Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Sandwich-lignende mikromiljøer at udnytte Cell / Materiale Interactions

Published: August 4, 2015 doi: 10.3791/53090
Automatic Translation
1,2, 1,3, 2
1Center for Biomaterials and Tissue Engineering, Universitat Politècnica de València, 2Division of Biomedical Engineering, School of Engineering, University of Glasgow, 3Biomedical Research Networking Center in Bioengineering, Biomaterials and Nanomedicine (CIBER-BBN)

Abstract

Cellekultur er traditionelt blevet udført på bi-dimensional (2D) substrater, hvor celler adhærerer ved hjælp ventrale receptorer til biomaterialeoverfladen. Dog in vivo, de fleste af cellerne er helt omgivet af den ekstracellulære matrix (ECM), hvilket resulterer i en tredimensional (3D) fordeling af receptorer. Dette kan udløse forskelle i udenfor-i signalveje og således i celle adfærd.

Denne artikel viser, at stimulere dorsale receptorer af celler, der allerede klæbet til en 2D substrat ved overlejring en film af et nyt materiale (en sandwich-lignende kultur) udløser vigtige ændringer i forhold til standard 2D kulturer. Desuden samtidig excitation af ventrale og dorsale receptorer skifter celle adfærd tættere på det, der findes i 3D-miljøer. Derudover, på grund af karakteren af ​​systemet, en sandwich-lignende kultur er et alsidigt værktøj, der tillader studiet af forskellige parametre i celle / materiale interactions, fx topografi, stivhed og forskellige protein belægninger ved både den ventrale og dorsale sider. Endelig da sandwich-lignende kulturer er baseret på 2D substrater, flere analyseprocedurer allerede udviklet til standard 2D kulturer kan bruges normalt, overvinde mere komplekse procedurer, der er nødvendige for 3D-systemer.

Introduction

Traditionelt har cellekultur blevet udført på bi-dimensional (2D) substrater, selvom de fleste af de in vivo cellulære mikromiljøer har en tre-dimensional (3D) natur. Denne unaturlige 2D miljø udløser ændringer i celle adfærd som en måde selv-tilpasning til en flad verden, som direkte påvirker celle skæbne 1,2. Derfor opnåede resultater på 2D cellekulturer er ikke altid reproducerbare in vivo. Dette har fremmet udviklingen af nye relevante dyrkningssystemer, der søger at give flere fysiologiske-lignende betingelser for at få yderligere indsigt i enhver dimension-afhængig biologisk mekanisme 3,4.

En af de væsentligste forskelle mellem 2D kultur og 3D in vivo miljø er fordelingen af cellereceptorer forankret til den ekstracellulære matrix (ECM): henviser 2D på substrater adhærerer ventralt, er de fleste af celler in vivo helt omgivet af ECM og dermed cell adhæsion sker gennem et 3D fordeling af receptorer. Dette udløser forskellige celleadhæsion signalveje derved modulerer vigtige processer såsom cellevækst, celledifferentiering og genekspression. I løbet af de sidste årtier, har mange forskellige 3D dyrkningssystemer etableret 5-8, selvom deres variabilitet og kompleksitet hindre deres standardisering kultur procedurer fælles celle. Endvidere 3D-systemer er normalt ikke let at håndtere og aktuelle eksperimentelle procedurer på 2D substrater ikke let kan etableres for 3D-kulturer. Desuden litteratur sjældent sammenligner 3D kulturer med tilsvarende 2D tilstand eller andre 3D-systemer, hvilket hindrer en korrekt forståelse af celle adfærd i disse modeller.

Gang har de celler adhæreret på en 2D substrat, excitation af den dorsale receptorer - ved overlejring af en film af et nyt materiale (sandwich-lignende kultur) - kan udløse cellereaktioner ens 3D-miljøer. Den reasøn bag dette er den samtidige aktivering af både dorsale og ventrale receptorer til at klæbe og spredning i sandwich miljø (figur 1) 9,10. Som følge heraf celler undergår væsentlige ændringer i forhold til 2D kulturer 11,12. Således er celle skæbne bestemmes under samling grund af sandwich kultur, da den dorsale stimulation udløser ændringer i vigtige cellulære veje. Derfor er celleskæbnen stærkt bestemt af det tidspunkt, hvor sandwich-lignende kultur samles 11.

