We describe two complementary methods using the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) and image analysis or flow cytometry to identify and isolate cells in the inner G1 arrested and outer proliferating regions of 3D spheroids.
Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to traditional two-dimensional (2D) cell culture. The spheroid model is able to mimic the effects of cell-cell interaction, hypoxia and nutrient deprivation, and drug penetration. One characteristic of this model is the development of a necrotic core, surrounded by a ring of G1 arrested cells, with proliferating cells on the outer layers of the spheroid. Of interest in the cancer field is how different regions of the spheroid respond to drug therapies as well as genetic or environmental manipulation. We describe here the use of the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) system along with cytometry and image analysis using commercial software to characterize the cell cycle status of cells with respect to their position inside melanoma spheroids. These methods may be used to track changes in cell cycle status, gene/protein expression or cell viability in different sub-regions of tumor spheroids over time and under different conditions.
Çok hücreli 3D sferoidler ancak birçok katı kanser için bir in vitro model olarak daha yaygın hale gelmiş ancak son zamanlarda, on bir tümör modeli olarak bilinmektedir. Bunlar giderek daha karmaşık, pahalı ve zaman alıcı in vivo modellerde ve basit, düşük maliyetli 2D tek tabakalı modeli 1-6 arasında bir ara ürün olarak yüksek verimli ilaç keşif ekranlarında kullanılmaktadır. 2B kültüründe çalışmalar genellikle in vivo olarak çoğaltılması mümkün değildir. Birçok kanser tiplerinin Sferoid modelleri büyüme karakteristiklerine, ilaç duyarlılığı, ilaç nüfuzu, hücre-hücre etkileşimi, katı tümörler 6-11, in vivo görülür oksijen ve besin maddeleri ve nekroz gelişiminin kısıtlı durumu taklit etmek mümkündür. Sferoidler sfero 7 periferisinde bir nekrotik çekirdeği, bu çekirdeği soran sakin ya da G1 tutuklandı bölge ve çoğalan hücreleri geliştirme. Bu bölgelerin gelişimiHücre yoğunluğu, proliferasyon hızı ve küremsi 12 boyutuna bağlı olarak değişebilir. Bu farklı alt bölgelerde görülen hücresel heterojenite kanser tedavisi direnci 13,14 katkıda bulunabileceği öne sürülmüştür. Bu nedenle, bu bölgelerdeki hücrelerin analiz yeteneği ayrı anlayış tümör ilaç yanıtları için çok önemlidir.
Hücre döngüsünün 15 farklı aşamalarında bozulmuş olan Cdt1 ve geminin floresan etiketleme, – ve yeşil (AG Azami Green) – floresan ubikitinasyon hücre döngüsü göstergesi (Fucci) sistemi kırmızı (KO Kusabira Turuncu) dayanmaktadır. Böylece hücre çekirdekleri erken S sarı, G1 kırmızı ve S / G2 / M fazında yeşil görünür. Biz burada iki tamamlayıcı yöntemler tarif hem hücreler G1 tutuklandı merkezi veya dış proliferatin ikamet olup olmadığını belirlemek için görüntüleme yazılımı veya tahlil sitometri bir boya difüzyon akışı kullanımı ile birlikte, hücre döngüsünü belirlemek için Fucci kullanarakg halkası ve sfero kenarından tek tek hücrelerin mesafe. Ve / veya hedeflenen terapilerin mevcudiyetinde uzun bir süre için durması G1 kalması mümkün ve yeniden olabilir Bu yöntemler, biz sfero merkezinde hipoksik bölgelerinde bu melanoma hücreleri göstermiştir önceki yayında, geliştirilmiştir daha elverişli şartlar ortaya çıktığında 7 hücre döngüsü girin.
Yarı otomatik bir görüntü analiz sferoid iç G1 tutuklandı bölgeyi tanımladık ve dış tabakalar çoğalan. Bu yöntem, bir optik bölümünde kullanılarak canlı küremsiler de kullanılabilir, ya da sabit küremsi bölümlerde, bu farklı bölgelerde hücre döngüsü, ancak (immünofloresan ile) belirteç ekspresyonu, hücre ölümü veya hücre morfolojisi, sadece değişiklikleri tespit etmek. Farklı sfero bölgeler içinde hücre motilitesi de sayısal olabilir – hücre izleme görüntü analizi aşamas?…
The authors have nothing to disclose.
We thank Ms. Danae Sharp and Ms. Sheena Daignault for technical assistance. We thank Dr. Atsushi Miyawaki, RIKEN, Wako-city, Japan, for providing the FUCCI constructs, Dr. Meenhard Herlyn and Ms. Patricia Brafford, The Wistar Institute, Philadelphia, for providing cell lines, the Imaging and Flow Cytometry Facility at the Centenary Institute for outstanding technical support. We thank Mr. Chris Johnson and Dr. Andrew Barlow for Volocity software technical support. N.K.H. is a Cameron fellow of the Melanoma and Skin Cancer Research Institute, Australia. K.A.B. is a fellow of the Cancer Institute New South Wales (13/ECF/1-39). W.W. is a fellow of the Cancer Institute New South Wales (11/CDF/3-39). This work was supported by project grants RG 09-08 and RG 13-06 (Cancer Council New South Wales), 570778 and 1051996 (Priority-driven collaborative cancer research scheme/Cancer Australia/Cure Cancer Australia Foundation), 08/RFG/1-27 (Cancer Institute New South Wales), and APP1003637 and APP1084893 (National Health and Medical Research Council).
Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
agarose low melting point | Life Technologies | 16520-050 | For sectioning |
noble agar | Sigma | A5431 | For making spheroids |
agarose for spheroids | Fisher Scientific | BP1356-100 | For making spheroids |
0.05% trypsin/EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
HBSS | Life Technologies | 14175-103 | |
10% formalin | Sigma | HT5014-1CS | CAUTION: Harmful, corrosive. Use Personal Protective Equipment, do not breath fumes (open in a fume cupboard). |
live/dead near IR | Life Technologies | L10119 | |
vibratome | Technical Products International, Inc | ||
coulture cup | Thermo-Fisher Scientific | SIE936 | Mold for sectioning spheroids |
hemocytometer | Sigma | Z359629 | |
96-well tissue culture plate | Invitro | FAL353072 | |
collagenase | Sigma | C5138 | |
confocal microscope | Leica | TCS SP5 | |
Flow cytometer analyser | Becton Dickinson | LSRFortessa | |
volocity | PerkinElmer | Imaging software | |
flowjo | Tree Star | Flow cytometry software | |
Vaccuum grease | Sigma | Z273554 | |
Mounting media | Vector Laboratories | H1000 | |
FUCCI (commercial constructs) | Life Technologies | P36238 | Transient transfection only |
Cell strainer 70 um | In Vitro | FAL352350 | |
Round bottom 5 mL tubes (sterile) | In Vitro | FAL352003 | |
Round bottom 5 mL tubes (non-sterile) | In Vitro | FAL352008 |