Abstract
Utarbeidelse av kromosom sprer er en forutsetning for en vellykket gjennomføring av fluorescens in situ hybridisering (FISH). Fremstilling av høykvalitets plantekromosom sprer er utfordrende på grunn av den stive celleveggen. En av de godkjente metoder for fremstilling av plantekromosomer er en såkalt slipp-preparatet, også kjent som rulle spredning eller lufttørkende teknikk. Her presenterer vi en protokoll for rask tilberedning av mitotisk kromosom sprer egnet for FISH påvisning av single og høye kopi DNA-prober. Denne fremgangsmåte er en forbedret variant av den lufttørke slipp-metoden utføres under en relativ fuktighet på 50% -55%. Denne protokollen består av et redusert antall vasketrinn som gjør dens anvendelse enkel, effektiv og reproduserbar. Åpenbare fordeler ved denne tilnærmingen er godt spredt, uskadde og mange metafase kromosomer fungerer som en perfekt forutsetning for vellykket FISH analyse. Ved hjelp av denne protokollen vi oppnådd høy kvalitet kromOSOME sprer og reproduserbare FISH resultater for Hordeum vulgare, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum og Rug cereale.
Introduction
Fluorescens in situ hybridisering (FISH) er et effektivt verktøy for kartlegging av fysiske enkelt- og høye kopisekvenser ved kromosomal nivå. Forutsetning er utarbeidelsen av høy kvalitet kromosom oppslag. Det er ingen generell kromosom forberedelse protokoll som ville være like egnet for dyre- og planteceller. Utarbeidelse av plante kromosomer er spesielt utfordrende på grunn av den stive celleveggen og ulike cytoplasma konsistens innenfor ulike arter. Et av de fordelaktige metoder for fremstilling av plantekromosomer er en såkalt slipp også kjent som drop-spredningsteknikk og luft-tørking 1,2 teknikk. Denne metoden ble først introdusert i 1958 av Rothfels og Siminovitch for in vitro dyrkede pattedyrceller 3. Senere Martin et al. 4 og Kato et al. 5 er tilpasset denne fremgangsmåte for planter.
Flere nylig, en metode kalt "SteamDrop &# 39; ble utviklet som anvendt vanndamp for fremstilling av ikke-overlappende kromosomer 6. Selv ble positiv påvirkning av høy luftfuktighet observert tidligere 7, 'SteamDrop' leverer en styrt arbeidsflyt høykvalitets kromosompreparater 6. Dampbehandling fører til strekking av kromosomer trolig koblet til noen endringer av kromosom proteiner. Kvaliteten resulterende metafase sprer er meget høy, selv om fastsetting av tilstrekkelig antall kompmeta sprer seg for etterfølgende eksperimenter FISH krever teknisk ekspertise.
Her presenterer vi en protokoll for utarbeidelse av mitotiske korn kromosomer egnet for FISH påvisning av single og høy kopi sonder 5,8. Denne fremgangsmåte er en forbedret variant av den lufttørke dråpemetoden er beskrevet av Kato 9 utføres under relativ fuktighet på 50% -55% (figur 1). Denne protokollen består av et redusert antallav vasketrinn gjør sin søknad enkel, effektiv og reproduserbar. Ved hjelp av denne protokollen vi oppnådd høy kvalitet kromosom sprer og FISH resultater for Hordeum vulgare, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum og Rug cereale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Chromosome Forberedelse
- Frø spiring og fiksering av rotspissene
- Spire 10-20 bygg frø på to lag med fuktig filter papir i en petriskål under mørke forhold i 2 dager ved 22-24 ° C. Avskåret kraftige røtter med lengden på 1-2 cm fra frø ved hjelp av et barberblad.
- Forbered iskaldt vann ved å plassere en 500 ml glassflaske som inneholder kaldt vann fra springen i knust is-vann. Luft iskaldt vann og lev rot tips i 20 timer for å øke hyppigheten av metafase celler.
- Overfør røtter fra vann til 50 ml etanol: eddiksyre (3: 1) for fikseringsmiddel for å feste dem ved RT i 2 dager. Oppbevar røtter i en nylaget etanol: eddiksyre (3: 1) fiksativ ved 4 ° C inntil bruke opp til ett år.