På grund af karakteren af ​​systemet, en sandwich-lignende kultur er et enkelt og alsidigt værktøj, der tillader studiet af forskellige parametre i celle / materielle interaktioner, såsom kemi, topografi, stivhed og protein belægninger ved både den ventrale og dorsale sider. Dette giver en højere grad af alsidighed sammenlignet med andre 3D-systemer (figur 2) på grund af den uafhængige dorsale og ventrale kombination af en bred variety af overfladeforhold. Derudover kan forskellige cellelinjer og forskellige tidspunkter til at samle sandwich-lignende kultur undersøges, hvilket øger den brede spektre af muligheder.

En standardprotokol af sandwich-lignende kultur er beskrevet nedenfor under anvendelse af enten poly-L-mælkesyre (PLLA) elektrospundne fibre eller film som dorsale substrater, dækglas som ventrale substrat og fibronectin som protein belægning. Sandwich-lignende kulturer blev samlet lige efter cellepodning eller efter 3 timer af 2D kultur. Bemærk dog, at andre væsentlige systemer og proteiner kunne anvendes; ligeledes sandwich-lignende kultur kan samles på forskellige tidspunkter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Produktion af Dorsal Substrater

  1. Produktion af en flad folie af PLLA ved støbning opløsningsmiddel.
    1. Arbejde i et stinkskab for at fremstille en opløsning af 2% (vægt / volumen) PLLA i chloroform (2 g PLLA i 100 ml chloroform) ved omrøring ved stuetemperatur (RT) indtil fuldstændig opløsning (ca. 3 timer).
    2. Placer skiver på et glas petriskål.
      Bemærk: Brug rustfrit stål skiver med en indvendig diameter på 10,5 mm (lidt mindre end den ventrale prøve diameter), så skiven er placeret på toppen af ​​den ventrale substrat. Andre materialer, såsom polytetrafluorethylen (PTFE) eller glasopvaskemaskine kunne anvendes.
    3. Tilsæt 200 pi af PLLA opløsning i vaskemaskinen og lad fordampe langsomt i 30 minutter ved stuetemperatur. For at tillade langsom fordampning af opløsningsmidlet, lukke petriskålen med aluminiumsfolie med et par huller.
    4. Opvarme prøverne ved 120 ° C i 5 minutter for at afdampe opløsningsmiddel spor.
    5. Lad prøver cool gørewn ved stuetemperatur.
    6. Når prøverne er afkølet (ca. 30 min), dække med 18,2 MOhm · cm vand i petriskålen og inkuberes i 8 minutter ved stuetemperatur.
      Bemærk: Hvis prøverne ikke er helt afkølet, kan de tage op 18,2 MOhm · cm vand og vedtage en gummiagtig tilstand. Derudover kan inkubation i 18,2 MOhm · cm vand i mindre end 8 min resultere i forkert ubundethed, og for mere end 8 min i adskillelse fra vaskemaskinen.
    7. Med et barberblad, lirke skiverne til skræl dem ud petriskålen.
    8. Fjern eventuelle mangler fra kanten af ​​skiven med en pincet og lad prøverne lufttørre.
    9. Opbevar prøverne i en vakuumekssikkator (80 mbar), indtil den dag, for eksperimentet, fordi PLLA er nedbrydeligt ved hydrolyse.
  2. Produktion af PLLA fibre elektrospinning.
    1. Arbejde i et stinkskab for at fremstille en opløsning af 8% (vægt / volumen) PLLA i hexafluorisopropanol (8 g PLLA i 100 ml hexafluorisopropanol) ved stirring ved stuetemperatur indtil fuldstændig opløst (ca. 3 timer).
    2. Placer polytetrafluorethylen (PTFE) skiver på en aluminiumsplade eller på en tromle for elektrospinding for at få tilfældige eller aligned fibre hhv.
      Bemærk: Brug polytetrafluorethylen (PTFE) skiver med en indvendig diameter på 10,5 mm (lidt mindre end den ventrale prøve diameter), så skiven er placeret på toppen af ​​den ventrale substrat. Andre materialer, såsom rustfrit stål eller glasopvaskemaskine kunne anvendes. Tromlen bør rotere med en vinkelhastighed på 160,7 sek-1 (radius = 7 cm) for at opnå aligned fibre. En langsommere hastighed måske ikke udløse fiber tilpasning og en hurtigere hastighed vil resultere i brækkede fibre.
    3. Indlæse sprøjten med polymeropløsningen og placere den på sprøjten pumpe.
    4. Electrospin den PLLA løsning med en 0,9 ml / time flow med en spænding på 30 kV og en opkøber afstand på 12 cm.
    5. Stop electrospinning processen agtersteER 20-30 min, når en god fiber tæthed opnås (siden celler har til at interagere med flere fibre samtidigt).
    6. Opvarme prøverne ved 120 ° C i 5 minutter for at afdampe opløsningsmiddel spor.
    7. Opbevar prøverne i en vakuumekssikkator (80 mbar), indtil den dag, for eksperimentet, fordi PLLA er nedbrydeligt ved hydrolyse.

