Abstract
염색체 스프레드의 제조 현장 하이브리드에 형광의 성공적인 성능 (FISH)을위한 전제 조건이다. 높은 품질의 식물 염색체 스프레드의 준비로 인해 단단한 세포벽에 도전한다. 식물 염색체의 제조를위한 승인 방법 중 하나는 소위 드롭 제제, 또한 드롭 확산 또는 공기 - 건조 기술로 알려져있다. 여기, 우리는 유사 분열 염색체의 빠른 준비를위한 프로토콜은 단일 및 높은 사본 DNA 프로브의 물고기 검출에 적합한 확산 제시한다. 이 방법은 50 % -55 %의 상대 습도 하에서 수행 풍건 드롭 방식의 개선 된 변이체이다. 이 프로토콜은 그 적용이 쉽고 효율적이고 재현하게 세척 단계의 감소 된 수를 포함한다. 이 방법의 명백한 이점은 성공적인 FISH 분석을위한 완벽한 전제 조건으로서 잘 확산, 손상되지 않은 수많은 중기 염색체이다. 이 프로토콜을 이용하여, 우리는 높은 품질을 얻을 CHROMosome 스프레드와 Hordeum vulgare의, 수평 bulbosum, 수평 marinum, 수평 murinum, 수평 pubiflorum 및 Secale의 cereale에 대한 재현 물고기 결과.
Introduction
계내 혼성화 (FISH)의 형광은 염색체 수준에서 단일 및 높은 복사 서열의 물리적 맵핑에 대한 효과적인 도구이다. 전제 조건은 높은 품질의 염색체 스프레드의 준비입니다. 동물과 식물 세포에 대한 동등하게 적합 할 것이 더 일반적인 염색체 준비 프로토콜이 없습니다. 식물 염색체의 준비로 인해 다른 종 내에서 단단한 세포벽과 각종 세포질의 일관성에 특히 도전이다. 식물 염색체의 제조를위한 바람직한 방법 중 하나는 드롭 확산 기법 및 공기 - 건조 기술로 알려진 1,2 소위 드롭 기술이다. 이 방법은 처음 체외 성장 포유 동물 세포 3 Rothfels과 Siminovitch에 의해 1958 년에 도입되었다. 나중에 마틴 등 알. 4 카토 등. 5는 식물이 방법을 적용.
최근 방법이라는 'SteamDrop &# 39; 비 중첩 염색체 (6)의 제조에 수증기를 사용하는 개발되었다. 높은 습도의 긍정적 인 영향은 이전 관찰되었지만 7 'SteamDrop'는 고품질 염색체 제제 (6)의 제어 흐름을 제공한다. 증기 처리는 아마도 염색체 단백질의 일부 수정에 접속 염색체 연신시킨다. 전체 중기의 충분한 수의 고정 후속 물고기 실험은 기술적 인 전문 지식을 필요로 확산 있지만 중기 스프레드 결과의 품질은 매우 높다.
여기에서 우리는 단일 및 높은 사본 프로브 5,8의 물고기 검출에 적합한 유사 분열 시리얼 염색체의 제조를위한 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 카토 50 % -55 %의 상대 습도 하에서 수행 (9) (도 1)에 의해 설명 풍건 적하 법의 개선 된 변이체이다. 이 프로토콜은 감소 된 수를 포함그 적용이 쉽고 효율적이고 재현하게 세척 단계. 우리가 Hordeum vulgare의, 수평 bulbosum, 수평 marinum, 수평 murinum, 수평 pubiflorum 및 Secale의 cereale 높은 품질의 염색체 확산과 물고기 결과를 얻었다이 프로토콜을 사용.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 염색체 준비
- 종자 발아 및 뿌리 끝의 고정
- 22 ~ 24 ℃에서 2 일간 어두운 조건에서 배양 접시에 촉촉한 필터 종이의 두 층에 10 ~ 20 보리 씨앗을 발아. 면도날을 사용하여 시드로부터 1-2cm의 길이 격렬한 뿌리 잘라.
- 분쇄 된 얼음 - 물에 차가운 수돗물을 함유하는 500 ㎖의 유리 병을 배치하여 빙 냉수를 준비한다. 빙 냉수를 폭기 및 중기 세포의 빈도를 증가시키기 위해 20 시간 동안 뿌리 끝 부분을 넣는다.
