उच्च संकल्प मात्रात्मक immunogold झिल्ली रिसेप्टर्स के रेटिना रिबन synapses पर विश्लेषण
Summary
The postembedding immunogold method is one of the most effective ways to provide high-resolution analyses of the subcellular localization of specific molecules. Here we describe a protocol to quantitatively analyze glutamate receptors at retinal ribbon synapses.
Abstract
Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA receptors (NMDARs) and AMPA receptors (AMPARs). Physiological data have indicated that glutamate receptors at RGCs are expressed not only in postsynaptic but also in perisynaptic or extrasynaptic membrane compartments. However, precise anatomical locations for glutamate receptors at RGC synapses have not been determined. Although a high-resolution quantitative analysis of glutamate receptors at central synapses is widely employed, this approach has had only limited success in the retina. We developed a postembedding immunogold method for analysis of membrane receptors, making it possible to estimate the number, density and variability of these receptors at retinal ribbon synapses. Here we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of retinal fixation, 2) freeze-substitution, 3) postembedding immunogold electron microscope (EM) immunocytochemistry and, 4) quantitative visualization of glutamate receptors at ribbon synapses.
Introduction
ग्लूटामेट रेटिना 1 में प्रमुख उत्तेजक neurotransmitter है। रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं (RGCs), द्विध्रुवी कोशिकाओं 2 से ग्लूटामेटरगिक synaptic इनपुट प्राप्त करने, रेटिना के उत्पादन न्यूरॉन्स कि मस्तिष्क के लिए दृश्य जानकारी भेज रहे हैं। शारीरिक अध्ययन से पता चला है कि RGCs के synaptic उत्तेजना NMDA रिसेप्टर्स (NMDARs) और AMPA रिसेप्टर्स (AMPARs) 3,4,5 द्वारा postsynaptically मध्यस्थता है। हालांकि RGCs में उत्तेजक पोस्टअन्तर्ग्रथनी धाराओं (EPSCs) AMPARs और NMDARs द्वारा मध्यस्थता कर रहे 3,5,6,7,8, सहज लघु EPSCs (mEPSCs) पर RGCs केवल एक AMPARs की मध्यस्थता घटक 4,5,9 दिखा रहे हैं। हालांकि, ग्लूटामेट तेज को कम करने सहज EPSCs 5 में एक NMDAR घटक का पता चला है, सुझाव है कि RGC dendrites पर NMDARs उत्तेजक synapses के बाहर स्थित किया जा सकता है। झिल्ली जुड़े guanylate kinases (MAGUKs) ऐसे PSD-95 के रूप में है कि क्लस्टर न्यूरोट्रांसमीटर रिसेप्टर्स, ग्लूटामेट रिसेप्टर्स और आयन चैनल सहितsynaptic स्थलों पर एस, यह भी अलग sub अन्तर्ग्रथनी अभिव्यक्ति पैटर्न 10,11,12,13,14 दिखा रहे हैं।
हाल के दशकों, confocal immunohistochemistry और पूर्व embedding इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (ईएम) immunohistochemistry ओवर झिल्ली रिसेप्टर अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए नियोजित किया गया है। हालांकि confocal immunostaining रिसेप्टर अभिव्यक्ति की व्यापक पैटर्न का पता चलता है, इसकी कम संकल्प यह असंभव subcellular स्थान भेद करने के लिए उपयोग करने के लिए बनाता है। स्तनधारी रेटिना में प्री-embedding ईएम अध्ययन से संकेत मिलता है कि सब यूनिटों NMDAR शंकु द्विध्रुवी सेल रिबन synapses 15,16,17 पर पोस्टअन्तर्ग्रथनी तत्वों में मौजूद हैं। यह शारीरिक सबूत के लिए स्पष्ट विपरीत है। हालांकि, प्रतिक्रिया उत्पाद का प्रसार पूर्व embedding immunoperoxidase विधि में एक जाने-माने विरूपण साक्ष्य है। इसलिए, इस दृष्टिकोण आमतौर पर सांख्यिकीय रूप से विश्वसनीय आंकड़े नहीं दे करता है और बनाम extrasynaptic झिल्ली 18,19,20,21 synaptic झिल्ली को स्थानीयकरण के बीच भेद बाहर कर सकते हैं। परदूसरी ओर, शारीरिक और शारीरिक डेटा RGCs 3,5,7,9,22 पर AMPARs की एक synaptic स्थानीयकरण के साथ संगत कर रहे हैं। इस प्रकार, ग्लूटामेट रिसेप्टर्स और MAGUKs रेटिना रिबन अन्तर्ग्रथन पर न केवल पोस्टअन्तर्ग्रथनी करने पर भी perisynaptic या extrasynaptic झिल्ली डिब्बों को स्थानीय कर रहे हैं। हालांकि, एक रेटिना रिबन अन्तर्ग्रथन में इन झिल्ली प्रोटीन की एक उच्च संकल्प मात्रात्मक विश्लेषण अभी भी जरूरत है।
यहाँ, हम (CTB) NMDAR सब यूनिटों, Ampar सब यूनिटों और PSD-95 चूहे RGCs पर synapses पर नंबर, घनत्व और इन प्रोटीनों की परिवर्तनशीलता का आकलन करने के बाद की sub अन्तर्ग्रथनी स्थानीयकरण की जांच करने का उपयोग लेबल हैजा विष सबयूनिट बी एक postembedding ईएम immunogold तकनीक विकसित प्रतिगामी ट्रेसिंग तरीकों।
Protocol
Representative Results
Discussion
हम सफल मात्रात्मक के बाद embedding immunogold ईएम के लिए चार तकनीकों का वर्णन किया है: 1) छोटी और कमजोर निर्धारण, 2) फ्रीज प्रतिस्थापन, 3) के बाद embedding immunogold धुंधला हो जाना, और 4) मात्रा का ठहराव।
ईएम immunogold Ultrathin ऊतक वर्?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के मस्तिष्क संबंधी विकार और स्ट्रोक के राष्ट्रीय संस्थान (NINDS) और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ बहरापन और अन्य संचार विकार पर (NIDCD), राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के (एनआईएच) के अंदर का कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया। हम NINDS ईएम सुविधा और NIDCD उन्नत इमेजिंग कोर (कोड # ZIC डीसी 000,081-03) सहायता के लिए धन्यवाद।
Materials
| Paraformaldehyde | EMS | 15710 | |
| Glutarldehyde | EMS | 16019 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S9638 | |
| Na2HPO4 | Sigma | 7782-85-6 | |
| CaCl2 | Sigma | C-8106 | |
| BSA | Sigma | A-7030 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| NaOH | Sigma | 221465 | |
| NaN3 | JT Baker | V015-05 | |
| Glycerol | Gibco BRL | 15514-011 | |
| Lowicryl HM 20 | Polysciences | 15924-1 | |
| Tris-Base | Fisher | BP151-500 | |
| Tris | Fisher | 04997-100 | |
| Anti-GluN2A | Millipore | AB1555P | Dilution 1/50 |
| Anti-GluN2B | Millipore | AB1557P | Dilution 1/30 |
| Anti-GluA2/3 | Millipore | AB1506 | Dilution 1/30 |
| Anti-PSD-95 | Millipore | MA1–046 | Dilution 1/100 |
| Donkey anti-rabbit IgG-10 nm gold particles | EMS | 25704 | Dilution 1/20 |
| Donkey anti-mouse IgG-10 nm gold particles | EMS | 25814 | Dilution 1/20 |
| Donkey anti-mouse IgG-5 nm gold particles | EMS | 25812 | Dilution 1/20 |
| Donkey anti-goat IgG-18 nm gold particles | Jackson ImmunoResearch | 705-215-147 | Dilution 1/20 |
| Formvar-Carbon coated nickel-slot grids. | EMS | FCF2010-Ni | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400-1 | |
| Methanol | EMS | 67-56-1 | |
| Lead citrate | Leica | ||
| Leica EM AFS | Leica | ||
| Leica EM CPC | Leica | ||
| Ultromicrotome | Leica | ||
| JEOL 1200 EM | JEOL | ||
| liquid nitrogen | Roberts Oxygen | ||
| Propane | Roberts Oxygen | ||
| CTB | List Biological Laboratories | 104 | 1-1.2% |
| Anti-CTB | List Biological Laboratories | 703 | Dilution 1/4000 |
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