Abstract
Cellodling har traditionellt utförts på tvådimensionell (2D) substrat där celler följer använder ventrala receptorer till biomaterialytan. Emellertid in vivo, de flesta av cellerna är helt omgiven av den extracellulära matrisen (ECM), vilket resulterar i en tredimensionell (3D) fördelning av receptorer. Detta kan utlösa skillnader i utsidan-i signalvägar och därmed i cellbeteende.
Den här artikeln visar att stimulera rygg receptorer celler som redan anslutit sig till ett 2D-substrat genom att lägga en film av ett nytt material (en sandwich-liknande kultur) utlöser viktiga förändringar när det gäller vanliga 2D kulturer. Vidare, den samtidiga exciteringen av ventrala och dorsala receptorer skiftar cellbeteende närmare den som finns i 3D-miljöer. Dessutom, på grund av utformningen av systemet, är en sandwich-liknande kultur ett mångsidigt verktyg som gör det möjligt att studera olika parametrar i cellen / material integreractions, t.ex., topografi, styvhet och olika proteinbeläggningar på både de ventrala och dorsala sidor. Slutligen, eftersom sandwichliknande kulturer bygger på 2D underlag, flera analysprocedurer redan utvecklat för standard 2D kulturer kan användas som vanligt, att övervinna mer komplicerade förfaranden som behövs för 3D-system.
Introduction
Traditionellt har cellkultur utförts på bi-dimensionell (2D) substrat, även om de flesta av de cellulära mikromiljöer in vivo har en tredimensionell (3D) natur. Denna onaturliga 2D miljö utlöser förändringar i cellens beteende som ett sätt att själv anpassning till en platt värld, som direkt påverkar cell öde 1,2. Därför resultat som erhållits på 2D cellkulturer är inte alltid reproducerbar in vivo. Detta har uppmuntrat utvecklingen av nya relevanta odlingssystem som vill ge mer fysiologisk liknande förhållanden för att få ytterligare insikter i någon dimension beroende biologisk mekanism 3,4.
En av de viktigaste skillnaderna mellan 2D kultur och 3D in vivo miljö är fördelningen av cellreceptorer förankrade till den extracellulära matrisen (ECM): medan 2D substrat celler vidhäftar ventralt, är majoriteten av celler in vivo helt omgiven av ECM och sålunda cell vidhäftning sker genom en 3D-fördelning av receptorer. Detta utlöser olika celladhesion signalvägar och därigenom modulerar viktiga processer såsom celltillväxt, celldifferentiering och genuttryck. Under de senaste decennierna har många olika 3D odlingssystem etablerats 5-8, även om deras varierande egenskaper och komplexitet hindrar deras standardisering gemensamt cellodlingsförfaranden. Dessutom 3D-system är oftast inte lätt att hantera och nuvarande experimentella procedurer på 2D-substrat kan inte vara lätt att fastställas för 3D-kulturer. Dessutom litteratur jämför sällan 3D kulturer med motsvarande 2D tillstånd eller andra 3D-system, vilket hindrar riktig förståelse av cellens beteende i dessa modeller.
När med cellerna vidhäftade på en 2D-substrat, exciteringen av de dorsala receptorer - genom att överlagra en film av ett nytt material (sandwichliknande kultur) - kan utlösa cellsvar både 3D-miljöer. REAson bakom detta är samtidig aktivering av både rygg och ventrala receptorer att följa och sprida inom sandwich miljön (Figur 1) 9,10. Som en följd av celler genomgå betydande förändringar när det gäller 2D kulturer 11,12. Således cell öde bestäms vid montering på grund av sandwich kultur, eftersom rygg stimulering utlöser förändringar i viktiga cellulära vägar. Därför är cellöde starkt bestäms av den tidpunkt då den sandwichliknande kultur monteras 11.
