Abstract
Fremstilling af kromosomspredninger er en forudsætning for en vellykket udførelse af fluorescens in situ hybridisering (FISH). Fremstilling af høj kvalitet plante kromosomspredninger er udfordrende på grund af den stive cellevæg. En af de godkendte fremgangsmåder til fremstilling af vegetabilske kromosomer er et såkaldt drop præparat, også kendt som drop-spredning eller lufttørring teknik. Her præsenterer vi en protokol til hurtig tilberedning af mitotiske kromosom spreder egnet til FISH detektering af enkelt og høje kopi DNA-prober. Denne metode er en forbedret variant af den lufttørrede slip-metoden udføres under en relativ fugtighed på 50% -55%. Denne protokol omfatter et reduceret antal vasketrin gør dens anvendelse let, effektiv og reproducerbar. Åbenlyse fordele ved denne tilgang er godt spredt, ubeskadigede og talrige metafasekromosomer tjener som en perfekt forudsætning for en vellykket FISH-analyse. Ved hjælp af denne protokol vi opnået høj kvalitet kromosome spreads og reproducerbare FISH resultater for Hordeum vulgare, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum og Secale cereale.
Introduction
Fluorescens in situ hybridisering (FISH) er et effektivt redskab for den fysiske kortlægning af enkelt og høje kopi-sekvenser på det kromosomale niveau. Forudsætning er forberedelsen af høj kvalitet kromosom opslag. Der er ingen generel kromosom forberedelse protokol, som ville være lige så egnet til dyre- og planteceller. Tilberedning af vegetabilske kromosomer er særligt udfordrende på grund af den stive cellevæg og forskellige cytoplasma konsistens inden for forskellige arter. En af de gunstige fremgangsmåder til fremstilling af vegetabilske kromosomer er et såkaldt drop teknik også kendt som drop-spredningsteknik og lufttørring teknik 1,2. Denne metode blev først introduceret i 1958 af Rothfels og Siminovitch for dyrkede pattedyrceller in vitro 3. Senere Martin et al. 4 og Kato et al. 5 tilpasset denne metode til planter.
Mere for nylig, en fremgangsmåde kaldet 'SteamDrop &# 39; blev udviklet som anvendes vanddamp til fremstilling af ikke-overlappende kromosomer 6. Selv blev observeret den positive påvirkning af høj luftfugtighed tidligere 7, "SteamDrop 'leverer en kontrolleret arbejdsgang af høj kvalitet kromosom præparater 6. Dampen behandling forårsager strækning af kromosomer formentlig er forbundet med visse modifikationer af kromosomale proteiner. Kvaliteten af resulterende metafasespredninger er meget høj, selv om fastholdelse af tilstrækkeligt antal komplette metafasespredninger til efterfølgende FISH eksperimenter kræver teknisk ekspertise.
Her præsenterer vi en protokol til forberedelse af mitotiske korn kromosomer er egnede til FISH detektering af enkelt og høj kopi sonder 5,8. Denne metode er en forbedret variant af fremgangsmåden beskrevet af Kato 9 udføres under en relativ fugtighed på 50% -55% (figur 1) lufttørre nedkastning metode. Denne protokol omfatter et reduceret antalaf vasketrin gør dens anvendelse let, effektiv og reproducerbar. Ved hjælp af denne protokol vi opnåede høj kvalitet kromosom opslag og FISH resultater til Hordeum vulgare, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum og Secale cereale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kromosom Forberedelse
- Frøspiring og fiksering af rodspidserne
- Spire 10-20 bygfrø på to lag af fugtigt filtrerpapir i en petriskål under mørke forhold i 2 dage ved 22-24 ° C. Skær kraftige rødder med længden af 1-2 cm fra frøet ved hjælp af et barberblad.
- Forbered iskoldt vand ved at placere en 500 ml glasflaske indeholdende koldt vand fra hanen i knust is-vand. Luftes det iskolde vand og fordybe rodspidserne for 20 timer for at øge hyppigheden af metafasecellerne.