2. Sandwich Culture

  1. Saml sandwich-lignende kultur når celler er klæbet til den ventrale 2D substrat.
    1. Arbejde i en kultur hætte til at sikre sterile forhold, og der steriliseres alle materialer (dækglas, dorsale substrater, pincetter, etc.) ved UV-eksponering i 30 min.
    2. Coat den ventrale og dorsale substrat med fibronectin for at lede bestemt celle-protein adhæsion. For at gøre dette, inkuber prøverne i 20 ug / ml fibronectin opløst i Dulbeccos phosphatbufferet saltvand (DPBS) indeholdende Ca2 + og Mg2 + (200 pl / srigelig) i 1 time.
      Bemærk: På grund af produktionsprocessen, dorsale substrater har en udpegede øverste og nederste sider, fordi opløsningsmidler støbt film og elektrospundne fibre de er knyttet til en af ​​siderne af skiven. Denne side er derfor en mod cellerne (figur 3).
      1. Efter proteinet belægning, vaskes prøverne to gange med DPBS med henblik på at fjerne protein i overskud. Derefter inkuberes prøver i DPBS indtil deres anvendelse for at forhindre prøver i at få tørt, da dette forårsager protein denaturalization. Brug DPBS indeholdende Ca2 + og Mg2 + siden divalente kationer regulerer proteinfoldning.
    3. Seed celler på dækglas 13.
      Bemærk: Som sandwich-lignende kultur er baseret på 2D-substrater, vil cellepodning udføres på samme måde som på en 2D prøve. For eksempel er C2C12 myoblast podet ved 17.500 celler cm-1 for differentiering eksperimenter og NIH3T3 fibroblast podes ved 7.000 calen cm-1 for isolerede kulturer at studere cellemorfologi og vedhæftning.
    4. Placere prøverne i en inkubator ved 37 ° C med 5% CO2 og tillade celler at holde sig til den ventrale substrat i 3 timer.
    5. Placer ventrale podede substrat i en ny brønd i en 12 multi-brønds plade (hvor skiver passer).
      Bemærk: Samling af sandwich-lignende kultur i en ny brønd er en måde at slippe af med de celler, som har klæbet til bunden af ​​brønden, efter såning, da disse vil forbruge næringsstoffer og udskiller vækstfaktorer og affald, der påvirker cellerne dyrket i sandwich-lignende system. Dette er også et must for cellulære ekstraktioner for at lysere kun de celler dyrket i sandwich-lignende miljø.
    6. Omhyggeligt og med hjælp af en pincet, overlejre dorsale substrat på cellerne. Refill med medium (1 ml) og inkuberes ved 37 ° C med 5% CO2.
      Bemærk: Vægten af ​​skiven vil forhindre den dorsale substrere fra flydende.
    7. Skift mediet to gange om ugen som i standard 2D kulturer. Flyt ikke dorsale substrat, da dette kan medføre skader celle.
  2. Saml sandwich-lignende kultur lige efter cellepodning.
    1. Arbejde i en kultur hætte til at sikre sterile forhold, og der steriliseres alle materialer (dækglas, dorsale substrater, pincetter, etc.) ved UV-eksponering i 30 min.
    2. Coat den ventrale og dorsale substrat med fibronectin for at lede bestemt celle-protein adhæsion. For at gøre dette, inkuberes prøverne i 20 ug / ml fibronectin opløst i DPBS indeholdende Ca2 + og Mg2 + (200 ul / prøve) i 1 time.
      1. Efter proteinet belægning, vaskes prøverne to gange med DPBS med henblik på at fjerne protein i overskud. Derefter inkuberes prøver i DPBS indtil deres anvendelse for at forhindre prøver i at få tørt, da dette forårsager protein denaturalization. Brug DPBS indeholdende Ca2 + og Mg
    3. Seed celler på dækglas i en brønd af en 12 multi-brønds plade (hvor skiver passer). For at gøre dette, skal du bruge en meget koncentreret cellulær suspension at undgå celletab efter lægning dorsale substrat.
    4. Omhyggeligt og med hjælp af en pincet, overlejre dorsale substrat på cellerne. Refill med medium (1 ml) og inkuberes ved 37 ° C med 5% CO2.
      Bemærk: Vægten af ​​skiven vil forhindre dorsale underlag fra flydende.
    5. Skift mediet to gange om ugen som i standard 2D kulturer.
      Bemærk: Flyt ikke dorsale substrat, da dette kan medføre skader celle.