På grund av karaktären hos systemet, är en sandwich-liknande kultur ett enkelt och mångsidigt verktyg som tillåter studiet av olika parametrar i cellen / material interaktioner såsom kemi, topografi, stelhet och proteinbeläggningar på både de ventrala och dorsala sidor. Detta erbjuder en högre grad av mångsidighet jämfört med andra 3D-system (figur 2) på grund av den oberoende dorsala och ventrala kombinationen av ett brett variety av ytförhållandena. Dessutom kan studeras olika cellinjer och olika tider för att montera den sandwichliknande kultur, ökar det breda spektra av möjligheter.
En standardprotokoll av sandwich-liknande kultur i detalj nedan med hjälp av antingen poly-L-mjölksyra (PLLA) elektrospunna fibrer eller filmer som rygg substrat, täckglas som ventrala substrat och fibronektin som proteinbeläggning. Sandwich-liknande kulturer samlades strax efter cellsådd eller efter 3 h av 2D kultur. Observera dock att andra materialsystem och proteiner kan användas; likaledes sandwichliknande kulturen kan monteras vid olika tidpunkter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Produktion av Dorsal substrat
- Framställning av en platt film av PLLA med lösningsmedelsgjutning.
- Arbete i ett dragskåp för att framställa en lösning av 2% (vikt / volym) PLLA i kloroform (2 g PLLA i 100 ml kloroform) genom omröring vid rumstemperatur (RT) till fullständig upplösning (3 h ungefär).
- Placera brickorna på en glaspetriskål.
Obs: Använd rostfritt stål brickor med en innerdiameter på 10,5 mm (något mindre än den ventrala prov diameter) så att brickan placeras ovanpå den ventrala substrat. Andra material, såsom polytetrafluoreten (PTFE) eller glasbrickor kan användas också. - Lägg 200 ul av PLLA lösningen i bricka och låt avdunsta långsamt under 30 min vid RT. För att tillåta långsam förångning av lösningsmedlet, stäng petriskål med aluminiumfolie med några hål.
- Värm proverna vid 120 ° C under 5 min för att förånga lösningsmedels spår.
- Låt proverna svalna görawn vid RT.
- När proverna har svalnat (30 min ca), täck med 18,2 Mohm · cm vatten i petriskål och inkubera i 8 minuter vid RT.
Obs: Om proverna inte är helt svalnat, kan de ta upp 18,2 Mohm · cm vatten och anta ett gummiartat tillstånd. Dessutom kan inkubering i 18,2 Mohm-cm vatten för mindre än 8 minuter resultera i felaktig lossnar, och för mer än åtta minuter i lösgörande från brickan. - Med ett rakblad, bänd brickorna bort dem petriskål.
- Avlägsna eventuella brister från kanten av brickan med pincett och låter proverna lufttorka.
- Förvara proverna i en vakuumexsickator (80 mbar) tills dagen för experimentet eftersom PLLA är nedbrytbar genom hydrolys.
- Produktion av PLLA fibrerna genom elektrospinning.
- Arbete i ett dragskåp för att framställa en lösning av 8% (w / v) PLLA i hexafluorisopropanol (8 g PLLA i 100 ml hexafluoroisopropanol) av omring vid RT tills helt upplöst (3 timmar ungefär).
- Placera polytetrafluoreten (PTFE) brickor på en aluminiumplåt eller på en trumma för electrospinning för att få slumpmässiga eller inriktade fibrer respektive.
Obs: Använd polytetrafluoretylen (PTFE) brickor med en innerdiameter på 10,5 mm (något mindre än den ventrala prov diameter) så att brickan placeras ovanpå den ventrala substrat. Andra material, såsom stål eller glas brickor rostfritt kan användas. Trumman ska rotera med en vinkelhastighet av 160,7 sek -1 (radie = 7 cm) i syfte att erhålla inriktade fibrer. En långsammare hastighet kanske inte utlösa fiberinriktningen och en snabbare hastighet kommer att resultera i brutna fibrer. - Fyll sprutan med polymerlösningen och placera den på sprutpumpen.