- Vasking og enzymbehandling
- Vask 10-20 røttene med 30 ml iskaldt vann fra springen i 5 min to ganger ved hjelp av en 50 ml begerglass. Bruk kikkert mikroskop. Overfør røtter en etter en inn30 ml 0,01 M citratbuffer (0,01 M sitronsyre + 0,01 M natriumsitrat, pH 4,8) under anvendelse av pinsett og vaskes ved å riste den begerglass i 5 min to ganger. Plasser røtter på filterpapir for å fjerne væsken helt og cut-off uønsket non-meristematic vev ved hjelp av et barberblad.
- Inkuberes opptil 20 rotspisser i 1 ml enzym-blanding ved 37 ° C i ca 50 min for å mykne plantevevet (tabell 1) i et urglass. Enzymblanding inneholder 0,7% cellulase R10, 0,7% cellulase, 1% pectolyase og 1% cytohelicase fortynnet i 0,01 M citratbuffer. Oppbevar enzymblanding ved -20 ° C og brukes på nytt opp til fem ganger.
- Fjern enzymet ved pipettering og vaske rotspissene på is med 5 ml 0,01 M citratbuffer to ganger for å skifte ut den gjenværende enzym.
- Root maserasjon
- Vask root tips med en ml 96% etanol to ganger nøye i samme urglass. Erstatte etanol med nylaget fiksativ (75% eddiksyre: 25% etanol). Bruk 10-15ul fiksativ per rotspissen.
- Transfer rotspissene sammen med fiksativ i en 2 ml tube og desintegrerer rot meristemer med en dissekere nål eller pinsett. Tapp røret 20 ganger for å resuspendere cellene for å oppnå en cellesuspensjon. Oppbevar cellesuspensjonen ved -20 ° C i opptil to måneder.
- Dropping av cellesuspensjonen
- Plasser 2-3 lag av vann-fuktet papir vev på en varm plate ved 50 ° C. Fordyp mikroskopiske lysbilder i iskaldt vann fra springen i kjøleskapet i 30 minutter. Og sted glir på toppen av fuktig papir vev.
- Pipetter 7-10 mL cellesuspensjon og slippe det fra en avstand på 20 cm på den avkjølte lysbildet plasseres på den varme platen. Pipetter 10 ul eddiksyre-etanol-blanding på samme sted som cellesuspensjon på sleiden og holde sleiden på den varme plate i ytterligere 2 min. Plasser lysbildet på kokeplate uten vått vev og la det tørke i 1 min.
- Kvalitetskontroll og storage lysbilder
- Kontroller lysbilder ved hjelp av et fasekontrastmikroskop for å kontrollere kvaliteten på kromosomet spredning. Bruk lysbilder enten samme dag eller butikken ved å dyppe i 96% etanol i en Coplin krukke ved -20 ° C.
- Forbehandling av lysbilder før FISH; Alle trinn utføres ved romtemperatur
- Plasser glir i en krukke som inneholdt Coplin 50 ml 2 x SSC (20 x SSC inneholder 3 M NaCl og 300 mM trinatriumcitrat) i 5 min. Bruk pinsett, overføre lysbilder til en Coplin krukke inneholder 50 ml 45% eddiksyre for 3-10 min.
- Overføring glir i en krukke som inneholdt Coplin 50 ml 2 x SSC i 10 min. Overfør lysbilder til en Coplin krukke inneholder 50 ml 4% formaldehyd (i 2x SSC) og fordype lysbilder for 10 min å fikse kromosomer.
- Fjerne formaldehyd ved å skylle skinnene 3 ganger i 4 minutter hver, i en Coplin krukke inneholdende 50 ml 2 x SSC. Dehydrere glir i en Coplin krukke i 2 minutter i serie med 70%, 90% og 100% etanol, henholdsvis tørr og glir i en vertikalstilling.