3. Analyse

Bemærk: Sandwich-lignende kulturer er baseret på 2D-substrater, og så kan almindeligvis analyseres ved procedurer allerede er udviklet til standard 2D kulturer. For eksempel, da PLLA er gennemsigtig og cells er begrænset til at bevæge sig inden for xy-planet, er mikroskopi udført som på 2D substrater. Cellemigration kan derfor analyseret som for 2D kulturer, uden behov for at spore celler i z-aksen som for 3D-kulturer, hvilket forenkler eksperimentet og billedanalyse. For at undersøge sårheling analysen af ​​en ridse assay følge denne protokol:

  1. Undersøgelse cellevandring (sårheling assay) i sandwich-lignende kultur.
    1. Arbejde i en kultur hætte til at sikre sterile forhold, og der steriliseres alle materialer (dækglas, dorsale substrater, pincetter, etc.) ved UV-eksponering i 30 min.
    2. Coat den ventrale og dorsale substrat med fibronectin for at lede bestemt celle-protein adhæsion. For at gøre dette, inkuber prøverne i 20 ug / ml fibronectin opløst i Dulbeccos phosphatbufferet saltvand (DPBS) indeholdende Ca2 + og Mg2 + i 1 time.
      1. Efter proteinet belægning, vaskes prøverne to gange med DPBSfor at fjerne protein i overskud. Så inkuberes prøver i DPBS indtil deres anvendelse for at forhindre prøver fra at få tørt, da dette kan forårsage protein denaturalization. Brug DPBS indeholdende Ca2 + og Mg2 + siden divalente kationer regulerer proteinfoldning.
    3. Frøceller på dækglas og med stor tæthed 13.
    4. Placere prøverne i en inkubator ved 37 ° C med 5% CO2 og tillade celler at opnå konfluens.
    5. Brug en pipettespids at ridse cellemonolaget for at få 2 cellepopulationer adskilt af et mellemrum.
    6. Placer ventrale podede substrat i en ny brønd egnet til time-lapse erhvervelse og hvor dorsale substrater passer (dvs. 12 multi-brønds plade).
    7. Omhyggeligt og med hjælp af en pincet, overlejre dorsale substrat på cellerne og derefter fylder med medium (1 ml i en 12 multi-brønds plade).
      Bemærk: Vægten af ​​vaskemaskinen vil forhindre than dorsal substrat fra flydende.
    8. Prøven anbringes i time-lapse mikroskop (indstillet til 37 ° C og 5% CO2) og tage billeder af hullet lukning hver 20 min.
    9. Analyser udbedring via bestemte software som plugin MiToBo fra ImageJ. 14

Bemærk: Protein og nukleinsyre ekstraktion foretages på samme måde som på 2D substrater. Der er kun én ekstra trin, der består i at adskille sandwich-lignende kultur for at tilføje en lysisbuffer direkte på cellerne for at øge ekstraktionseffektiviteten. For eksempel til mRNA ekstraktion:

  1. Uddrag mRNA fra Sandwich-lignende kulturer
    1. Forberede alle bufferne fra den kommercielle kit ifølge producentens instruktioner.
    2. Tag sandwich-lignende kultur ud fra inkubatoren.
    3. Fjern dyrkningsmedierne fra prøverne.
    4. Vask prøverne gang med DPBS indeholdende Ca2+ og Mg 2+ (1 ml), og fjern al opløsningen.
    5. Ved hjælp af en pincet, fjern dorsale substrat og tilsæt lysisbuffer (350 pi) til den ventrale substrat. Overlay igen den dorsale substrat på den ventrale substrat med henblik på også at lysere cellerne adhærerede til det dorsale substrat.
    6. Fjern den dorsale substrat for at isolere lyseopløsning.
    7. Følg producentens anvisninger for at få mRNA.

Bemærk: Immunodetektion af proteiner, kan også udføres som på 2D substrater. Idet sandwich-lignende kulturer kunne hindre korrekt diffusion af antistofferne og puffere, bør øges inkubationstider. Desuden kan sandwich skilles ad, før de starter farvningsprotokol men i dette sidstnævnte tilfælde nogle celler vil forblive fastgjort til den dorsale substrat og nogle til den ventrale substrat.

  1. Immunodetect proteiner i en sandwich-lignende kultur Vask prøven en gang med DPBS og fastgør med 4% formaldehyd i PBS i 20 minutter ved 4 ° C.
    Bemærk: Dorsal substrat kan fjernes under fikseringen, således at diffusion problemer undgås.
  2. Skyl med DPBS (1 ml) og derefter permeabilisere med 0,5% Triton X-100 i DPBS (1 ml) i 5 minutter ved stuetemperatur.
  3. Blokere ikke-specifikke bindingssteder med 1% albumin i DPBS (1 ml) i 30 minutter ved stuetemperatur.
  4. Inkuber med primært antistof (2 pg / ml; 1 ml) i blokerende opløsning i 3 timer ved stuetemperatur.
  5. Vask 3 gange i 10 minutter med DPBS / 0,5% Tween 20 (1 ml).
  6. Inkuber 2 timer med sekundære antistoffer (2 ug / ml) og 1 ug / ml DAPI i blokerende opløsning (1 ml) ved stuetemperatur.
  7. Vask 3 gange i 10 minutter i DPBS / 0,5% Tween 20 (1 ml).
  8. Vask i DPBS.
    Bemærk: Prøver kan monteres på et objektglas med Vectashield og forseglet med neglelak når dorsale substrater fjernes før immunpåvisningen.
  9. Observation i fluorescensen mikroomfang som for standard 2D substrater.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Stimulering af dorsale receptorer i sandwich-lignende kultur udløser ændringer i cellemorfologi, celleadhæsion og intracellulære signalveje (f.eks fokal adhæsion kinase, FAK) 10-12. Som et eksempel, fibroblaster dyrket i sandwich-lignende system overudtrykt den α 5 integrin subunit forhold til 2D, som observeret for andre 3D kulturer 15,16.

Celleskæbnen er meget afhængig af det tidspunkt, hvor dorsale receptorer stimuleres og af egenskaberne af den dorsale interaktion, på samme måde som det sker i andre 3D-systemer, såsom hydrogeler. For eksempel hydrogeler hvor proteiner er tæt bundet normalt vise mindre og afrundede celler med uudviklet actincytoskelettet og diffus fokale sammenvoksninger. Dette kan efterlignes i en sandwich-lignende kultur under anvendelse substrater, der adsorberer proteiner stramt, således at cellerne ikke er i stand til mekanisk at reorganisere dette lag af proteiner og celle Spreading hindres. Tilsvarende kan hydrogeler hvor celler kan remodel ECM efterlignes med sandwich systemet ved at anvende substrater, der adsorberer proteiner mere løst 10.

Den stimulering af den dorsale receptorer har vist sig at modulere C2C12 celle skæbne. Dorsal elektrospundne PLLA fibre alignment direkte celle, når coatet med fibronectin, men ikke når de er belagt med bovint serumalbumin (en ikke-klæbende protein). Dette resultat påpeger celler gør biologisk forstand og reagere på dorsale indgange (figur 4) 9. Derudover sandwich-lignende kulturer med plane dorsale PLLA udløste en stigning i niveauet af myogenese. Det afhænger også af den dorsale biologiske stimuli, da samspillet med forskellige dorsale proteiner resulterer i distinkte differentiering satser (figur 5) 9.