- Overfør rødder fra vand til 50 ml ethanol: eddikesyre (3: 1) fixativ for at løse dem ved stuetemperatur i 2 dage. Store rødder i en frisk fremstillet ethanol: eddikesyre (3: 1) fixativ ved 4 ° C indtil brug op til et år.
- Vask og enzymbehandlingen
- Vask 10-20 rødder med 30 ml iskold ledningsvand i 5 minutter to gange med en 50 ml bægerglas. Brug binokulært mikroskop. Overfør rødder én efter én ind30 ml 0,01 M citratpuffer (0,01 M citronsyre + 0,01 M natriumcitrat, pH 4,8) under anvendelse af pincet og vask ved at ryste glasbæger i 5 minutter to gange. Placer rødder på filterpapir for at fjerne væsken helt og cut-off uønskede ikke-meristemvæv ved hjælp af et barberblad.
- Inkuber op til 20 rodspidserne i 1 ml enzymblanding ved 37 ° C i ca. 50 min at blødgøre plantevævet (tabel 1) i et urglas. Enzymblanding indeholder 0,7% cellulase R10, 0,7% cellulase, 1% Pectolyase og 1% cytohelicase fortyndet i 0,01 M citratpuffer. Opbevar enzymet blandingen ved -20 ° C og genanvendes op til fem gange.
- Fjern enzymet ved pipettering og vaske rodspidserne på is med 5 ml 0,01 M citratpuffer to gange for at erstatte det resterende enzym.
- Root maceration
- Vask rodspidserne med 1 ml 96% ethanol to gange forsigtigt i den samme urglas. Erstat ethanol med frisklavet fiksativ (75% eddikesyre: 25% ethanol). Brug 10-15pi fiksativ pr rodspids.
- Overførsel rodspidserne sammen med fiksativ i en 2 ml rør og nedbrydes root meristemer med en dissekere nål eller pincet. Tryk røret 20 gange at re-suspendere celler for at opnå en celle suspension. Opbevar cellesuspensionen ved -20 ° C op til to måneder.
- Nedkastning af cellesuspensionen
- Placer 2-3 lag af vandfyldte papirserviet på en varm plade ved 50 ° C. Fordyb mikroskopiske dias i iskoldt vand fra hanen i køleskabet i 30 min. Og sted glider oven på fugtigt papir væv.
- Pipette 7-10 ul cellesuspension og slippe det fra en afstand på 20 cm på den afkølede slide anbragt på varmepladen. Pipette 10 pi eddikesyre-ethanol-blanding på samme sted som cellesuspension på diaset og holde slide på den varme plade til yderligere 2 min. Placer slide på den varme plade uden vådt væv og lad det tørre i 1 min.
- Kvalitetskontrol og opbevare af dias
- Check slides under anvendelse af en fasekontrast-mikroskop for at kontrollere kvaliteten af kromosomet spredning. Brug slides enten samme dag eller butik ved at nedsænke i 96% ethanol i en Coplin-skål ved -20 ° C.
- Forbehandling af dias før FISK; alle trin udføres ved stuetemperatur
- Placer dias i en Coplin-skål, der indeholder 50 ml 2x SSC (20x SSC indeholder 3 M NaCl og 300 mM trinatriumcitrat) i 5 min. Brug pincet, overførsel dias til en Coplin-skål, der indeholder 50 ml 45% eddikesyre i 3-10 minutter.
- Overfør objektglas til en Coplin-skål indeholdende 50 ml 2 x SSC i 10 minutter. Overfør dias til en Coplin-skål, der indeholder 50 ml 4% formaldehyd (i 2x SSC) og fordybe dias for 10 minutter til at løse kromosomer.
- Fjern formaldehyd ved at skylle objektglassene 3 gange i 4 minutter hver, i en Coplin-skål indeholdende 50 ml 2 x SSC. Dehydrere glider i en Coplin-skål i 2 minutter i serie på 70%, 90% og 100% ethanol, henholdsvis og tørre objektglas i en lodretposition.