2. Fluorescent In Situ Hybridisering (FISH)
- For hvert bilde, fremstille en hybridisering oppløsning av 20 ul samlet ved hjelp av 10 ul avionisert formamid, 5 pl 4 x hybridiseringsbuffer (200 ul buffer inneholder 80 ul 20 x SSC, 8 pl 1 M Tris-HCl pH 8,0, 1,6 pl 0,5 M EDTA, 11,2 ul 10 ug / ul laksemelke og 99,2 mL DNase-fritt vann), 3 ul av probe og 2 ul av DNase-fri vann.
- Tilsett 20 mL av hybridisering løsning per lysbilde og dekselet med en 24 x 32 mm dekkglass og arrestere dekkglass med gummi sement. Denaturering slides med prober samtidig ved 80 ° C i 2 minutter på en varm plate.
- Overføring lysbilder til en fuktig kammer og inkuber lysbilder ved 37 ° CO / N unngå lys. Fjern dekkglass ved å skylle lysbilder i en Coplin krukke med 2x SSC. Plasser lysbilder i en Coplin krukke som inneholder 55-60 ° C 2x SSC og inkuberes i 20 min.
- Plasser lysbildene til 2x SSC i en Coplin krukke i 2 min ved RT. Dehydrere lysbilder i en Coplin krukke i 2 minutter i serie med 70%, 90% og 100% etanol, henholdsvis.
- Luft-tørke lysbilder og farge med en mikrogram / ml 4 ', 6-diamidino-to-phenylindoline (DAPI) i antifade montering medium, unngå intens lys.
3. Mikroskopisk Analyse og Lagring
- Analyser lysbilder ved hjelp av en epifluorescence mikroskop. Utvelgelsen av filteret avhenger av fluorokrom anvendes for merking av probe. Om nødvendig, lagre lysbilder ved 4 ° C under mørke forhold opptil et år.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mikroskopiske objektglass med mitotiske metafase sprer ble fremstilt ved den raske lufttørke dråpe kromosom fremstillingsmetode som er beskrevet ovenfor (Suppl. Figur 1). FISH-analyse ble utført med begge, repetitive og løssalgs sekvenser. Bilder ble oppnådd ved en epifluorescens mikroskop med et sett av filtre muliggjør eksitasjon av tilsvarende fluoroforer og fanges opp av en høy følsomhet CCD-kamera monokrom. For bildet oppkjøpet brukte vi en datamaskin med et bilde oppkjøpet programvare. Resultater av fisken eksperimenter på mitotisk metafase kromosomer bruker 5S rDNA, [CTT] 10, og løssalgs prober var tydelig og av høy kvalitet for Hordeum vulgare (Figre 2A, B), H. bulbosum (figur 2C), H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum og Rug cereale (figur 2D). Åpenbare fordeler ved denne tilnærmingen er godt spredt, uskadet og mange møtte aphase kromosomer fungerer som en perfekt forutsetning for vellykket FISH analyse. Det er mulig å lagre cellesuspensjonen ved -20 ° C opp til to måneder, og for å fremstille kromosomet sprer seg på dagen for FISH eksperimentet. Nylagde lysbilder kan også lagres ved -20 ° C i 96% etanol, selv om vi har observert at kvaliteten på hybridiseringssignaler på slike kromosomer er redusert i forhold til de nylagede metafase sprer seg. Metodene som kan anvendes for å fremstille høykvalitets kromosom oppslag i blandinger på en enkel, effektiv og reproduserbar måte, og mest sannsynlig kan bli brukt i andre plantearter også.
Figur 1. En ordning som beskriver fremgangsmåten i lufttørke dråpe anlegg kromosom fremstillingsmetode.
es / ftp_upload / 53470 / 53470fig2.jpg "/>
Figur 2. FISH på mitotisk metakromosom sprer av Hordeum vulgare, H. bulbosum og Rug cereale utarbeidet av lufttørke slippe metoden. (A) H. vulgare med ett eksemplar probe (FPct_40752) merket med en rød fluorescerende fargestoff. (B) H. vulgare med 5S rDNA probe merket med et grønt fluorescerende fargestoff. (C) H. bulbosum med CTT-mikro merket med et grønt fluorescerende fargestoff og (D) S. cereale med pSc119.2 gjenta merket med et grønt fluorescerende fargestoff. Alle kromosomer ble kontra med DAPI (i rødt). FISH-signaler er vist i gult. Scale bar = 10 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av denne Figure.