- Electrospin den PLLA lösningen med användning av en 0,9 ml / h flödeshastighet med en spänning på 30 kV och en kollektor avstånd av 12 cm.
- Stoppa electroprocessen akterER 20-30 min, en gång en bra fiberdensitet uppnås (eftersom cellerna måste interagera med flera fibrer samtidigt).
- Värm proverna vid 120 ° C under 5 min för att förånga lösningsmedels spår.
- Förvara proverna i en vakuumexsickator (80 mbar) tills dagen för experimentet eftersom PLLA är nedbrytbar genom hydrolys.
2. Sandwich Kultur
- Montera sandwich-liknande kultur när celler följs ventrala 2D underlaget.
- Arbete i ett odlings huva för att säkerställa sterila förhållanden och sterilisera alla material (glas täckglas, dorsala substrat, pincett, etc.) genom UV-exponering under 30 min.
- Coat den ventrala och dorsala substrat med fibronektin för att rikta specifik cell-proteinvidhäftning. För att göra detta, Inkubera proverna i 20 mikrogram / ml fibronektin upplöst i Dulbeccos fosfatbuffrad saltlösning (DPBS) innehållande Ca2 + och Mg 2 + (200 l / sriklig) under 1 timme.
OBS: På grund av tillverkningsprocessen, ryggsubstrat har en utsedd ovan- och undersidor eftersom lösningsmedelsgjuten film och elektrospunna fibrer fäst vid en av sidorna av brickan. Denna sida är därför en mot cellerna (Figur 3).- Efter proteinbeläggning, tvätta proverna två gånger med DPBS för att avlägsna protein i överskott. Sedan inkubera prover i DPBS tills deras användning i syfte att förhindra att prover från att bli torr eftersom detta orsakar protein denaturalization. Använd DPBS innehållande Ca2 + och Mg2 + sedan divalenta katjoner reglerar proteinveckning.
- Seed celler på täckglas 13.
OBS: Eftersom sandwich-liknande kultur bygger på 2D substrat, kommer cellsådd utföras på samma sätt som på ett 2D-prov. Till exempel är C2C12 myoblast såddes vid 17.500 celler cm -1 för differentieringsexperiment och NIH3T3 fibroblast ympas vid 7000 Calnar cm -1 för isolerade kulturer för att studera cellmorfologin och vidhäftning. - Placera proverna i en inkubator vid 37 ° C med 5% CO2 och tillåta cellerna att vidhäfta till den ventrala substrat för 3 timmar.
- Placera den ventrala ympade substratet i en ny brunn i en 12 platta med flera brunnar (där brickor fit).
Anm: Montering av sandwichliknande kultur i en ny brunn är ett sätt att bli av med de celler som har fastnat på botten av brunnen efter sådd eftersom dessa kommer att förbruka näringsämnen och utsöndrar tillväxtfaktorer och avfall som påverkar celler odlade inuti sandwichliknande systemet. Detta är också ett måste för cellulära extraktioner för att lysera endast de celler som odlats i sandwich-liknande miljö. - Försiktigt och med hjälp av en pincett, överlagra rygg substrat på cellerna. Fyll på med medium (1 ml) och inkubera vid 37 ° C med 5% CO2.
Anm: Vikten av brickan kommer att förhindra den dorsala underStrate från flytande. - Ändra mediet två gånger i veckan som i vanliga 2D kulturer. Flytta inte rygg substratet eftersom detta kan leda till cellskador.
- Montera sandwich-liknande kultur strax efter cellsådd.
- Arbete i ett odlings huva för att säkerställa sterila förhållanden och sterilisera alla material (glas täckglas, dorsala substrat, pincett, etc.) genom UV-exponering under 30 min.
- Coat den ventrala och dorsala substrat med fibronektin för att rikta specifik cell-proteinvidhäftning. För att göra detta, Inkubera proverna i 20 mikrogram / ml fibronektin löst i DPBS innehållande Ca2 + och Mg 2 + (200 l / prov) under 1 timme.