2. Fluorescerende in situ-hybridisering (FISH)
- For hvert objektglas, udarbejde en hybridisering opløsning af 20 pi i alt under anvendelse af 10 pi deioniseret formamid, 5 pi 4x hybridiseringspuffer (200 pi buffer indeholder 80 pi 20x SSC, 8 pi 1 M Tris-HCI pH 8,0, 1,6 pi 0,5 M EDTA, 11,2 pi 10 pg / pl laksesæd og 99,2 pi DNase-frit vand), 3 pi af proben og 2 pi DNase-frit vand.
- Tilsæt 20 ul hybridiseringsopløsning pr slide og tildækkes med en 24 x 32 mm dækglas og arrestere dækglasset med gummi cement. Denaturere slides med prober samtidigt ved 80 ° C i 2 minutter på en varmeplade.
- Overfør objektglas til et fugtigt kammer og inkuber objektglas ved 37 ° CO / N undgå lys. Fjern dækglas ved at skylle dias i en Coplin-skål med 2x SSC. Placer dias i en Coplin-skål, der indeholder 55-60 ° C 2x SSC og inkuberes i 20 min.
- Placer dias til 2x SSC i en Coplin-skål i 2 minutter ved stuetemperatur. Dehydrer slides i en Coplin-skål i 2 minutter i serie på 70%, 90% og 100% ethanol, henholdsvis.
- Air-tørre dias og kontrastfarve med 1 ug / m 4 ', 6-diamidino-2-phenylindoline (DAPI) i antiblegemiddel montering medium, undgå intens lys.
3. Mikroskopisk analyse og opbevaring
- Analyser dias under anvendelse af et epifluorescensmikroskop. Valget af filteret afhænger af fluorochrom anvendes til probe mærkning. Hvis det er nødvendigt, gemme lysbilleder ved 4 ° C under mørke forhold op til et år.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mikroskopiske slides med de mitotiske metafasespredninger blev fremstillet ved den hurtige lufttørre faldende kromosom fremstillingsmetode beskrevet ovenfor (Suppl. Figur 1). FISH-analyse blev udført ved hjælp af både, gentagne og enkeltstrenget kopi-sekvenser. Billeder blev opnået ved en epifluorescensmikroskop med et sæt filtre muliggør excitation af tilsvarende fluoroforer og fanget af en høj følsomhed CCD monokrom kamera. For erhvervelse billedet brugte vi en computer med et billede erhvervelse software. Resultater af FISH eksperimenter på mitotiske metafasekromosomer hjælp 5S rDNA, [CTT] 10, og single-kopi sonder var tydelig og af høj kvalitet til Hordeum vulgare (Figre 2A, B), H. bulbosum (figur 2C), H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum og Secale cereale (figur 2D). Åbenlyse fordele ved denne tilgang er godt spredt, ubeskadiget og talrige opfyldt aphase kromosomer, der tjener som en perfekt forudsætning for en vellykket FISH-analyse. Det er muligt at opbevare cellesuspensionen ved -20 ° C op til to måneder og forberede kromosomspredninger på dagen for FISH forsøget. Frisk fremstillede objektglas kan også opbevares ved -20 ° C i 96% ethanol, selvom vi observeret, at kvaliteten af hybridiseringssignaler på sådanne kromosomer er reduceret i forhold til de frisk fremstillede metafasespredninger. Fremgangsmåderne kan anvendes til fremstilling af høj kvalitet kromosomspredninger i korn på en nem, effektiv og reproducerbar måde, og sandsynligvis kan anvendes i andre plantearter også.
Figur 1. En ordning beskriver proceduren for lufttørrede faldende plante kromosom fremstillingsmetode.
es / ftp_upload / 53470 / 53470fig2.jpg "/>
Figur 2. FISK på mitotiske metafase kromosom spreads af Hordeum vulgare, H. bulbosum og Secale cereale udarbejdet af lufttørre nedkastning metode. (A) H. vulgare med en enkelt kopi sonde (FPct_40752) mærket med en rød fluorescerende farvestof. (B) H. vulgare med 5S rDNA probe mærket med et grønt fluorescerende farvestof. (C) H. bulbosum med CTT-mikrosatellit mærket med et grønt fluorescerende farvestof og (D) S. cereale med pSc119.2 gentagelse mærket med et grønt fluorescerende farvestof. Alle kromosomer blev modfarvet med DAPI (i rødt). FISH signaler er vist i gul. Skala bar = 10 um. Klik her for at se en større version af denne Figure.
