The postembedding immunogold method is one of the most effective ways to provide high-resolution analyses of the subcellular localization of specific molecules. Here we describe a protocol to quantitatively analyze glutamate receptors at retinal ribbon synapses.
Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA receptors (NMDARs) and AMPA receptors (AMPARs). Physiological data have indicated that glutamate receptors at RGCs are expressed not only in postsynaptic but also in perisynaptic or extrasynaptic membrane compartments. However, precise anatomical locations for glutamate receptors at RGC synapses have not been determined. Although a high-resolution quantitative analysis of glutamate receptors at central synapses is widely employed, this approach has had only limited success in the retina. We developed a postembedding immunogold method for analysis of membrane receptors, making it possible to estimate the number, density and variability of these receptors at retinal ribbon synapses. Here we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of retinal fixation, 2) freeze-substitution, 3) postembedding immunogold electron microscope (EM) immunocytochemistry and, 4) quantitative visualization of glutamate receptors at ribbon synapses.
Glutamat er den dominerende excitatoriske neurotransmitter i nethinden 1. Retina-ganglieceller (RGC'er), der modtager glutamaterge synaptiske input fra bipolære celler 2, er output-neuroner i nethinden, der sender visuel information til hjernen. Fysiologiske undersøgelser viste, at synaptisk excitation af RGC'er medieres postsynaptisk af NMDA-receptorer (NMDARs) og AMPA-receptorer (AMPARs) 3,4,5. Selvom excitatoriske postsynaptiske strømme (EPSCs) i RGC'er formidles af AMPARs og NMDARs 3,5,6,7,8, spontane miniature EPSCs (mEPSCs) på RGC'er udviser kun en AMPARs-medieret komponent 4,5,9. Men reduktion glutamatoptagelse afslørede en NMDAR komponent i spontane EPSCs 5, hvilket antyder, at NMDARs på RGC dendritter kan være placeret uden for excitatoriske synapser. Membranassocierede guanylat kinaser (MAGUKs) såsom PSD-95 at klynge neurotransmitterreceptorer, herunder glutamatreceptorer og ionkanals ved synaptiske steder, også udviser distinkte subsynaptic ekspressionsmønstre 10,11,12,13,14.
I de seneste årtier, konfokal immunhistokemi og præ-embedding elektronmikroskop (EM) immunhistokemi har været ansat til at studere membran receptor udtryk. Selv konfokal immunfarvning afslører brede mønstre af receptorekspression, dens lavere opløsning gør det umuligt at bruge til at skelne subcellulær placering. Pre-indlejring EM studier i pattedyrs nethinden viser, at NMDAR underenheder er til stede i postsynaptiske elementer ved kegle bipolære celle bånd synapser 15,16,17. Dette er i tilsyneladende modsætning til fysiologiske beviser. Imidlertid diffusion af reaktionsprodukt er et velkendt artefakt i præ-embedding immunperoxidase-metoden. Derfor er denne fremgangsmåde ikke normalt give statistisk pålidelige data og kan udelukke skelnen mellem lokalisering til synaptisk membran versus ekstrasynaptiske membran 18,19,20,21. PåDerimod fysiologiske og anatomiske data stemmer overens med et synaptisk lokalisering af AMPARs på RGC'er 3,5,7,9,22. Således er glutamatreceptorer og MAGUKs på retinal bånd synapse lokaliseret ikke alene til den postsynaptiske men også de perisynaptic eller ekstrasynaptiske membran rum. Dog er der stadig behov for en høj opløsning kvantitativ analyse af disse membranproteiner i en retinal bånd synapse.
Her har vi udviklet en postembedding EM immunguld teknik til at undersøge subsynaptic lokalisering af NMDAR underenheder, Ampar underenheder og PSD-95 efterfulgt af anslå antallet, tæthed og variation af disse proteiner på synapser onto rotte RGC'er mærket hjælp kolera toksin subunit B (CTB) retrograd tracing metoder.
Vi har beskrevet fire teknikker for vellykket kvantitativ post-embedding immunogold EM: 1) korte og svage fiksering, 2) fryse-substitution, 3) post-embedding immunguld-farvning, og 4) kvantificering.
EM immunguld tillader påvisning af specifikke proteiner i ultratynde vævssnit. Antistoffer mærket med guldpartikler direkte kan visualiseres under anvendelse af EM. Mens magtfulde i påvise subsynaptic lokalisering af en membran receptor, kan EM immunogold være teknisk udfordrende, og kræve…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af intramuralt Programmer for National Institute of Neurologiske og Stroke (NINDS) og National Institute on Døvhed og anden kommunikation Disorders (NIDCD), af National Institutes of Health (NIH). Vi takker NINDS EM faciliteten og NIDCD avancerede billedbehandling kerne (kode # ZIC DC 000.081-03) for at få hjælp.
Paraformaldehyde | EMS | 15710 | |
Glutarldehyde | EMS | 16019 | |
NaH2PO4 | Sigma | S9638 | |
Na2HPO4 | Sigma | 7782-85-6 | |
CaCl2 | Sigma | C-8106 | |
BSA | Sigma | A-7030 | |
Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
NaOH | Sigma | 221465 | |
NaN3 | JT Baker | V015-05 | |
Glycerol | Gibco BRL | 15514-011 | |
Lowicryl HM 20 | Polysciences | 15924-1 | |
Tris-Base | Fisher | BP151-500 | |
Tris | Fisher | 04997-100 | |
Anti-GluN2A | Millipore | AB1555P | Dilution 1/50 |
Anti-GluN2B | Millipore | AB1557P | Dilution 1/30 |
Anti-GluA2/3 | Millipore | AB1506 | Dilution 1/30 |
Anti-PSD-95 | Millipore | MA1–046 | Dilution 1/100 |
Donkey anti-rabbit IgG-10 nm gold particles | EMS | 25704 | Dilution 1/20 |
Donkey anti-mouse IgG-10 nm gold particles | EMS | 25814 | Dilution 1/20 |
Donkey anti-mouse IgG-5 nm gold particles | EMS | 25812 | Dilution 1/20 |
Donkey anti-goat IgG-18 nm gold particles | Jackson ImmunoResearch | 705-215-147 | Dilution 1/20 |
Formvar-Carbon coated nickel-slot grids. | EMS | FCF2010-Ni | |
Uranyl acetate | EMS | 22400-1 | |
Methanol | EMS | 67-56-1 | |
Lead citrate | Leica | ||
Leica EM AFS | Leica | ||
Leica EM CPC | Leica | ||
Ultromicrotome | Leica | ||
JEOL 1200 EM | JEOL | ||
liquid nitrogen | Roberts Oxygen | ||
Propane | Roberts Oxygen | ||
CTB | List Biological Laboratories | 104 | 1-1.2% |
Anti-CTB | List Biological Laboratories | 703 | Dilution 1/4000 |