- Efter proteinbeläggning, tvätta proverna två gånger med DPBS för att avlägsna protein i överskott. Sedan inkubera prover i DPBS tills deras användning i syfte att förhindra att prover från att bli torr eftersom detta orsakar protein denaturalization. Använd DPBS innehållande Ca2 + och Mg
- Efter proteinbeläggning, tvätta proverna två gånger med DPBS för att avlägsna protein i överskott. Sedan inkubera prover i DPBS tills deras användning i syfte att förhindra att prover från att bli torr eftersom detta orsakar protein denaturalization. Använd DPBS innehållande Ca2 + och Mg
- Seed celler på täckglas av glas i en brunn i en 12 platta med flera brunnar (där brickor passar). För att göra detta, använd en högkoncentrerad cellulär suspension för att undvika cellförlust efter värpdagen rygg substratet.
- Försiktigt och med hjälp av en pincett, överlagra rygg substrat på cellerna. Fyll på med medium (1 ml) och inkubera vid 37 ° C med 5% CO2.
Anm: Vikten av brickan kommer att förhindra den dorsala substratet från flytande. - Ändra mediet två gånger i veckan som i vanliga 2D kulturer.
Obs! Flytta inte rygg substratet eftersom detta kan leda till cellskador.
3. Analys
Obs: Sandwich-liknande kulturer bygger på 2D underlag, och så kan ofta analyseras av förfaranden som redan utvecklats för vanliga 2D kulturer. Till exempel, eftersom PLLA är transparent och cells begränsas att röra sig inom xy-planet, är mikroskopi gjort som på 2D-substrat. Cellmigration kan därför analyseras som för 2D-kulturer, utan behov av att spåra celler i z-axeln som för 3D kulturer, vilket förenklar experimentet och bildanalys. För att studera sårläknings analysen genom en repa analys följer detta protokoll:
- Cellmigrering studie (sårläknings analys) inuti sandwichliknande kultur.
- Arbete i ett odlings huva för att säkerställa sterila förhållanden och sterilisera alla material (glas täckglas, dorsala substrat, pincett, etc.) genom UV-exponering under 30 min.
- Coat den ventrala och dorsala substrat med fibronektin för att rikta specifik cell-proteinvidhäftning. För att göra detta, inkubera proverna i 20 | ig / ml fibronektin upplöst i Dulbeccos fosfatbuffrad saltlösning (DPBS) innehållande Ca2 + och Mg2 + för en timme.
- Efter proteinbeläggning, tvätta proverna två gånger med DPBSFör att avlägsna protein i överskott. Sedan inkubera prover i DPBS tills deras användning i syfte att förhindra att prover från att bli torr eftersom detta kan orsaka protein denaturalization. Använd DPBS innehållande Ca2 + och Mg2 + sedan divalenta katjoner reglerar proteinveckning.
- Seed celler på täckglas av glas med en hög densitet 13.
- Placera proverna i en inkubator vid 37 ° C med 5% CO2 och tillåta cellerna att uppnå konfluens.
- Använd en pipettspets för att skrapa cellmonoskiktet för att få två cellpopulationer separerade av ett gap.
- Placera den ventrala seedade substratet i en ny brunn lämplig för time-lapse förvärv och där rygg substrat passa (dvs 12 flera brunnar).
- Försiktigt och med hjälp av en pincett, överlagra rygg substrat på cellerna och sedan fylla på med medium (1 ml för en 12 platta med flera brunnar).
Anm: Vikten av brickan kommer att förhindra than bröst- substrat från flytande. - Placera provet i tidsförlopp mikroskop (satt till 37 ° C och 5% CO 2) och ta bilder av gapet stängning varje 20 min.
- Analysera gapet stängning med hjälp av särskilda program som plugin MiToBo från ImageJ. 14
Obs: Protein och nukleinsyra extraktion utförs på samma sätt som på 2D-substrat. Det finns bara ett extra steg som består i att demontering av sandwich-liknande kultur för att lägga lysbufferten direkt på cellerna för att öka extraktionseffektiviteten. Till exempel, för mRNA-extraktion:
- Utdrag mRNA från Sandwich liknande kulturer
- Förbered alla buffertar från kommersiellt kit enligt tillverkarens anvisningar.