Tabel 1. Inkubationstiden for enzymbehandling for forskellige arter.
Suppl. Figur 1. Fase kontrast og kontrast differential interferens (DIC) billeder af mitotiske metafase kromosom spreads i lufttørre slippe plante kromosom forberedelse metode på eksemplet med Hordeum vulgare. (A) Fase-kontrast billede taget ved 200X forstørrelse og (B) Differential interferens kontrast billede taget ved 630x forstørrelse. Klikher for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kromosom eksperimentforberedelsen er blevet udført under anvendelse af unge rødder korn tilhører græsfamilien (Poaceae). Alle analyserede arter har 14 forholdsvis lang mitotiske metafasekromosomer (11-15 um) i diploide genom sæt og tilhører store genom arter (5,1-7,9 GBP).
Længde af spiret rødder var ikke mere end 2 cm for at opnå maksimalt meristemvæv. Synkronisering af delende celler blev opnået ved en 20 timer lang isvand behandling, forbedret mængden af mitotiske metafasespredninger 10.
To trin er vigtige for fremstillingen af høj kvalitet kromosom præparater: (I) den relative fugtighed på 50% -55% og (II) varighed enzymbehandlingen. Det første punkt blev opnået ved at placere vådt papir væv på en varmeplade i nærheden af objektglas. Den relative fugtighed blev målt med et hygrometer. Den optimale fugtighed til fremstilling af planterkromosomer svarede til vandindholdet rapporteret af Kirov et al. 6. Den positive virkning på kromosomet kvalitet ved optimal relativ fugtighed sker ved hævelse af cytoplasmaet og cellevæggen hydrolyse.
Varigheden af enzymbehandling er artsafhængig (tabel 1). Perioden for enzymbehandlingen afhænger også af det tidsrum, root fiksering i ethanol / eddikesyre og størrelsen af rødderne. De længere rødder blev opbevaret i fiksativ (op til 1 år ved 4 ° C), jo længere det tager at fordøje rødder til den korrekte klasse. Utilstrækkeligt fordøjet rod materiale er vanskeligt at opblødes og vil øge den samlede tid for forberedelse som et resultat af langvarig maceration. Desuden forbliver metafasekromosomer indlejret i cytoplasma, der kunne hæmme efterfølgende sonde penetration under FISH eksperimentet. På den anden side over-fordøjet materiale kan påvirke strukturen af kromosomerne selv, og skaden målet DNA for FISH-analyse.
En yderligere faktor til forbedring af præparatet er brugen af den anden dråbe fiksativ (3: 1, eddikesyre / ethanol). En høj koncentration af eddikesyre i denne blanding stimulerer fordøjelsen af cytoplasmaet og fremmer kromosom spredning i arter med store kromosomer. Cytoplasma reduktion kan også finde sted efter immobilisering af kromosomerne på objektglas. Til dette formål mikroskopobjektglas bærer kromosomspredninger kan inkuberes i 45% eddikesyre ved stuetemperatur i 2-10 minutter, afhængigt af cytoplasma plan. Kvalitetskontrol af kromosom spreads blev udført med et fasekontrastmikroskop uden supplerende farvning (f.eks 1% aceto-Carmin). Normalt kan opnås mere end 25 slides med høj kvalitet kromosomspredninger fra 20 rødder under anvendelse af fremgangsmåden ovenfor.
Resultater af FISH eksperimenter på mitotiske metafasekromosomer hjælp 5S rDNA, [CTT] 10, og 6 kb lange single-kopi-sonde (FPct_40752) var tydelig og af høj kvalitet for alle arter, der er beskrevet ovenfor (figur 2). Åbenlyse fordele ved denne tilgang er godt spredt, ubeskadigede og talrige metafasekromosomer tjener som en perfekt forudsætning for en vellykket FISH-analyse. Det er muligt at opbevare cellesuspensionen ved -20 ° C op til to måneder og forberede kromosomspredninger på dagen for FISH forsøget. Frisk fremstillede objektglas kan også opbevares ved -20 ° C i 96% ethanol, selvom vi observeret, at kvaliteten af hybridiseringssignaler på sådanne kromosomer er reduceret i forhold til de frisk fremstillede metafasespredninger.