- 50ml의 에탄올에 물을 뿌리 전송 : 아세트산 (3 : 1)을 고정 제 2 일 동안 실온에서이를 해결하기 위해. 갓 준비 에탄올에 보관 뿌리 : 아세트산 (3 : 1) 4 ° C에서 정착 년까지 사용할까지.
- 세탁 효소 처리
- 5 분 50 회 mL 유리 비커를 사용하여 30 mL의 얼음처럼 차가운 수돗물로 씻어 뿌리 10-20. 쌍안 현미경을 사용합니다. 에 의해 뿌리 하나를 전송30 mL의 0.01 M 시트 레이트 완충액 (+ 0.01 M 시트르산 나트륨, 0.01 M 시트르산, pH를 4.8) 겸자를 사용하여 5 분 동안 두번 유리 비커를 흔들어 씻는다. 완전히 액체를 제거하고 차단 원하지 않는 비 분열 조직을 면도날을 사용하여 필터 종이에 뿌리를 놓습니다.
- 시계 접시로 식물 조직을 부드럽게 약 50 분 (표 1), 37 ° C에서 1 ㎖의 효소 혼합물에 20 뿌리 끝까지 배양한다. 효소 혼합물 0.01 M 구연산 버퍼에 희석 0.7 % 셀룰라아제 R10, 0.7 %의 셀룰라아제, 1 % pectolyase과 1 % cytohelicase가 포함되어 있습니다. -20 ℃에서 효소 혼합물을 저장하고 다섯 번까지 재사용.
- 피펫으로 효소를 제거하고 잔류 효소를 대체하기 위해 두 번 5 ml의 0.01 M 구연산 버퍼와 얼음에 뿌리 끝을 씻는다.
- 루트 침용
- 두 번주의 깊게 같은 시계 접시에 1 ml의 96 % 에탄올로 세척 루트 팁. 갓 준비 고정액 (25 % 에탄올 75 % 아세트산)와 에탄올을 교체합니다. 10 ~ 15를 사용하여루트 팁 당 μL 정착.
- 해부 바늘이나 집게로 2 ML 튜브에 정착와 함께 전송 루트 팁과 분해 루트 분열 조직. 세포 현탁액을 얻기 위해 세포를 다시 중단 튜브 20 번 눌러. 2 개월 -20 ° C 최대의 세포 현탁액을 저장합니다.
- 세포 현탁액의 적하
- 50 ° C에서 뜨거운 접시에 물을 적신 종이 조직의 2 ~ 3 층을 놓습니다. 30 분 동안 냉장고에 얼음처럼 차가운 수돗물에 현미경 슬라이드를 담가. 장소는 축축한 종이 티슈 위에 슬라이드.
- 피펫 7-10 세포 현탁액의 μL와 핫 플레이트에 배치 된 냉각 슬라이드에 20cm의 거리에서 드롭합니다. 피펫 (10) 슬라이드에 세포 현탁액과 같은 장소에 아세트산 - 에탄올 혼합물의 μL 및 추가 2 분 동안 핫 플레이트에 슬라이드를 유지. 물티슈없이 핫 플레이트에 슬라이드를 배치하고 1 분 동안 건조 할 수 있습니다.
- 품질 관리 및 스토리지 박슬라이드의 전자
- 염색체 스프레드의 품질을 제어하는 위상차 현미경을 사용하여 슬라이드를 확인한다. -20 ° C에서 코 플린 항아리에 96 %의 에탄올에 침지하여 같은 날 또는 저장 중 슬라이드를 사용합니다.
- 물고기 전에 슬라이드 전처리; 모든 단계는 실온에서 수행
- 배 SSC의 50 ㎖를 포함하는 코 플린 항아리에 넣어 슬라이드 5 분 (20 배 SSC는 3 M의 NaCl 300 MM의 트리 소듐 시트 레이트를 포함). 3-10 분 동안 45 % 아세트산 50 ㎖를 함유하는 코 플린 항아리 집게, 이전 슬라이드를 사용.
- 전달은 10 분 동안 2 배 SSC 50 ㎖를 함유하는 코 플린 항아리에 슬라이드. 10 분 동안 (2 × SSC)에 4 % 포름 알데히드의 50 ㎖를 포함하는 코 플린 항아리로 전송 슬라이드 빠져들게 슬라이드 염색체를 해결하려면.
