CytoTox 96®) | Promega | G1781 | Keep protected from light |
DMEM phenol red free | Life Technologies | 31053-028 | 500 ml |
F4/80 antibody (Alexa 488) | AbD Serotec | MCA497A488 | Do not dilute, used neat for flow cytometry |
Fluorescent beads | Sigma | L2778 | Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red. 1 ml |
Name of the Material | Company | Catalog number | Comments/Description |
Butterfly blood collection set (23G/305mm long tubing) | BD | 367288 | |
Syringe Filters (0.22 μm Blue Rim) | Minisart | 16534-K | |
Centrifuge Tubes (50 ml Blue Cap) | BD Biosciences, Falcon | 35 2070 | |
Petri dish (90 x 15 mm) | Thermo Fisher Scientific | BSN 101VR20 | |
100 μm cell strainer | BD | 352360 | |
Peristaltic pump | Watson Marlow | SciQ 300 | Rinse tubing before and after each usage with sterile PBS and 70% ethanol. |
24-well plates | Corning | 3526 | |
96-well plates | Corning | 3595 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
Plate reader | BMG Labtech | FLUOstar Omega | |
Serrefine forceps | Hammacher GmbH | Art. Nr. HSE 004-35 / Cat. Nr. 221-0051 | The serrefine forceps allow to clamp the vessel cannulated with the 23G needle without the need of holding the forceps during the perfusion procedure. URL: (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html) |
Flow cytometry tubes | BD Biosciences, Falcon | 352052 | |
Microcentrifuge tubes (1.5 ml) | Elkay | 000-MICR-150 | |
Cell scraper | BD Biosciences, Falcon | 353086 | Cut blade extremities with a pair of scissors to scrape cells in 24-well plates. |
Name of the Reagent | Company | Catalog number | Comments/Description |
EGTA (Ethylene Glycol Tetraacetic Acid)/HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) Solution | HBSS containing 0.5 mM EGTA and 25 mM HEPES. Adjust pH to 7.4. Prepare 50 ml for each liver to perfuse. | ||
Collagenase Solution | DMEM low glucose containing collagenase type IV at 100 UI/ml, 15 mM HEPES and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Adjust pH to 7.4. Prepare 100 ml for each liver to perfuse. After adding the collagenase, it is advised to warm up the solution for 30 min before use. This allows the collagenase activity to be optimum. | ||
Kupffer Cell Isolation Medium | RPMI containing, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% glutamax® (v/v) and 1% Penicllin/Streptomycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers. | ||
Kupffer Cell Culture Medium | RPMI containing 10% Fetal Bovine Serum, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% Glutamax® (v/v) and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers. | ||
SIP (solution of isotonic coated silica particles) | Mix 1.7 ml of 10x Phosphate Buffered Saline with 15.3 ml of Percoll® to obtain 17mL of SIP. | ||
25% SIP solution | Mix 5 ml of SIP with 15 ml of 1x Phosphate Buffered Saline | ||
50% SIP solution | Mix 10 ml of SIP with 10 ml of 1x Phosphate Buffered Saline | ||
Lysis Buffer | DMEM media with 0.9% Triton X-100 | ||
PBS/BSA Solution | Prepare fresh Phosphate Buffered Saline pH 7.4 with 1% Bovine Serum Albumin. | ||