Cellemigration i sandwich-lignende kultur ændres også ved ændringer i forhold til 2D kultur. Det har væreOr vist, at i en sårhelende assay celler i sandwich kultur vedtage en meget langstrakt morfologi og migrere kortere afstande end på 2D substrater (film 1 og 2). Celle migrationshastigheder er desuden relateret til arten af den ventrale og dorsale stimulation 12.

På samme måde som inden for 3D-fibronectin og kollagen geler 17,18, sandwich-lignende kultur øger cellemedieret ECM reorganisering (dvs. den ventrale fibronectin) i forhold til 2D tilstand (figur 6) 12. Denne proces er afhængig af den dorsale mekaniske stimuli og cytoskelet stabilitet, da brugen af ​​kontraktilitet inhibitorer (Blebbistatin, Y27632) hindrede processen. Interessant nok blev den ventrale fibronectin også reorganiseret ved at bruge forskellige dorsale protein belægninger (dvs. vitronectin og bovint serumalbumin) og selv hvis venstre uovertrukket 12.


Figur 1:.. Skitse af standard (2D) og sandwich-lignende kulturer Stimulation af dorsale receptorer i sandwich-lignende kultur udløser ekstra celleadhæsion signalering, der modulerer vigtige cellulære processer Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2: Sandwich-lignende kultur er et alsidigt system, der tillader studiet af forskellige velkontrollerede parametre (topografiske indgange, stivhed, gradienter ...) på begge de ventrale og dorsale substrater.


Figur 3:. Dorsal substrater skitseret for både toppen og tværsnit for at viser, at have en udpeget top og bund side (A) Flat PLLA film og (B) elektrospundne fibre.

Figur 4
Figur 4:. C2C12 morfologi under forskellige dyrkningsbetingelser, herunder plan (p), og justeret fibre (a) i PLLA, der blev brugt som ventrale (sænket) eller dorsal (hævet) substrater Stiplede linjer repræsenterer fibre orientering, når det er nødvendigt. Celler dyrket på flyet substrat og overlejret med justeret fibre af PLLA (SW p a) forstand dorsale stimuli. Især celler fornemmer den dorsale fibre, når overtrukket med fibronectin men ikke når overtrukne with bovint serumalbumin (en ikke-klæbende protein). Følgelig celler klæbe til fibrene overtrukket med fibronectin og tilpasse i samme retning. Billede tilpasset fra henvisning 9. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5: Cell differentiering i sandwich-lignende kulturer efter 4 dage i differentiering medier. Forskellige dyrkningsbetingelser blev analyseret herunder plan (p), og flugtende fibre (a), i PLLA der blev anvendt som ventrale (sænket) eller dorsal (hævet) substrater. Prøver blev overtrukket med fibronectin i alle tilfælde. (A) Fluorescensfarvning viser sarcomerisk myosin positive celler (grøn) og cellekerner (rød). (B) Differentieretceller orientering som beregnet ved Fast Fourier Transform. (C) myogenese som bestemt ved den procentdel af sarcomerisk myosin-positive celler. Dataene er normaliseret til guldstandarden kontrol. Statistisk signifikante forskelle er angivet med *** P <0,001. Billede tilpasset fra henvisning 9. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6
Figur 6: Reorganisering af ventrale fibronektin. Sandwichkultur udløser ventral FN omorganisering ved at danne nye fibronectin fibriller (børste-lignende mærkning påpegede med hvide pile). Ventrale fibronectin reorganiseres inden sandwich-lignende kulturer med forskellig dorsale protein belægning (fibronectin, vitronectin og bovint serumalbumin)eller selv når den dorsale substratet efterlades uovertrukne. Actincytoskelettet (grøn), kerner (blå) og FN (rød) er vist. Klik her for at se en større version af dette tal.

Film 1: Cell migration på 2D. L929 fibroblast migrerer på en fibronectin belagt dækglas i en sårhelende assay. Billeder er erhvervet for 16 timer (med en ramme taget hver 20 min). Klik her for at se denne video.