Kromosomspredninger udarbejdet af den hurtige lufttørre slippe teknik var egnet til FISH og blev gengivet et antal gange. Kombinationen af denne kromosom fremstillingsmetode med fisk kunne i vid udstrækning anvendes til at udforske genomorganisationen i planter, for eksempel til karyotypering 11, Chromosomal kortlægning 12, i syntetiske studier, og for integration af fysiske og genetiske kort 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hot Plate | MEDAX GmbH | 12603 | |
| Cellulase R10 | Duchefa | C8001 | |
| Cellulase | CalBioChem | 219466 | |
| Pectolyase | Sigma | P3026 | |
| Cytohelicase | Sigma | C8274 | |
| Texas Red-12-dUTP | Invitrogen | C3176 | direct fluorochrome |
| Fluor488-5-dUTP | Invitrogen | C11397 | direct fluorochrome |
| Fluorecsence microscope | Olympus BX61 | BX61 | |
| CCD camera | Orca ER, Hamamatsu | C10600 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Vector Laboratories | H-1200 | fluorecsent dye |
References
- Geber, G., Schweizer, D. Cytochemical heterochromatin differentiation in Sinapis alba (Cruciferae) using a simple air-drying technique for producing chromosome spreads. Pl Syst Evol. 158 (2-4), 97-106 (1988).
- Andras, S. C., et al. A drop-spreading technique to produce cytoplasm-free mitotic preparations from plants with small chromosomes. Chromosome Res. 7 (8), 641-647 (1999).
- Rothfels, K. H., Siminovitch, L. An air-drying technique for flattening chromosomes in mammalian cells grown in vitro. Stain Technology. 33 (2), 73-77 (1958).
- Martin, R., Busch, W., Herrmann, R. G., Wanner, G. Efficient preparation of plant chromosomes for high-resolution scanning electron microscopy. Chromosome Res. 2 (5), 411-415 (1994).
- Kato, A., Albert, P. S., Vega, J. M., Birchler, J. A. Sensitive fluorescence in situ hybridization signal detection in maize using directly labeled probes produced by high concentration DNA polymerase nick translation. Biotech. Histochem. 81 (2-3), 71-78 (2006).
- Kirov, I., Divashuk, M., Van Laere, K., Soloviev, A., Khrustaleva, L. An easy 'SteamDrop' method for high quality plant chromosome preparation. Mol. Cytogenet. 7, 21 (2014).
- Spurbeck, J. L., Zinsmeister, A. R., Meyer, K. J., Jalal, S. M.
- Ma, L., et al. Synteny between Brachypodium distachyon and Hordeum vulgare as revealed by FISH. Chromosome Res. 18 (7), 841-850 (2010).
- Kato, A., Lamb, J. C., Birchler, J. A. Chromosome painting using repetitive DNA sequences as probes for somatic chromosome identification in maize. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 101 (37), 13554-13559 (2004).
- Pan, W. H., Houben, A., Schlegel, R. Highly effective cell synchronization in plant-roots by hydroxyurea and amiprophos-methyl or colchicine. Genome. 36 (2), 387-390 (1993).
- Kim, J. S., et al. Integrated karyotyping of sorghum by in situ hybridization of landed BACs. Genome. 45 (2), 402-412 (2002).
- Lapitan, N. L. V., Brown, S. E., Kennard, W., Stephens, J. L., Knudson, D. L. FISH physical mapping with barley BAC clones. Plant J. 11 (1), 149-156 (1997).
- Aliyeva-Schnorr, L., et al. Cytogenetic mapping with centromeric BAC contigs shows that this recombination-poor region comprises more than half of barley chromosome 3H. Plant J. 84, 385-394 (2015).