Tabell 1. Inkubasjonstid for enzymbehandling for forskjellige arter.
Suppl. Figur 1. Fase-kontrast og kontrast differensial forstyrrelser (DIC) bilder av mitotisk metafase kromosom sprer av lufttørke slippe anlegget kromosom forberedelse metode på eksempel på Hordeum vulgare. (A) Fase-kontrast bilde tatt på 200X forstørrelse og (B) Differential interferens kontrast bilde tatt ved 630x forstørrelse. Vennligst klikkher for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kromosomet preparatet Forsøket er blitt utført ved hjelp av små røtter av korn som tilhører gressfamilien (Poaceae). Alle artene har 14 relativt lang mitotiske metafase kromosomer (11-15 mikrometer) i diploid genomet sett og tilhører storgenom arter (05.01 til 07.09 GBP).
Lengden av spirede røttene var ikke mer enn 2 cm for å oppnå et maksimalt meristematic vev. Synkronisering av delende celler ble oppnådd ved en 20 timer lang isvann behandling som forbedret mengde av mitotiske meta sprer 10.
To trinn er viktig for fremstillingen av høykvalitets kromosom forbindelser: (I) den relative fuktighet på 50% -55%, og (II) varighet av enzymbehandling. Det første punktet ble oppnådd ved å anbringe fuktige papirhåndklær på en varm plate i nærheten av de glassplater. Den relative fuktighet ble målt med et hygrometer. Den optimale fuktighet for fremstilling av plantekromosomer var lik den fuktigheten rapportert av Kirov et al. 6. Den positive effekt på kromosomet kvalitet til optimal relativ fuktighet oppstår ved svelling av cytoplasma og celleveggen hydrolyse.
Varigheten av enzymbehandling er artsavhengig (tabell 1). Perioden for enzymbehandling er også avhengig av tidsrommet for rot fiksering i etanol / eddiksyre og størrelsen av røttene. De lengre røtter ble lagret i fiksativ (opptil 1 år ved 4 ° C), jo lenger tid det tar å fordøye røtter til riktig klasse. Utilstrekkelig fordøyd rotmateriale er vanskelig å macerate og vil øke den totale tiden for forberedelse som et resultat av langvarig maserasjon. Videre forbli metafase kromosomer innebygd i cytoplasma som kunne hemme påfølgende sonde penetrering under FISH forsøket. På den annen side over-spaltet materiale kan påvirke strukturen av kromosomene i seg selv, og skaden målet DNEn for FISH analyse.
En ytterligere faktor for forbedring av preparatet er bruken av den andre dråpe fiksativ (3: 1 eddiksyre / etanol). Høy konsentrasjon av eddiksyre i denne blandingen stimulerer fordøyelsen av cytoplasma og fremmer kromosom sprer seg i arter med store kromosomer. Cytoplasma reduksjon kan også skje etter immobilisering av kromosomene på lysbilder. For dette formål objektglass som bærer de kromosom sprer kan inkuberes i 45% eddiksyre ved romtemperatur i 2-10 minutter, avhengig av cytoplasma-nivå. Kvalitetssjekk av kromosom sprer ble utført med et fasekontrastmikroskop uten tilleggs flekker (f.eks 1% aceto-Carmin). Normalt mer enn 25 objektglass inneholdende høy kvalitet på kromosom sprer kan fås fra 20 røtter ved hjelp av fremgangsmåten ovenfor.
Resultater av fisken eksperimenter på mitotisk metafase kromosomer bruker 5S rDNA, [CTT] 10 og 6 kb lang løssalgs probe (FPct_40752) var tydelig og av høy kvalitet for alle arter som er beskrevet ovenfor (figur 2). Åpenbare fordeler ved denne tilnærmingen er godt spredt, uskadde og mange metafase kromosomer fungerer som en perfekt forutsetning for vellykket FISH analyse. Det er mulig å lagre cellesuspensjonen ved -20 ° C opp til to måneder, og for å fremstille kromosomet sprer seg på dagen for FISH eksperimentet. Nylagde lysbilder kan også lagres ved -20 ° C i 96% etanol, selv om vi har observert at kvaliteten på hybridiseringssignaler på slike kromosomer er redusert i forhold til de nylagede metafase sprer seg.
Kromosom sprer utarbeidet av den raske lufttørke slippe teknikk var egnet for fisk og ble gjengitt en rekke ganger. Kombinasjonen av denne kromosom fremstillingsmetode med fisken kunne bli mye brukt til å utforske genomet organisasjonen i planter, for eksempel, for karyotype 11, Chromosomal mapping 12, i syntetiske studier og for integrering av fysisk og genetisk kart 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hot Plate | MEDAX GmbH | 12603 | |
| Cellulase R10 | Duchefa | C8001 | |
| Cellulase | CalBioChem | 219466 | |
| Pectolyase | Sigma | P3026 | |
| Cytohelicase | Sigma | C8274 | |
| Texas Red-12-dUTP | Invitrogen | C3176 | direct fluorochrome |
| Fluor488-5-dUTP | Invitrogen | C11397 | direct fluorochrome |
| Fluorecsence microscope | Olympus BX61 | BX61 | |
| CCD camera | Orca ER, Hamamatsu | C10600 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Vector Laboratories | H-1200 | fluorecsent dye |
References
- Geber, G., Schweizer, D. Cytochemical heterochromatin differentiation in Sinapis alba (Cruciferae) using a simple air-drying technique for producing chromosome spreads. Pl Syst Evol. 158 (2-4), 97-106 (1988).
- Andras, S. C., et al. A drop-spreading technique to produce cytoplasm-free mitotic preparations from plants with small chromosomes. Chromosome Res. 7 (8), 641-647 (1999).
- Rothfels, K. H., Siminovitch, L. An air-drying technique for flattening chromosomes in mammalian cells grown in vitro. Stain Technology. 33 (2), 73-77 (1958).
- Martin, R., Busch, W., Herrmann, R. G., Wanner, G. Efficient preparation of plant chromosomes for high-resolution scanning electron microscopy. Chromosome Res. 2 (5), 411-415 (1994).
- Kato, A., Albert, P. S., Vega, J. M., Birchler, J. A. Sensitive fluorescence in situ hybridization signal detection in maize using directly labeled probes produced by high concentration DNA polymerase nick translation. Biotech. Histochem. 81 (2-3), 71-78 (2006).
- Kirov, I., Divashuk, M., Van Laere, K., Soloviev, A., Khrustaleva, L. An easy 'SteamDrop' method for high quality plant chromosome preparation. Mol. Cytogenet. 7, 21 (2014).
- Spurbeck, J. L., Zinsmeister, A. R., Meyer, K. J., Jalal, S. M.
- Ma, L., et al. Synteny between Brachypodium distachyon and Hordeum vulgare as revealed by FISH. Chromosome Res. 18 (7), 841-850 (2010).
- Kato, A., Lamb, J. C., Birchler, J. A. Chromosome painting using repetitive DNA sequences as probes for somatic chromosome identification in maize. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 101 (37), 13554-13559 (2004).
- Pan, W. H., Houben, A., Schlegel, R. Highly effective cell synchronization in plant-roots by hydroxyurea and amiprophos-methyl or colchicine. Genome. 36 (2), 387-390 (1993).
- Kim, J. S., et al. Integrated karyotyping of sorghum by in situ hybridization of landed BACs. Genome. 45 (2), 402-412 (2002).
- Lapitan, N. L. V., Brown, S. E., Kennard, W., Stephens, J. L., Knudson, D. L. FISH physical mapping with barley BAC clones. Plant J. 11 (1), 149-156 (1997).
- Aliyeva-Schnorr, L., et al. Cytogenetic mapping with centromeric BAC contigs shows that this recombination-poor region comprises more than half of barley chromosome 3H. Plant J. 84, 385-394 (2015).