- Ta sandwich-liknande kultur ur inkubatorn.
- Avlägsna odlingsmediet från proverna.
- Tvätta prover en gång med DPBS innehållande Ca2+ och Mg 2+ (1 ml) och ta bort all lösning.
- Med hjälp av en pincett, ta bort den dorsala substratet och tillsätt lysbuffert (350 | il) till den ventrala substratet. Överlagringen igen den dorsala substratet på den ventrala substratet för att lysera även cellerna vidhäftade till den dorsala substratet.
- Ta rygg substratet för att isolera lyslösning.
- Följ tillverkarens instruktioner för att få mRNA.
Obs: Immun av proteiner kan också genomföras som på 2D-substrat. Eftersom sandwich-liknande kulturer kan hindra korrekt spridning av antikropparna och buffertar, bör inkubationstider ökas. Dessutom kan sandwich demonteras innan färgningsprotokollet men i detta senare fall vissa celler kommer att förbli fäst vid den dorsala substratet och en del till den ventrala substratet.
- Immunodetect proteiner inom en sandwich-liknande kultur
Obs: Dorsal substratet kan avlägsnas under fixeringsprocessen, så att diffusion problemen undviks. - Skölj med DPBS (1 ml) och sedan permeabilisering med 0,5% Triton X-100 i DPBS (1 ml) under 5 min vid RT.
- Blockera icke-specifika bindningsställen med en% albumin i DPBS (1 ml) under 30 min vid RT.
- Inkubera med primär antikropp (2 ^ g / ml; 1 ml) i blockerande lösningen i 3 h vid RT.
- Tvätta tre gånger i 10 min med DPBS / 0,5% Tween 20 (1 ml).
- Inkubera 2 h med sekundära antikroppar (2 ^ g / ml) och 1 | ig / ml DAPI i blockeringslösning (1 ml) vid rumstemperatur.
- Tvätta tre gånger i 10 min i DPBS / 0,5% Tween 20 (1 ml).
- Tvätta i DPBS.
Notera: Prov kan monteras på ett objektglas med Vectashield och förseglades med nagellack när dorsala substraten avlägsnas före den immunodetektering. - Observera under fluorescensmikroomfattning som för vanliga 2D substrat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Stimulering av rygg receptorer i sandwich-liknande kultur utlöser förändringar i cellmorfologi, celladhesion och intracellulära signalvägar (t.ex. fokal vidhäftningskinas, FAK) 10-12. Som ett exempel, fibroblaster odlade inuti sandwichliknande systemet överuttryckt i α 5 grin-subenheten jämfört med 2D, som observerats för andra 3D-kulturer 15,16.
Cellöde är mycket beroende av den tid då de dorsala receptorerna stimuleras och av egenskaperna hos den dorsala interaktion, på liknande sätt som sker i andra 3D-system, såsom hydrogeler. Till exempel, hydrogeler där proteiner är tätt bundna brukar visa mindre och rundade celler med outvecklade aktincytoskelettet och diffusa fokala sammanväxningar. Detta kan efterliknas i en sandwich-liknande kultur med användning av substrat som adsorberar proteiner tätt, så att cellerna inte kan mekaniskt omorganisera detta skikt av proteiner och cell Spreading hindras. På samma sätt kan hydrogeler där celler kan omforma ECM härmas med sandwich systemet genom att använda substrat som absorberar proteiner lösare 10.
Stimulering av rygg receptorer har visat sig modulera C2C12 cell öde. Dorsal elektrospunna PLLA fibrer direkt celljustering när belagd med fibronektin, men inte när de är belagda med bovint serumalbumin (ett icke-proteinklister). Detta resultat påpekar celler gör biologiskt förnuft och reagera på rygg ingångar (Figur 4) 9. Dessutom, sandwich-liknande kulturer med plan rygg PLLA utlöste en höjning av myogenes. Detta beror också på rygg biologiska stimuli eftersom samspelet med olika rygg proteiner resulterar i olika differentierings priser (Figur 5) 9.