- 50 ml의 2 배 SSC를 포함하는 코 플린 항아리, 4 분 각각의 슬라이드 3 회 세척하여 포름 알데히드를 제거합니다. 수직에서 70 %의 시리즈에서 2 분, 90 %, 100 % 에탄올, 각각 건조 슬라이드의 코 플린 항아리에 슬라이드를 탈수위치.
제자리 하이브리드 2. 형광 (물고기)
- 각 슬라이드에 대해, 탈 포름 아미드 10 μL, 4X 혼성화 완충액 5 μL를 사용하여 총 20 μL의 혼성화 용액을 제조 하였다 (200 ㎕를 완충액 80 ㎕의 20 배 SSC, 8 ㎕의 1 M 트리스 -HCl pH가 8.0를 포함 1.6 ㎕의 0.5 M EDTA, 11.2 μL 10 μg의 / μL 연어 정자와 99.2 μL의 DNase를없는 물), 프로브의 3 μL와 DNase를없는 물 2 μL.
- 24 X 32mm 커버 슬립과 슬라이드 커버 당 혼성화 용액 20 μl를 추가하고 고무 시멘트와 커버 슬립을 체포. 핫 플레이트에서 2 분 동안 80 ℃에서 프로브와 동시에 슬라이드 변성.
- 전송 습기 챔버에 슬라이드와 37 ° CO / N 피 빛 슬라이드를 품어. 배 SSC와 코 플린 항아리에 슬라이드를 세척하여 커버 전표를 제거합니다. 그리고 55-60 ° C의 2 배 SSC를 포함하는 코 플린 항아리에 넣어 슬라이드 20 분 동안 품어.
- 실온에서 2 분 동안 코 플린 항아리에 SSC를 2 배 슬라이드를 놓습니다. 각각 70 %, 90 %, 100 % 에탄올, 일련의 2 분 동안 코 플린 항아리 슬라이드 탈수.
- 강렬한 빛을 방지, antifade 설치 매체에 / ㎖ 4 ', 6 diamidino-2-phenylindoline 1 μg의 (DAPI)과 슬라이드와 Counterstain과를 공기 - 건조.
3. 현미경 분석 및 저장
- 표면 형광 현미경을 사용하여 슬라이드를 분석한다. 필터의 선택은 라벨 프로브 형광 색소 사용에 의존한다. 필요한 경우, 1 년까지 어두운 조건에서 4 ° C에서 저장 슬라이드.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
유사 분열 중기 스프레드 현미경 슬라이드는 전술 빠른 공기 건조 적하 염색체의 제조 방법에 의해 제조 하였다 (SUPPL.도 1). FISH 분석은 모두, 반복적이고 단일 - 카피 시퀀스를 사용하여 수행 하였다. 이미지는 대응하는 형광체의 여기를 가능 필터 세트 표면 형광 현미경에 의해 얻은 고감도 CCD 흑백 카메라에 의하여 촬영되었다. 화상 획득을 위해 우리는 화상 취득 소프트웨어가 설치된 컴퓨터를 이용했다. 5S rDNA의 [CTT] (10), 및 단일 복사 프로브를 사용하여 유사 분열 중기 염색체에 물고기 실험의 결과는 별개 있었다 Hordeum vulgare의에 대한 높은 품질의 (Figre 2A, B), H. bulbosum (그림 2C), H. marinum, 수평 murinum, 수평 pubiflorum 및 Secale의 cereale (그림 2D). 이 방법의 명백한 이점은 잘 확산은 손상되지 않은 수많은 충족 성공적인 FISH 분석을위한 완벽한 전제 조건으로 제공 aphase 염색체. 그것은 2 개월까지 -20 ℃에서 세포 현탁액을 저장하고 염색체 FISH 실험 당일 확산 제조 할 수있다. 우리는 이러한 염색체에 혼성화 신호 품질 갓 제조 중기 스프레드에 비해 감소되는 것을 관찰했지만 갓 준비한 슬라이드는 96 % 에탄올로 -20 ℃에서 저장 될 수있다. 방법은 쉽고 효율적이고 재생 가능한 방식으로 시리얼 고품질 염색체 스프레드를 제조하는데 사용될 수 있으며, 가장 가능성이 너무 다른 식물 종에서 사용될 수있다.
도 1 풍건 적하 식물 염색체 제조 방법의 순서를 설명하는 방식.
