The postembedding immunogold method is one of the most effective ways to provide high-resolution analyses of the subcellular localization of specific molecules. Here we describe a protocol to quantitatively analyze glutamate receptors at retinal ribbon synapses.
Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA receptors (NMDARs) and AMPA receptors (AMPARs). Physiological data have indicated that glutamate receptors at RGCs are expressed not only in postsynaptic but also in perisynaptic or extrasynaptic membrane compartments. However, precise anatomical locations for glutamate receptors at RGC synapses have not been determined. Although a high-resolution quantitative analysis of glutamate receptors at central synapses is widely employed, this approach has had only limited success in the retina. We developed a postembedding immunogold method for analysis of membrane receptors, making it possible to estimate the number, density and variability of these receptors at retinal ribbon synapses. Here we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of retinal fixation, 2) freeze-substitution, 3) postembedding immunogold electron microscope (EM) immunocytochemistry and, 4) quantitative visualization of glutamate receptors at ribbon synapses.
Glutamat är den huvudsakliga excitatoriska neurotransmittorn i näthinnan 1. Näthinneganglieceller (RGC), som får glutamaterg synaptisk input från bipolära celler 2, är utgångs nervceller i näthinnan som skickar visuell information till hjärnan. Fysiologiska studier visade att synaptiska excitering av RGC förmedlas postsynaptiskt av NMDA-receptorer (NMDARs) och AMPA-receptorer (AMPARs) 3,4,5. Även excitatoriska postsynaptiska strömmar (EPSCs) i RGC förmedlas av AMPARs och NMDARs 3,5,6,7,8, spontana miniatyr EPSCs (mEPSCs) på RGC uppvisar endast en AMPARs-medierad komponent 4,5,9. Emellertid minskar glutamatupptaget avslöjade en NMDAR komponent i spontana EPSCs 5, vilket tyder på att NMDARs på RGC dendriter kan vara belägna utanför av excitatoriska synapser. Membranassocierade guanylat kinaser (MAGUKs) såsom PSD-95 att klusterneurotransmittorreceptorer, inklusive glutamatreceptorer och jonkanals vid synaptiska platser, även uppvisar tydliga subsynaptic uttrycksmönster 10,11,12,13,14.
Under de senaste decennierna, konfokal immunohistokemi och pre-inbäddning elektronmikroskop (EM) immunohistokemi har använts för att studera membranreceptoruttryck. Även konfokal immunfärgning avslöjar breda mönster av receptoruttryck, gör sin lägre upplösning det omöjligt att använda för att skilja subcellulär plats. Pre-inbäddning EM studier i däggdjur näthinnan visar att NMDAR subenheter finns i postsynaptiska element vid kon bipolär cell band synapser 15,16,17. Detta är i uppenbar kontrast till fysiologiska bevis. Emellertid är diffusionen av reaktionsprodukten ett välkänt artefakt i pre-inbäddning immunoperoxidas-metoden. Därför innebär detta synsätt inte brukar ge statistiskt tillförlitliga uppgifter och kan utesluta åtskillnad mellan lokalisering till synaptiska membranet kontra extrasynaptic membran 18,19,20,21. PåDäremot fysiologiska och anatomiska data överensstämmer med en synaptiska lokalisering av AMPARs på RGC 3,5,7,9,22. Sålunda är glutamatreceptorer och MAGUKs vid retinal band synaps lokaliserade inte bara för att den postsynaptiska utan även för de perisynaptic eller extrasynaptic membran fack. Dock krävs fortfarande en hög upplösning kvantitativ analys av dessa membranproteiner i en retinal band synaps.
Här har vi utvecklat en postembedding EM immunogold teknik för att undersöka subsynaptic lokalisering av NMDAR subenheter, Ampar subenheter och PSD-95 följt av att uppskatta antalet, densiteten och variationen av dessa proteiner vid synapser på råtta RGC märks med koleratoxin subenhet B (CTB) retrograda spårning metoder.
Vi har beskrivit fyra tekniker för framgångsrik kvantitativ efter inbäddning immunogold EM: 1) kort och svag fixering, 2) frys substitution, 3) efter inbäddning immunogold färgning och 4) kvantifiering.
EM immunoguld medger detektion av specifika proteiner i ultratunna vävnadssnitt. Antikroppar märkta med guldpartiklar kan direkt visualiseras med EM. Medan kraftfulla i att detektera subsynaptic lokaliseringen av en membranreceptor, kan EM immunogold vara tekniskt utmanande och kräver…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av Intramural Program för National Institute of neurologiska sjukdomar och stroke (NINDS) och National Institute on Dövhet och andra kommunikationsstörningar (NIDCD), av National Institutes of Health (NIH). Vi tackar NINDS EM anläggningen och NIDCD avancerad bildbehandling kärna (kod # Zic DC 000.081 till 03) för att få hjälp.
Paraformaldehyde | EMS | 15710 | |
Glutarldehyde | EMS | 16019 | |
NaH2PO4 | Sigma | S9638 | |
Na2HPO4 | Sigma | 7782-85-6 | |
CaCl2 | Sigma | C-8106 | |
BSA | Sigma | A-7030 | |
Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
NaOH | Sigma | 221465 | |
NaN3 | JT Baker | V015-05 | |
Glycerol | Gibco BRL | 15514-011 | |
Lowicryl HM 20 | Polysciences | 15924-1 | |
Tris-Base | Fisher | BP151-500 | |
Tris | Fisher | 04997-100 | |
Anti-GluN2A | Millipore | AB1555P | Dilution 1/50 |
Anti-GluN2B | Millipore | AB1557P | Dilution 1/30 |
Anti-GluA2/3 | Millipore | AB1506 | Dilution 1/30 |
Anti-PSD-95 | Millipore | MA1–046 | Dilution 1/100 |
Donkey anti-rabbit IgG-10 nm gold particles | EMS | 25704 | Dilution 1/20 |
Donkey anti-mouse IgG-10 nm gold particles | EMS | 25814 | Dilution 1/20 |
Donkey anti-mouse IgG-5 nm gold particles | EMS | 25812 | Dilution 1/20 |
Donkey anti-goat IgG-18 nm gold particles | Jackson ImmunoResearch | 705-215-147 | Dilution 1/20 |
Formvar-Carbon coated nickel-slot grids. | EMS | FCF2010-Ni | |
Uranyl acetate | EMS | 22400-1 | |
Methanol | EMS | 67-56-1 | |
Lead citrate | Leica | ||
Leica EM AFS | Leica | ||
Leica EM CPC | Leica | ||
Ultromicrotome | Leica | ||
JEOL 1200 EM | JEOL | ||
liquid nitrogen | Roberts Oxygen | ||
Propane | Roberts Oxygen | ||
CTB | List Biological Laboratories | 104 | 1-1.2% |
Anti-CTB | List Biological Laboratories | 703 | Dilution 1/4000 |