Film 2:. Cell migration inden for sandwich-lignende kultur L929 fibroblast migrerer i en sårhelende assay højst en sandwich-lignende kultur var den ventrale substrat var en fibronectin overtrukket dækglas og den dorsale substratet et fibronectin overtrukket PLLA film. Billeder blev erhvervet for 16 timer (med en ramme taget hver 20 min). Klik her for at se denne video.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I dag, 3D kulturen er et vigtigt emne for den farmaceutiske og bioteknologiske industri samt forskning i cellebiologi, herunder kræft og stamceller. Som følge heraf er der udviklet flere 3D dyrkningssystemer. Desværre, forskelle mellem de 3D-systemer som regel resultere i forskellige celle adfærd, hindrer forståelsen af ​​cellens skæbne. Desuden eksperimentelle procedurer er normalt ikke så ligetil som for 2D dyrkningssystemer. Dermed udvikle nye dyrkningssystemer, der søger at overvinde nogle af disse ulemper er meget vigtigt.

Sandwich-lignende kultur har vist sig at kraftigt påvirke de centrale cellulære processer såsom celledifferentiering, cellemorfologi, cellesignalering og cellemigration. Desuden celler deler ligheder med celler dyrket i 3D-systemer, der understøtter påstanden om, at sandwich-lignende kultur forbinder 2D med 3D kultur systemer. Fysiologiske væv har porer i området fra 3 til 14 μm, der tvang celler og derfor påvirke cellulære processer såsom migration. Dette er en måde sammenfattet ved hjælp af sandwich-lignende system dorsale og ventrale stimuli repræsenterer i sig selv en begrænset miljø, der begrænser cellemorfologi og vil nødvendigvis påvirke cellemigration uanset protein belægninger.

På grund af den samtidige stimulering af dorsale og ventrale receptorer, sandwich-lignende kultur er en robust teknik til at undersøge den rolle, dimensionalitet i celle adfærd. Desuden, da det er baseret på 2D-substrater, dette dyrkningssystem er meget alsidig at studere forskellige materialeegenskaber og ECM indgange muliggør studiet af celle adfærd under forskellige mikromiljøer. Desuden kan indflydelsen af ​​det tidspunkt, hvor dorsale receptorer stimuleres på celleskæbnen undersøges ved overlejring den dorsale substratet på forskellige tidspunkter. Derfor, i modsætning til andre 3D-systemer, sandwich-lignende system giver et bredt spektrumaf velkontrollerede cellulære mikromiljøer. Følgelig sandwich-lignende system er en interessant cellekultur platform til at efterligne forskellige fysiologiske omgivelser for at studere cellebiologi og testcelle skæbne under forskellige dyrkningsbetingelser.

Som nævnt før, en fordel ved dette system er, at forskellige ventrale og dorsale substrater kan studeres ved anvendelse af forskellige protein-belægninger. Derfor kan vigtige parametre for celleskæbnen såsom liganddensitet indstilles ved at styre liganddensitet i hver af de 2D anvendte substrater (f.eks ventrale og dorsale substrater). Bemærk dog, at forskellige substrater kan have brug for ændringer i protokollen. For eksempel kan ved anvendelse af større dorsale substrater resultere i et behov for at indstille den korrekte inkubationstid at skrælle prøverne fra petriskålen. Ligeledes kunne større ventrale substrater resultere i hypoxiske områder i centrum af prøven på grund af den begrænsede oxygenpermeabilitet af ventralesubstrat (som følge af dækglas). Derudover vil analyseprocedurer afhænge af substrat egenskaber. For eksempel vil anvendelse af uigennemsigtige substrater dorsale hindre standard mikroskopi protokoller selvom det stadig vil tillade protein / nukleinsyrer ekstraktion. En anden vigtig faktor er permeabiliteten af ​​dorsale substrat, da celler skal have lov til at få næringsstoffer fra mediet og kassér affald.