Cellmigration inom sandwichliknande kulturen också förändras jämfört med 2D kulturen. Det har varasv visat att i en sårläkande analys celler inom sandwichodling anta en mycket långsträckt morfologi och migrera kortare avstånd än på 2D substrat (filmer 1 och 2). Cellvandringshastigheter är vidare relaterade till beskaffenheten av den ventrala och dorsala stimulering 12.
På samma sätt som inom 3D-fibronektin och kollagengeler 17,18, ökar sandwich-liknande kultur cellmedierad ECM omorganisation (dvs. den ventrala fibronektin) i förhållande till 2D tillstånd (figur 6) 12. Denna process förlitar sig på de dorsala mekaniska stimuli och cytoskelettet stabilitet eftersom användningen av kontraktilitet hämmare (blebbistatin, Y27632) hindrade processen. Intressant, var den ventrala fibronektin också omorganiserats vid användning av olika ryggproteinbeläggningar (dvs. vitronektin och bovinserumalbumin) och även om de lämnas obelagda 12.
Figur 1:.. Skiss av standard (2D) och sandwich-liknande kulturer Stimulering av rygg receptorer i sandwich-liknande kultur utlöser ytterligare celladhesion signalering som modulerar viktiga cellulära processer Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Sandwich-liknande kultur är ett mångsidigt system som gör det möjligt att studera olika välkontrollerade parametrar (topografiska ingångar, stelhet, gradienter ...) på båda de ventrala och dorsala substrat.
Figur 3:. Dorsal substrat skiss för både toppen och tvärsnitt i syfte att visa att ha en utsedd över- och undersidan (A) Platt PLLA film och (B) elektrospunna fibrer.
Figur 4:. C2C12 morfologi under olika odlingsbetingelser, inklusive plan (p) och inriktade fibrer (a) av PLLA som användes som ventrala (index) eller rygg (upphöjda) substrat streckade linjerna representerar fibrer orientering vid behov. Celler odlade på planet underlaget och överlagrade med inriktade fibrer av PLLA (SW p a) känner rygg stimuli. Speciellt celler känner rygg fibrerna när belagda med fibronektin men inte när belagda with bovinserumalbumin (en icke-proteinklister). Följaktligen celler vidhäfta till fibrerna belagda med fibronektin och rikta sig i samma riktning. Bild anpassat från referens 9. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Celldifferentiering i sandwichliknande kulturer efter 4 dagar i differentiering media. Olika odlingsbetingelser analyserades bland annat planet (p) och inriktade fibrer (a) av PLLA som användes som ventrala (index) eller rygg (upphöjd) substrat. Prover belagda med fibronektin i samtliga fall. (A) Fluorescens färgning visar sarcomeric myosin positiva celler (gröna) och cellkärnor (red). (B) Differentieradeceller orientering som beräknas genom Fast Fourier Transform. (C) myogenes bestämd genom den procentuella andelen av sarcomeric myosin-positiva celler. Data normaliseras till guldmyntfoten kontroll. Statistiskt signifikanta skillnader är markerade med *** P <0,001. Bild anpassat från referens 9. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Omorganisation av ventrala fibronektin. Sandwichodling utlöser ventrala FN omorganisation genom att bilda nya fibronektin fibriller (borstliknande märkning; påpekade med vita pilar). Ventrala fibronektin omorganiseras inuti sandwichliknande kulturer med olika dorsala proteinbeläggning (fibronektin, vitronektin och bovint serumalbumin)eller till och med när den dorsala substratet lämnas obelagda. Aktincytoskelettet (grön), kärnor (blå) och FN (röd) visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Film 1: Cellmigration på 2D. L929 fibroblast migrerar på en fibronektin belagd täckglas i en sårläknings analys. Bilder förvärvades under 16 timmar (med en ram tas varje 20 min). Klicka här för att se filmen.
Film 2:. Cellmigration inom sandwich-liknande kultur L929 fibroblast migrerar i en sårläknings analys inom en sandwich-liknande kultur var den ventrala underlaget var en fibronektin belagd täckglas och rygg substratet en fibronektin belagd PLLA film. Bilder förvärvades under 16 timmar (med en ram tas varje 20 min). Klicka här för att se filmen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Numera är 3D kultur ett viktigt ämne för läkemedels- och bioteknikindustrin samt forskning i cellbiologi, inklusive cancer och stamceller. Som en konsekvens flera 3D odlingssystem har utvecklats. Tyvärr, skillnader mellan 3D-system brukar resultera i olika cellbeteende, vilket hindrar förståelsen av cell öde. Dessutom, experimentella procedurer är oftast inte så enkelt som för 2D odlingssystem. Därför utvecklar nya odlingssystem som söker att övervinna några av dessa nackdelar är mycket viktigt.
Sandwich-liknande kultur har visat att starkt påverka viktiga cellulära processer såsom celldifferentiering, cellmorfologi, cellsignalering och cellmigration. Vidare celler dela likheter med celler odlade i 3D-system, som stöder påståendet att sandwichliknande kultur länkar 2D med 3D odlingssystem. Fysiologiska vävnader har porer inom intervallet från 3 till 14 μm som tvång celler och därför påverka cellulära processer som migration. Detta är något rekapituleras använder sandwich-liknande system som dorsala och ventrala stimuli utgör i sig en begränsad miljö som begränsar cellmorfologi och kommer med nödvändighet att påverka cellmigration oberoende av proteinbeläggningar.
På grund av den samtidiga stimulering av dorsala och ventrala receptorer, är en robust teknik för att undersöka vilken roll dimensionerna i cellens beteende sandwich-liknande kultur. Eftersom den är baserad på 2D substrat, är denna kultur systemet mycket mångsidig att studera olika materialegenskaper och ECM-ingångar som möjliggör studier av cellens beteende under olika mikromiljöer. Dessutom kan inverkan av den tidpunkt vid vilken dorsala receptorer stimuleras på cellernas öde undersökas genom att överlagra den dorsala substratet vid olika tidpunkter. Följaktligen, till skillnad från andra 3D-system tillhandahåller sandwichliknande systemet ett brett spektrumväl kontrollerade cellulära mikromiljöer. Följaktligen sandwich-liknande system är en intressant cellodlings plattform för att efterlikna olika fysiologiska miljöer för att studera cellbiologi och testcell öde under olika odlingsbetingelser.
Såsom nämnts tidigare är en fördel med detta system att olika ventrala och dorsala substrat kan studeras med användning av olika proteinbeläggningar. Därför kan viktiga parametrar för cellernas öde såsom ligandtäthet avstämmas genom att styra ligandtäthet av var och en av de 2D-substrat som används (t.ex. ventrala och dorsala substrat). Observera dock att olika substrat kan behöva förändringar i protokollet. Till exempel, kan med hjälp av större rygg substrat resultera i behovet att ställa in rätt inkubationstiden att skala proverna från petriskål. På samma sätt skulle större ventral substrat resultera i hypoxiska områden i mitten av provet på grund av den begränsade syrepermeabiliteten av den ventralasubstratet (på grund av glas täckglas). Dessutom kommer analysprocedurer att bero på de substrategenskaper. Till exempel, kommer att använda ogenomskinliga rygg substrat hindra standard mikroskopi protokoll om det fortfarande kommer att tillåta protein / nukleinsyror extraktion. En annan viktig faktor är permeabilitet rygg underlaget eftersom celler bör tillåtas att få näring från mediet och kasta avfall.
För att sammanfatta, är en sandwich-liknande kultur ett enkelt system som ger möjlighet att efterlikna olika 3D-liknande mikromiljöer för att undersöka cell öde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ploy(lactic acid) | NatureWorks | 4042D | Reagent |
| Cover glasses (12 mmØ) | Marienfeld | 631-0666 | Equipment |
| Chloroform | Scharlab | CL0200 | Reagent |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP) | Sigma | 105228 | Reagent |
| Syringe (1 ml) | Henke Sass Wolf | 4010-200V0 | Equipment |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE1000 | Equipment |
| High Voltage DC Power Supply | Glassman High Voltage | Series FC | Equipment |
| Incubator | Hucoa-Herlös | 3111 | Equipment |
| Laminar flow hood | Telstar | AV30/70 | Equipment |
| Human Fibronectin | Sigma | F2006 | Reagent |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | Reagent |
| Inverted microscope | Leica Microsystems | DMI 6000 | Equipment |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Reagent |
| Albumin | Sigma-Aldrich | A7409 | Reagent |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | Reagent |
References
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J Cell Sci. 125 (Pt 13), 3015-3024 (2012).
- Weiss, P. Rev. Mod. Phys. 31 (1), 11-20 (1959).
- Ruffner, H., Lichtenberg, J. 3D cell culture systems--towards primary drug discovery platforms: an interview with Heinz Ruffner (Novartis) and Jan Lichtenberg (InSphero). Biotechnol J. 7 (7), 833-834 (2012).
- Horning, J. L., et al. 3-D tumor model for in vitro evaluation of anticancer drugs. Mol Pharm. 5 (5), 849-862 (2008).
- Wolf, K., et al. Compensation mechanism in tumor cell migration: mesenchymal-amoeboid transition after blocking of pericellular proteolysis. J Cell Biol. 160 (2), 267-277 (2003).
- Schor, S. L., et al. A novel 'sandwich' assay for quantifying chemo-regulated cell migration within 3-dimensional matrices: wound healing cytokines exhibit distinct motogenic activities compared to the transmembrane assay. Cell Motil Cytoskeleton. 63 (5), 287-300 (2006).
- Lee, E. J., Hwang, C. M., Baek, D. H., Lee, S. H. Fabrication of microfluidic system for the assessment of cell migration on 3D micropatterned substrates. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2009 (2009), 6034-6037 (2009).
- Zaman, M. H., et al. Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (29), 10889-10894 (2006).
- Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Salmerón-Sánchez, M. Dorsal and ventral stimuli in sandwich-like microenvironments. Effect on cell differentiation. Biotechnol Bioeng. 110 (11), 3048-3058 (2013).
- Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Moratal, D., Salmerón-Sánchez, M. Fibronectin-matrix sandwich-like microenvironments to manipulate cell fate. Biomater. Sci. 2 (3), 381-389 (2014).
- Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Rico, P., Salmerón-Sánchez, M. Dorsal and ventral stimuli in cell-material interactions: effect on cell morphology. Biointerphases. 7 (1-4), 39 (2012).
- Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Rico, P., Salmerón-Sánchez, M. Cell migration within confined sandwich-like nanoenvironments. Nanomedicine. , (2015).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Passaging Cells. J. Vis. Exp. , (2015).
- Glaß, M., et al. Cell Migration Analysis: Segmenting Scratch Assay Images with Level Sets and Support Vector Machines. Pattern Recogn. 45 (9), 3154-3165 (2012).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
- Huebsch, N., Arany, P. R., Mao, A. S., et al. Harnessing traction-mediated manipulation of the cell/matrix interface to control stem-cell fate. Nat. Mater. 9 (6), 518-526 (2010).
- Petrie, R. J., Gavara, N., Chadwick, R. S., Yamada, K. M. Nonpolarized signaling reveals two distinct modes of 3D cell migration. J Cell Biol. 197 (3), 439-455 (2012).
- Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. Stimulatory effects of a three-dimensional microenvironment on cell-mediated fibronectin fibrillogenesis. J Cell Sci. 118 (Pt 19), 4427-4436 (2005).