ES / ftp_upload / 53470 / 53470fig2.jpg "/>
Hordeum vulgare의, 수평의 유사 분열 중기 염색체 스프레드 그림 2. 물고기 공기 건조 적하 법에 의해 제조하고 bulbosum Secale cereale. (A) H. 빨간색 형광 염료로 표지 단일 복사본 프로브 (FPct_40752)와 vulgare의. (B) H. 녹색 형광 염료로 표지 5S rDNA의 프로브 vulgare의. (C) 녹색 형광 염료로 표지 CTT-의 microsatellite와 수평 bulbosum (D) 녹색 형광 염료로 표지 pSc119.2 반복 함께 미의 cereale. 모든 염색체는 (빨간색) DAPI으로 대조했다. 물고기 신호는 노란색으로 표시됩니다. 스케일 바 = 10 μm의. 이 figu의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오레.
다른 종의 효소 처리 표 1. 배양 시간.
SUPPL. 그림 1 단계 대비 및 차등 간섭 대비 (DIC) Hordeum vulgare의의 예에 자연 건조 떨어지는 식물 염색체의 제조 방법의 유사 분열 중기 염색체 스프레드의 이미지. (A) 단계 대비 이미지 200X 배율에서 찍은 및 (B) 630X 배율에서 촬영 차등 간섭 대비 이미지. 를 클릭하십시오여기에이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
염색체 준비 실험 잔디 가족 (벼과)에 속하는 시리얼 어린 뿌리를 이용하여 수행되었다. 모든 분석 종은 이배체 게놈 세트 14 상대적으로 긴 유사 분열 중기 염색체 (11 ~ 15 μm의)가 큰 게놈 종 (5.1-7.9 GBP)에 속한다.
발아 한 뿌리의 길이가 세포 분열 조직의 최대치를 얻기 위해 2 cm 이상이 아니었다. 분열하는 세포의 동기화 유사 분열 중기의 수량이 10 퍼 향상 20 시간 긴 빙수 처리에 의해 달성되었다.
(I) 상대 습도 50 % -55 %와 효소 처리 (II) 시간 : 두 단계 고품질 염색체 제제의 제조를 위해 중요하다. 첫번째 점은 유리 슬라이드의 근접 열판에서 젖은 종이 조직을 배치함으로써 달성되었다. 상대 습도는 습도로 측정 하였다. 공장의 제조를위한 최적의 습도염색체 키로프 등에 의해보고 습도 유사 하였다. 6. 최적의 상대 습도에서 염색체 품질에 긍정적 인 효과는 세포질 및 세포벽 가수 팽윤에 의해 발생한다.
효소 처리 시간은 의존 종 (표 1)이다. 효소 처리의 기간은 또한 루트 에탄올 / 아세트산 정착 및 뿌리의 크기의 시간 간격에 의존한다. 더 이상 뿌리는 적절한 학년에 뿌리를 소화하는 데 걸리는 이상 (4 ° C에서 1 년까지) 고정액에 보관 하였다. 불충분 소화 루트 재료 담가서 부드럽게 어렵고 장기적인 침용의 결과로서 제제의 총 시간을 증가시킬 것이다. 또한, 중기 염색체는 물고기의 실험 기간 동안 프로브 침투 계속되는 방해 할 수 세포질에 포함 된 상태로 유지됩니다. 한편 이상의 소화 물질은 염색체 자체의 구조 및 피해 대상 DN에 영향을 미칠 수있다물고기 분석.
제제의 개선을위한 추가적인 인수는 정착액의 제 방울 (1, 아세트산 / 에탄올 3)의 사용이다. 이 혼합물에 아세트산 고농도 세포질의 소화를 촉진하고 큰 염색체 종 염색체 확산을 촉진시킨다. 세포질 감소는 또한 슬라이드 염색체의 고정 후 일어날 수있다. 이 목적을 위해 염색체 스프레드 운반 현미경 슬라이드는 2-10 분 세포질 레벨에 따라 실온에서 45 % 아세트산에서 배양 할 수있다. 염색체 스프레드의 품질 검사는 어떠한 부가 염색법 (예를 들어, 1 % 아세토-카민)없이 위상차 현미경으로 수행 하였다. 일반적으로 고품질의 염색체 스프레드를 함유하는 25 개 이상의 슬라이드는 상기 방법을 사용하여 20 뿌리로부터 얻을 수있다.
5S rDNA의 [CTT] (10)를 사용하여 유사 분열 중기 염색체에 물고기 실험의 결과, 6 KB 긴 단일 복사 프로브 (FPct_40752는) 별개의 (그림 2) 위에서 설명한 모든 종에 대한 높은 품질했다. 이 방법의 명백한 이점은 성공적인 FISH 분석을위한 완벽한 전제 조건으로서 잘 확산, 손상되지 않은 수많은 중기 염색체이다. 그것은 2 개월까지 -20 ℃에서 세포 현탁액을 저장하고 염색체 FISH 실험 당일 확산 제조 할 수있다. 우리는 이러한 염색체에 혼성화 신호 품질 갓 제조 중기 스프레드에 비해 감소되는 것을 관찰했지만 갓 준비한 슬라이드는 96 % 에탄올로 -20 ℃에서 저장 될 수있다.
빠른 공기 건조 낙하 기술에 의해 제조 된 염색체 스프레드는 물고기에 적합했고, 여러 번 재현했다. 생선이 염색체의 제조 방법의 조합은 널리 핵형 11, CHROMOS을 위해, 예를 들어, 식물의 게놈 조직을 탐험 적용 할 수합성 연구에서, 물리적 및 유전자지도 (13)의 통합을위한 매핑 OMAL 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hot Plate | MEDAX GmbH | 12603 | |
| Cellulase R10 | Duchefa | C8001 | |
| Cellulase | CalBioChem | 219466 | |
| Pectolyase | Sigma | P3026 | |
| Cytohelicase | Sigma | C8274 | |
| Texas Red-12-dUTP | Invitrogen | C3176 | direct fluorochrome |
| Fluor488-5-dUTP | Invitrogen | C11397 | direct fluorochrome |
| Fluorecsence microscope | Olympus BX61 | BX61 | |
| CCD camera | Orca ER, Hamamatsu | C10600 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Vector Laboratories | H-1200 | fluorecsent dye |
References
- Geber, G., Schweizer, D. Cytochemical heterochromatin differentiation in Sinapis alba (Cruciferae) using a simple air-drying technique for producing chromosome spreads. Pl Syst Evol. 158 (2-4), 97-106 (1988).
- Andras, S. C., et al. A drop-spreading technique to produce cytoplasm-free mitotic preparations from plants with small chromosomes. Chromosome Res. 7 (8), 641-647 (1999).
- Rothfels, K. H., Siminovitch, L. An air-drying technique for flattening chromosomes in mammalian cells grown in vitro. Stain Technology. 33 (2), 73-77 (1958).
- Martin, R., Busch, W., Herrmann, R. G., Wanner, G. Efficient preparation of plant chromosomes for high-resolution scanning electron microscopy. Chromosome Res. 2 (5), 411-415 (1994).
- Kato, A., Albert, P. S., Vega, J. M., Birchler, J. A. Sensitive fluorescence in situ hybridization signal detection in maize using directly labeled probes produced by high concentration DNA polymerase nick translation. Biotech. Histochem. 81 (2-3), 71-78 (2006).
- Kirov, I., Divashuk, M., Van Laere, K., Soloviev, A., Khrustaleva, L. An easy 'SteamDrop' method for high quality plant chromosome preparation. Mol. Cytogenet. 7, 21 (2014).
- Spurbeck, J. L., Zinsmeister, A. R., Meyer, K. J., Jalal, S. M. Dynamics of chromosome spreading. Am J Med Genet. 61 (4), 387-393 (1996).
- Ma, L., et al. Synteny between Brachypodium distachyon and Hordeum vulgare as revealed by FISH. Chromosome Res. 18 (7), 841-850 (2010).
- Kato, A., Lamb, J. C., Birchler, J. A. Chromosome painting using repetitive DNA sequences as probes for somatic chromosome identification in maize. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 101 (37), 13554-13559 (2004).
- Pan, W. H., Houben, A., Schlegel, R. Highly effective cell synchronization in plant-roots by hydroxyurea and amiprophos-methyl or colchicine. Genome. 36 (2), 387-390 (1993).
- Kim, J. S., et al. Integrated karyotyping of sorghum by in situ hybridization of landed BACs. Genome. 45 (2), 402-412 (2002).
- Lapitan, N. L. V., Brown, S. E., Kennard, W., Stephens, J. L., Knudson, D. L. FISH physical mapping with barley BAC clones. Plant J. 11 (1), 149-156 (1997).
- Aliyeva-Schnorr, L., et al. Cytogenetic mapping with centromeric BAC contigs shows that this recombination-poor region comprises more than half of barley chromosome 3H. Plant J. 84, 385-394 (2015).