Sammenfattende en sandwich-lignende kultur er et enkelt system, der giver mulighed for at efterligne forskellige 3D-lignende mikromiljøer at undersøge celle skæbne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ploy(lactic acid) NatureWorks 4042D Reagent
Cover glasses (12 mmØ) Marienfeld 631-0666 Equipment
Chloroform Scharlab CL0200 Reagent
1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP) Sigma 105228 Reagent
Syringe (1 ml) Henke Sass Wolf 4010-200V0 Equipment
Syringe pump New Era Pump Systems NE1000 Equipment
High Voltage DC Power Supply Glassman High Voltage Series FC Equipment
Incubator Hucoa-Herlös 3111 Equipment
Laminar flow  hood Telstar AV30/70 Equipment
Human Fibronectin Sigma F2006 Reagent
RNeasy Micro Kit Qiagen 74004 Reagent
Inverted microscope Leica Microsystems DMI 6000 Equipment
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 Reagent
Albumin Sigma-Aldrich A7409 Reagent
Tween 20 Sigma-Aldrich P2287 Reagent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J Cell Sci. 125 (Pt 13), 3015-3024 (2012).
  2. Weiss, P. Rev. Mod. Phys. 31 (1), 11-20 (1959).
  3. Ruffner, H., Lichtenberg, J. 3D cell culture systems--towards primary drug discovery platforms: an interview with Heinz Ruffner (Novartis) and Jan Lichtenberg (InSphero). Biotechnol J. 7 (7), 833-834 (2012).
  4. Horning, J. L., et al. 3-D tumor model for in vitro evaluation of anticancer drugs. Mol Pharm. 5 (5), 849-862 (2008).
  5. Wolf, K., et al. Compensation mechanism in tumor cell migration: mesenchymal-amoeboid transition after blocking of pericellular proteolysis. J Cell Biol. 160 (2), 267-277 (2003).
  6. Schor, S. L., et al. A novel 'sandwich' assay for quantifying chemo-regulated cell migration within 3-dimensional matrices: wound healing cytokines exhibit distinct motogenic activities compared to the transmembrane assay. Cell Motil Cytoskeleton. 63 (5), 287-300 (2006).
  7. Lee, E. J., Hwang, C. M., Baek, D. H., Lee, S. H. Fabrication of microfluidic system for the assessment of cell migration on 3D micropatterned substrates. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2009 (2009), 6034-6037 (2009).
  8. Zaman, M. H., et al. Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (29), 10889-10894 (2006).
  9. Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Salmerón-Sánchez, M. Dorsal and ventral stimuli in sandwich-like microenvironments. Effect on cell differentiation. Biotechnol Bioeng. 110 (11), 3048-3058 (2013).
  10. Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Moratal, D., Salmerón-Sánchez, M. Fibronectin-matrix sandwich-like microenvironments to manipulate cell fate. Biomater. Sci. 2 (3), 381-389 (2014).
  11. Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Rico, P., Salmerón-Sánchez, M. Dorsal and ventral stimuli in cell-material interactions: effect on cell morphology. Biointerphases. 7 (1-4), 39 (2012).
  12. Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Rico, P., Salmerón-Sánchez, M. Cell migration within confined sandwich-like nanoenvironments. Nanomedicine. , (2015).
  13. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Passaging Cells. J. Vis. Exp. , (2015).
  14. Glaß, M., et al. Cell Migration Analysis: Segmenting Scratch Assay Images with Level Sets and Support Vector Machines. Pattern Recogn. 45 (9), 3154-3165 (2012).
  15. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
  16. Huebsch, N., Arany, P. R., Mao, A. S., et al. Harnessing traction-mediated manipulation of the cell/matrix interface to control stem-cell fate. Nat. Mater. 9 (6), 518-526 (2010).
  17. Petrie, R. J., Gavara, N., Chadwick, R. S., Yamada, K. M. Nonpolarized signaling reveals two distinct modes of 3D cell migration. J Cell Biol. 197 (3), 439-455 (2012).
  18. Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. Stimulatory effects of a three-dimensional microenvironment on cell-mediated fibronectin fibrillogenesis. J Cell Sci. 118 (Pt 19), 4427-4436 (2005).

Tags

Bioengineering Sandwich kultur 3D kultur cellekultur fysiologiske cellulære miljø bioteknologi
Sandwich-lignende mikromiljøer at udnytte Cell / Materiale Interactions
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ballester-Beltrán, J., Lebourg, … More

Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Salmerón-Sánchez, M. Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions. J. Vis. Exp. (102), e53090, doi:10.3791/53090 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter